PMA-PCR诊断技术研究进展

叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)是一种光反应的DNA结合染料,具有极高的DNA亲和结合能力。PMA可进入死亡和外膜损伤严重的微生物内部,插入DNA结构中,经可见光刺激发生光裂解后,同DNA结合发生共价交联反应,共价交联产物可以抑制DNA的PCR扩增。基于PMA的这一特性,PMAPCR可用于鉴别活死细菌、真菌、病毒等微生物。在实际应用中,PMA-PCR检测结果受样本浊度、活死微生物比例、PMA浓度、暗处理条件(温度、暗处理时间)、曝光条件(光源、光处理时间)、样本处理方法以及目的基因扩增长度等多种因素影响。PMA-PCR已被应用于动植物疫病防控、食品安全、公共卫生等多个领域,具有广阔的应用前景。

非洲猪瘟病毒多重PMA-qPCR检测方法的建立及应用

本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合,建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特异性引物及探针,建立p72、CD2v、MGF110-14L基因的多重qPCR检测方法。结果显示,本研究建立的多重qPCR检测方法具有较强特异性,与其他常见猪病毒性原无交叉反应;同时,该方法具有较高灵敏度,p72、CD2v、MGF110-14L基因的重组质粒标准品最低检出限均为102copies/μL。为弥补qPCR技术不能有效区分样品中活/死病毒的缺陷,本研究将构建的多重qPCR与PMA技术相结合。当加入PMA终浓度为10μg/mL、暗孵育10 min、光照强度40 W、光照15 min时,PMA能够抑制灭活病毒基因的扩增且对活病毒基因的扩增无影响;对比普通qPCR与多重PMA-qPCR的灵敏度可知,两者的灵敏度均为102copies/μL;将多重PMA-qPCR方法用于23份实际样品检测,结果显示,检测活病毒的准确率为100%,说明该方法能有效区分临床样品中具有感染性的ASFV。

一种基于PMA的信道安全设备检测系统设计

装备故障的快速检测和隔离是军队基层保障任务的重要环节,信道安全设备往往存在可测试性设计低、在线测试难、专业依赖度高等问题。为提高信道安全设备测试保障效率,本文采用便携式辅助设备(portable maintenance aid,PMA)+测试模块(thePMAinstrumentpack,PIP)+接口适配模块(interfacetestadapter,ITA)的架构进行检测设备硬件设计,采用分层架构、模块动态加载(field programmable gate array,FPGA)、基于测试引擎重构流程等关键技术进行测试控制软件设计。经验证,该设计很好地解决了信道安全设备故障隔离难、测试效率低、扩展性差等问题。

PMA-LAMP方法检测灭菌乳中金黄色葡萄球菌的研究

近年来,金黄色葡萄球菌引起的食品安全事件频发,这就需要建立一种快速准确地检测食品中金黄色葡萄球菌的方法。传统方法检测食品中金黄色葡萄球菌活菌存在很多缺点。由于细胞死亡后其DNA依然能够存活许久,所以传统方法不能有效区分DNA来自死菌还是活菌。通过荧光染料PMA与快速检测技术LAMP相结合的方法快速、灵敏的检测灭菌乳中金黄色葡萄球菌,并对死/活菌进行区分。根据金黄色葡萄球菌nuc基因设计引物,并对LAMP反应体系及PMA-LAMP方法进行优化,同时优化了灭菌乳中提取DNA的方法。在纯培养的金黄色葡萄球菌中,PMA-LAMP方法检测灵敏度为3.2CFU/mL,PMA-PCR方法的检测灵敏度为3.2×102CFU/mL;对人工污染灭菌乳中的金黄色葡萄球,PMA-LAMP方法检测灵敏度为5×101CFU/mL,而PMA-PCR方法检测灵敏度为5×103CFU/mL。整个反应需要大约6h,说明PMA-LAMP方法检测灭菌乳中金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄球菌活菌的新方法。

金黄色葡萄球菌活的非可培养状态复苏及PMA-qPCR检测

为研究金黄色葡萄球菌活的非可培养(VBNC)状态的复苏问题,采取温度、盐度和酸度3个因素复合诱导制备VBNC菌,尝试四种复苏方法,并以荧光定量PCR和PMA-qPCR技术结合的方法进行检测。结果证明:8%无菌Tween80可以使VBNC状态金黄色葡萄球菌48 h后复苏,同时PMA-qPCR能够有效检出VBNC状态金黄色葡萄球菌,克服传统平板计数法对于VBNC菌的漏检。

单增李斯特菌非可培养状态的诱导与PMA-qPCR检测

在9%(w/v)NaCl条件下,通过温度、pH两种因素诱导一株单增李斯特菌进入"活的非可培养"(viable but non-cuturable,VBNC)状态。通过LIVE/DEAD Baclight活菌检测试剂盒检测细菌总数与活菌数,比较单增李斯特菌状态及数量的差异与变化。结果显示,在2℃、pH6.0条件下单增李斯特菌活菌全部进入VBNC状态。用PMA-qPCR对经诱导的四份菌液进行检测,结果表明该方法能快速、准确地测出死菌背景下的活的单增李斯特菌。

创伤弧菌PMA RTi-PCR检测技术的建立

目的将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时定量聚合酶链式反应(RTi-PCR)技术相结合,建立以一种快速准确的创伤弧菌检测方法。方法以vvh基因作为检测创伤弧菌的靶基因,用PMA对样品基因组提取进行前处理,抑制该DNA分子的RTi-PCR扩增。结果终浓度为3.0mg/L的PMA可有效抑制死细胞(1×108 CFU/mL)DNA的扩增;当PMA浓度小于或等于5.0mg/L时,对创伤弧菌DNA的扩增没有显著的影响;含有不同比例死活细菌的创伤弧菌混合液RTi-PCR结果表明,PMA RTi-PCR能选择性定量创伤弧菌中的活菌。纯培养创伤弧菌活细胞的检测灵敏度检测极限为2.5×101 CFU/mL,并且Ct值与细胞数的对数呈良好的线性关系,相关系数R2值为0.9982。结论 PMA RTi-PCR是一种快速灵敏且能有效鉴别并定量检测病原活细胞的新方法。

灭菌乳中活阪崎肠杆菌PMA-PCR检测方法的建立

本试验旨在建立灭菌乳中活阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的PMA-PCR检测方法。将DNA染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术结合,优化PMA最佳工作浓度和曝光时间,确定PMA-PCR区别死、活阪崎肠杆菌细胞的最佳条件。结果表明,活阪崎肠杆菌经100℃沸水处理20min可完全致死,PMA完全与死阪崎肠杆菌DNA共价交联并光解溶液中游离PMA的最佳曝光时间为15min,完全抑制死阪崎肠杆菌PCR扩增的最小PMA浓度为5μg/mL,不抑制活阪崎肠杆菌PCR扩增的最大PMA浓度为15μg/mL。经PMA处理后,在含有不同比例的死、活阪崎肠杆菌混合液中检测到活阪崎肠杆菌的最低检测限为40CFU/mL,在灭菌乳样品中检测到活阪崎肠杆菌的最低检测限为100CFU/mL。该方法为利用PMA-PCR检测食品中的活阪崎肠杆菌奠定了基础。

便携式维修检测组合(PMA-PIP)系统的设计

便携式维修检测组合PMA-PIP系统平台运用多仪器一体化综合集成技术、交互式电子手册技术等关键技术,进一步综合集成PC104/PXI模块的功能,使测试系统的体积更小、重量更轻、功能更强,从而建立实用的小型化便携式维修检测组合平台,在IETM运行平台上加载运行装备测试流程,通过信号采集-测试-结果处理-测试策略制定-诊断-验证的闭环控制流程,实现在使用现场对武器装备的原位检测和故障诊断,是全军武器装备全寿命维修保障体制的重要组成部分。

PMA在RT-PCR检测药品细菌污染中的应用

建立有效区分死菌、活菌PCR检测方法,用于药品中细菌污染检测。选取金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌,用叠氮溴化丙锭(PMA)前处理,使PMA与死菌DNA分子共价交联,抑制该DNA分子PCR扩增。当PMA浓度大于5μg·mL-1、曝光时间大于5 min时,PMA可抑制细胞膜破裂革兰氏阴性、阳性菌死菌DNAPCR扩增;PMA浓度大于20μg·mL-1时对活菌DNAPCR扩增产生一定影响。经过PMA前处理,能有效抑制死菌DNA扩增,在药品细菌污染PCR检测中有很好应用前景。

PMA-LAMP检测单增李斯特活菌方法的建立

建立一种将荧光染料Propidium Monoazide(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的检测方法,用于高效检测活的单核细胞增多性李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)。利用PMA抑制单增李斯特死菌后进行LAMP扩增实验、并研究了PMA-LAMP方法检测单增李斯特活菌的灵敏度,同时与PMA-PCR方法灵敏度进行比较。结果表明,50μmol/L的PMA处理浓度为5×108cfu/mL单增李斯特死菌,能够完全抑制LAMP扩增。PMA-LAMP方法检测单增李斯特活菌的检出限为4.9×101cfu/mL,其灵敏度是PMA-PCR方法的10倍。该方法可以作为一种快速检测单增李斯特活菌的新技术。

结合图论的供水管网PMA分区方法

供水管网压力分区(PMA)以压力调控为主,兼顾区域计量,可有效地控制城市管网漏失,为此,提出结合图论的PMA分区方法,首先运用自适应AP聚类算法结合经济性计算对供水管网进行初步分区,确定分区数目;然后运用迪杰斯特拉(Dijkstra)算法计算各个聚类中心点到水源的最短路径,确定各个分区的供水管段;建立分区边界优化模型,运用模拟退火算法求解该模型;最后结合人工经验对部分分区进行适当合并,形成最终方案并运用于Y市供水管网实例,取得良好结果.该种分区方法是以计算机算法为主体并结合人工经验,很大程度降低分区的工作量,并且比传统的人工试错分区具有更大的搜索空间,可用于指导实际供水管网的PMA分区.

PMA对Jurkat细胞株中可溶型分泌和膜型TRAIL表达的调节

目的:探讨乙酰肉豆蔻佛波酯(PMA)对Jurkat细胞可溶型TNF相关的凋亡诱导配体(solubletumornecrosisfac tor-relatedapoptosis inducingigand,sTRAIL)分泌和膜型TRAIL(membraneboundTRAIL,mTRAIL)表达的调节,以及二者的细胞毒作用。方法:分别采用ELISA及间接免疫荧光染色和流式细胞术分析,检测sTRAIL的分泌和mTRAIL的表达水平;用4h51Cr释放试验检测sTRAIL和mTRAIL对靶细胞Raji的细胞毒作用。结果:PMA刺激24h后jurkat细胞sTRAIL分泌和mTRAIL的表达均增加,sTRAIL分泌在刺激后48h达峰值,mTRAIL表达峰值在60h。两型TRAIL都具有对Raji细胞的细胞毒作用。结论:PKC活化剂PMA可上调Jurkat细胞sTRAIL分泌和mTRAIL的表达,两型TRAIL分子都具有杀伤靶细胞的细胞毒作用。

不同浓度的PMA和PDTC对星形胶质细胞NF-κB表达的影响

目的探讨不同浓度的PMA和PDTC对星形胶质细胞NF-κB表达的影响。方法按照不同浓度的PMA及PDTC作用对纯化培养的大鼠星形胶质细胞进行分组,各组分别作用不同时间点后,运用免疫细胞化学方法进行NF-κB蛋白表达测定,进行干预因素和蛋白表达结果的相关分析。结果 PMA和PDTC对星形胶质细胞NF-κB的活化和抑制作用呈现剂量与时间依赖性,24h达高峰。结论可采用PMA及PDTC创建星形胶质细胞NF-κB蛋白不同水平表达模型。

穿戴式辅助维修终端系统KD-PMA的设计

穿戴式辅助维修终端系统KD-PMA,其模块分为维修数据层,维修应用层和人机交互层3层。系统硬件包括头盔、背负单元及手持部分。该系统是集成无线局域网接口、条码扫描接口、视音频压缩传输、显示驱动、嵌入式操作系统、交互式电子技术手册、用户认证与通信加密等功能的瘦客户PMA体系。

PMA-qPCR方法用于监测超声波灭菌效率的适用性及其应用

为研究PMA-qPCR方法的适用性问题,本文以超声波制备膜损伤细菌,用PMA-qPCR方法进行检测,并与平板计数的结果进行比较,证明该方法适用于监测超声波法灭菌率的监测。将该方法用于检测不同因素对超声波灭菌效率的影响,表明在温度和超声频率一定的条件下,处理时间和功率对灭菌效率的影响比较明显,而占空比对其影响较小。

FA-PMA-VMD方法及其在齿根裂纹故障诊断中的应用

针对变分模态分解(VMD)中难以确定分解分量个数k和惩罚参数α的问题。提出一种改进的变分模态分解方法—基于萤火虫算法及主模态分析法的变分模态分解(FA-PMA-VMD)方法。该方法用主模态分析(PMA)对VMD分解的带限内禀模态函数(BIMF)分量进行排序;用萤火虫算法对变分模态分解的最佳影响参数[k,α]组合进行搜索,以新提出的正交低峰值作为萤火虫算法的优化目标,得到的最佳的惩罚参数α和分量个数k组合;根据预先设定的故障特征参数自适应地将信号分解为k个BIMF分量。通过对仿真信号和齿轮齿根裂纹实际故障信号进行分析,分析结果表明FA-PMA-VMD具有良好的分解效果。

水通道蛋白5对PMA诱导的原代小鼠气道上皮细胞MUC5AC合成的影响

目的探讨水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)对卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol myristate acetate,PMA)诱导的原代培养小鼠气道上皮细胞MUC5AC合成的影响及可能机制。方法原代培养两种小鼠(AQP5基因敲除鼠和野生鼠)气道上皮细胞,Transwell建立气液平面,2周后扫描电镜及角蛋白免疫组化鉴定气道上皮细胞。蛋白激酶(protein kinase C,PKC)特异性激动剂PMA刺激原代小鼠气道上皮细胞及PKC通路特异性阻断剂Calphostinc阻断该通路,ELISA检测两组小鼠MUC5AC蛋白水平的变化,用Western blot检测小鼠气道上皮细胞PMA刺激后PKC、p-PKC、p-p38、p38、ERK、p-ERK的表达差异。结果气液平面培养后,扫描电镜显示培养的细胞上皮有微绒毛和纤毛覆盖,细胞角蛋白14免疫组化染色为阳性。PMA 20ng/mL刺激24h后,两组小鼠气道上皮细胞分泌的MUC5AC明显升高,AQP5基因敲除鼠增加更显著(P<0.05),两者差异有统计学意义。PKC特异性阻断剂Calphostinc能阻断PMA引起的两组小鼠MUC5AC分泌。原代小鼠气道上皮细胞经PMA刺激后,Western blot检测显示PKC、p38磷酸化激活,ERK通路无变化。结论 AQP5通过PKC-p38信号通路影响黏蛋白MUC5AC的合成和分泌。

PKC激活剂佛波酯PMA和抑制剂Staurosporine对大肠癌HT-29细胞黏附作用的影响

目的 探讨蛋白激酶C(PKC )激活剂佛波酯PMA和PKC抑制剂Staurosporine(SP)对大肠癌HT -2 9细胞黏附作用的影响。方法 采用体外细胞培养观察、细胞黏附人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)测定、Westernblot分析黏附分子E Cadherin(E Cad)、LamininReceptor(LnR)、αCatenin和αCatenin表达等方法,研究PMA和SP对HT- 2 9细胞黏附作用的影响。结果 从体外细胞培养观察和黏附HUVECs实验结果发现,10 0nmol/LPMA处理后,和培养液对照组相比可见HT- 2 9细胞由圆形变成成纤维细胞样生长,细胞发生游走、扩散,HT -2 9细胞间黏附减弱,而对HUVECs的黏附增强(P <0 .0 5 )。而10 0nmol/LPMA和10 0nmol/LSP联合处理HT 2 9细胞,可见细胞成片生长,HT- 2 9细胞间黏附增强,而对HUVECs的黏附则降低(P <0 .0 5 )。Westernblot分析结果提示,培养液对照组细胞可较高水平表达E Cad、LnR ,而低水平表达αCatenin、αCatenin。10 0nmol/LPMA作用细胞可诱导HT- 2 9细胞LnR表达水平增强,而E Cad表达水平轻度减弱,对αCatenin、α- Catenin表达水平无作用。而SP可拮抗PMA的作用,使LnR表达水平降低,E Cad表达水平增强,而对α- Catenin和α- Catenin的表达亦无影响。结论 PKC激活剂佛波酯PMA可促使肿瘤细胞间的同质性黏附能力减弱,与HUVECs间?

PMA诱导THP-1源巨噬细胞的MMP-1表达

目的探讨PMA诱导THP-1源分化成巨噬细胞后不同时间(0、12、24、48、72 h)MMP-1的蛋白和mRNA表达。方法采用佛波醇诱导THP-1细胞分化成巨噬细胞。用酶联免疫吸附实验和逆转录-聚合酶链反应测定不同时间MMP-1蛋白和mR-NA的表达。结果在24 h MMP-1蛋白和mRNA的表达增加(0.545 0±0.008 26,0.048 6±0.010 65;0.118 0±0.013 00,0.091 7±0.008 15;0.190 0±0.001 80,0.165 8±0.784 70;0.142 3±0.116 40,0.127 7±0.009 20;0.095 5±0.002 29,0.054 6±0.022 15;P<0.05,P<0.01)。结论 THP-1细胞分化成巨噬细胞后,在24 h MMP-1蛋白和mRNA表达最高,24 h可能降解斑块胶原纤维最强,促进AS的病变的发生和发展。