大黄酸对LoVo细胞水通道蛋白4表达的调节效应

目的:探讨大黄酸对体外培养LoVo细胞水通道蛋白4(AQP4)的调节效应。方法:体外培养LoVo细胞并予不同浓度大黄酸含药培养液处理24 h及大黄酸含药培养液(20 mg/L)处理不同时间,其中不同浓度分为大黄酸高(40 mg/L)、中(20 mg/L)、低(10 mg/L)剂量组和正常对照组;不同作用时间分为3、6、12、24、48 h组和正常对照组。采用免疫细胞化学方法观察LoVo细胞AQP4蛋白表达定位,采用Western blotting及半定量RT-PCR检测AQP4蛋白及mRNA的表达。结果:AQP4主要表达于LoVo细胞的细胞膜上,在细胞浆也有少量表达。随着大黄酸用药剂量增加,AQP4表达持续下降;大黄酸低剂量组与正常对照组比较,AQP4表达下降但无显著性差异;大黄酸中、高剂量组,AQP4表达则呈显著性下降。在时间效应方面,大黄酸3、6 h组AQP4表达无显著性下降,但在12、24、48 h组则显著下降;同时研究发现,AQP4表达下降的程度与大黄酸剂量及大黄酸作用时间均存在相关性。结论:大黄酸可抑制LoVo细胞AQP4基因转录与翻译,提示大黄酸对AQP4表达的调节可能与大黄的泻下作用有关。

大黄蒽醌衍生物对大鼠结肠及LoVo细胞水通道蛋白4表达的调节效应

目的探讨大黄总蒽醌对SD大鼠的泻下效应及对结肠水通道蛋白4(aquaporin4,AQP4)表达的影响及大黄酸、大黄素对体外培养LoVo细胞AQP4的调节效应。方法雄性SD大鼠24只随机分为正常对照组、大黄总蒽醌泻下剂量组及高剂量组,分别予大黄总蒽醌悬液或蒸馏水灌胃5天,观察大鼠结肠粪便含水量;应用Western blot、RT-PCR方法观察其近端结肠AQP4表达的变化。体外培养LoVo细胞并予不同浓度大黄酸/大黄素含药培养液作用24 h及大黄酸/大黄素含药培养液(20 mg/L)不同时间作用,采用Western blot及RT-PCR检测AQP4蛋白及mRNA的表达。结果大黄总蒽醌泻下剂量组及高剂量组作用后,大鼠结肠内粪便含水量明显增加,同时其近端结肠AQP4表达降低且表现为量效关系。大黄酸/大黄素能够显著下调体外培养LoVo细胞的AQP4蛋白及mRNA表达,且表现为剂量-效应及时间-效应关系。结论大黄总蒽醌在发挥泻下作用的同时,能够有效下调大鼠近端结肠AQP4的表达;大黄酸、大黄素可抑制体外培养Lo- Vo细胞AQP4的表达,可能是大黄泻下作用机制之一。

大黄素对LoVo细胞水通道蛋白2表达的调节效应

目的探讨大黄素对体外培养LoVo细胞水通道蛋白2(aquaporin 2,AQP2)表达的调节效应。方法体外培养LoVo细胞并予不同质量浓度大黄素含药培养液24 h处理及大黄素含药培养液(20 mg/L)不同时间处理,采用免疫细胞化学方法观察LoVo细胞AQP2蛋白表达位置并初步观察AQP2蛋白表达的变化趋势,采用Western blotting及半定量RT-PCR检测AQP2蛋白及mRNA的表达。结果AQP2表达于LoVo细胞的细胞膜,且与大黄素用药浓度及用药时间存在着相关性。进一步的Western blotting证实,不同质量浓度大黄素含药培养液均可抑制AQP2蛋白的表达,药物质量浓度愈大,AQP2蛋白的表达愈低,其中大黄素20 mg/L组及40 mg/L组AQP2蛋白表达显著性降低;大黄素作用3、6 h组,AQP2蛋白表达上升,但与对照组比较,无显著差异;作用12、24、48 h组,AQP2蛋白表达呈进行性下降趋势。半定量RT-PCR结果显示,随着大黄素质量浓度的增加,AQP2 mRNA表达呈进行性下降趋势;在时间-效应方面,随着用药时间的延长,AQP2 mRNA表达呈进行性下降趋势。结论大黄素可抑制LoVo细胞AQP2基因转录与翻译,这提示大黄素对AQP2表达的调节效应可能与大黄的泻下作用有关。

大蒜素对结肠癌LoVo细胞增殖的影响

目的:观察大蒜素对结肠癌细胞LoVo生长、细胞凋亡及细胞周期的影响。方法:不同浓度的大蒜素作用于体外培养的LoVo细胞,倒置显微镜下观察LoVo细胞的形态学变化,采用MTT法检测大蒜素对LoVo细胞增殖抑制能力,An-nexinV-FITC标记流式细胞术检测大蒜素对LoVo细胞的凋亡抑制率,流式细胞术检测大蒜素对LoVo细胞周期影响。结果:大蒜素可抑制人结肠癌LoVo细胞增殖,具有明显量效和时间依赖性,24、48和72h大蒜素抑制LoVo细胞的IC50分别为32.23、10.74和6.58μg/ml;大蒜素能够诱导LoVo细胞凋亡,作用24h其诱导凋亡率随着药物浓度的递增具有增高趋势,作用48h其诱导凋亡作用峰值浓度为8μg/ml,后再继续增加浓度凋亡率反而下降;大蒜素作用LoVo细胞24h后,大蒜素浓度低于4μg/ml时,LoVo细胞周期被阻滞于G2/M;而高于4μg/ml时,细胞周期被阻滞于G2/M和G1期。结论:大蒜素能够诱导LoVo细胞凋亡,阻滞细胞周期,抑制细胞增殖。

LHRH-PE40对LOVO细胞的靶向杀伤作用

目的研究LHRH-PE40对LOVO细胞的靶向杀伤作用。方法用XTT检测LHRH-PE40对LOVO细胞的体外细胞毒性。将LOVO细胞移植于裸鼠,测定静脉注射LHRH-PE40对体内肿瘤细胞生长的抑制作用。结果LHRH-PE40对LOVO细胞细胞毒作用的半数抑制浓度为2·103μg/ml,在裸鼠肿瘤模型中,LHRH-PE40剂量为150μg/kg时抑瘤率为68·49%,这种细胞毒性作用可以被LHRH(或LHRH类似物)特异性抑制。结论在体内外LHRH-PE40对LOVO细胞具有很强的细胞毒作用,其机制是LHRH-PE40通过与癌细胞膜上的LHRH受体特异结合发挥细胞杀伤作用。

反义DLC-1基因对结直肠癌LoVo细胞增殖和细胞周期的影响

目的应用核糖核酸干扰(RNAi)技术,通过对大肠癌细胞株LoVo中DLC-1基因mRNA表达的抑制,初步探讨DLC-1基因对大肠癌细胞株的生物学行为影响。方法构建DCL-1的RNAi重组体pGCsiDLC,转染大肠癌LoVo细胞株。采用RT-PCR观察转染前后细胞株中DLC-1 mRNA以及Bax、Bcl-2基因表达的改变,MTT比色法检测转染前后细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建发卡siRNA真核表达载体pGCsiDLC;pGCsiDLC转染LoVo细胞后,电泳显示DLC-1 mRNA表达水平明显下降;LoVo细胞生长曲线增长幅度亦随时间的增加而逐渐增高,在48h最为明显,RNAi组细胞比脂质体组及空白对照组细胞增殖明显增高(P<0.05);干扰后的LoVo细胞株G0/G1期发生阻滞,而G2/M期细胞数量分布减少。而Bax和bcl-2基因表达在干扰前后未见明显改变。结论成功构建载体介导的DLC-1靶向RNAi重组体可有效抑制LoVo细胞DLC-1 mRNA表达;DLC-1基因可抑制结直肠癌细胞增殖并且对细胞周期重新分布,其可能与结直肠癌的发生发展有一定关系,可能是一个新的抑癌基因。

大黄酚对LoVo细胞AQP2表达的调节效应

目的:探讨大黄酚对体外培养LoVo细胞AQP2表达的调节效应.方法:体外培养LoVo细胞,随机分为对照组,大黄酚10,20,40mg/L不同浓度组.间接免疫荧光定性LoVo细胞AQP2表达,WesternBlot、半定量RT-PCR检测药物处理24h后AQP2蛋白及mRNA表达.体外培养LoVo细胞后,随机又将细胞分为对照组,大黄酚40mg/L组,PKA激动剂8-Bromo-cAMP10mg/L组,大黄酚40mg/L+PKA激动剂8-Bro-mo-cAMP10mg/L组.非放射性法检测药物处理24h后LoVo细胞PKA的活性水平.结果:AQP2表达于LoVo细胞膜,药物处理24h后,大黄酚20,40mg/L组AQP2蛋白分别为(0.64±0.08),(0.46±0.09)显著低于对照组(0.83±0.05),(P<0.01);AQP2mRNA分别为(0.50±0.12),(0.39±0.09),显著低于对照组(0.73±0.08),(P<0.01).40mg/L大黄酚组PKA活性(0.54±0.08)显著低于对照组(0.78±0.10),(P<0.05).结论:大黄酚可抑制LoVo细胞AQP2基因转录与翻译.大黄酚对AQP2表达的调节效应可能与大黄泻下作用有关,其可能是通过PKA信号通路调节AQP2的表达.

Serrin B和Nodosin对HL60、SGC7901、LOVO、U87、AGZY细胞株的毒性作用

目的探讨天然药物Serrin B和Nodosin对人早幼粒白血病细胞株HL60、人胃腺癌细胞株SGC7901、人结肠癌细胞株LOVO、人胶质瘤细胞株U87、人肺腺癌细胞株AGZY的毒性作用。方法将对数期生长的HL60、SGC7901、LOVO、U87、AGZY细胞株接种于96孔板中,细胞贴壁后,分别加入Serrin B或Nodosin,使药物的终浓度分别为0.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μmol.L-1,24 h后用四甲基偶氮唑盐法检测细胞株的死亡率。结果 Serrin B对HL60、SGC7901、LOVO、U87和AGZY细胞株均有较强的毒性作用(P<0.01),且其毒性作用呈现剂量-效应关系。Nodosin对HL60、SGC7901、LOVO、U87细胞株具有较强的毒性作用(P<0.05,P<0.01),而对AGZY细胞株无明显毒性作用。结论 Serrin B和Nodosin是中药溪黄草抗癌作用的有效成分,为人类多种肿瘤治疗的新药研究开发提供新的思路。

转酮醇酶1在人结肠癌细胞株LoVo增殖中的作用

目的探讨转酮醇酶1(TKTL1)在体外培养的人类结肠癌细胞株(LoVo)生长增殖中的作用。方法构建针对TKTL1 mRNA的小干扰RNA(siRNA)质粒,将该质粒转染LoVo细胞;采用实时定量RT-PCR检测转染前后LoVo细胞转酮醇酶基因家族中转酮醇酶(TKT)、TKTL1、转酮醇酶2(TKTL2)mRNA表达水平的变化,通过流式细胞术和MTT法检测转染前后LoVo细胞周期和细胞增殖的改变。结果转染组(携带有pEGFP-C1-U6/TKTL1)、质粒对照组(携带有pEGFP-C1-U6/UC)和未转染组(未转染细胞)中TKT和TKTL2 mRNA的表达水平差异无显著性意义(P>0.05)。转染组细胞中TKTL1的表达水平与质粒对照组和未转染组相比,明显下调,且转染组LoVo细胞总转酮醇酶活性明显下降,细胞增殖明显被抑制,LoVo细胞被阻滞在G0/G1期。结论TKTL1在人类结肠癌细胞(LoVo细胞系)的生长增殖中起重要作用,TKTL1可能成为肿瘤治疗的新靶点。

LoVo细胞系中结肠癌干细胞样细胞的分离、培养及鉴定

目的:从结肠癌LoVo细胞系中分离、鉴定具有CD44+/EPCAMhigh特异表型的结肠癌干细胞样细胞,观察其生物学行为,证实该细胞系中结肠癌干细胞样细胞的存在。方法:从普通血清培养的LoVo细胞系中以流式细胞仪分选具有CD44+/EPCAMhigh表型的细胞,接种于添加生长因子的无血清培养基中,观察其增殖过程,继而诱导分化。MTT法、流式细胞术检测CD44+/EPCAMhigh、EPCAMlow和未分选LoVo细胞的增殖能力及细胞周期分布。3种细胞接种裸鼠,比较不同细胞的成瘤率;免疫荧光技术检测小鼠次代CD44+/EPCAMhigh细胞中CD44/EPCAM的表达。结果:LoVo细胞中有17.4%的CD44+/EPCAMhigh细胞,并能在添加生长因子的无血清培养基中呈细胞球样生长,且可连续传代;在血清的诱导下,呈贴壁分化生长,其形态与未分选LoVo细胞无差别。CD44+/EPCAMhigh细胞增殖能力高于EPCAMlow细胞及未分选LoVo细胞,且细胞周期多集中在G0/G1期。以500个CD44+/EPCAMhigh细胞接种裸鼠成瘤率为90%(9/10),而1×104个EPCAMlow细胞成瘤率为0(0/10)。小鼠移植瘤中次代CD44+/EPCAMhigh细胞仍能少量表达CD44和EPCAM。结论:LoVo细胞中存在CD44+/EPCAMhigh结肠癌干细胞样细胞,CD44+/EPCAMhigh可用于结肠癌肿瘤干细胞的深入研究。

锌-α2-糖蛋白对结直肠癌细胞株LoVo生物学行为的影响

目的:初步探讨锌-α2-糖蛋白(ZAG)对结直肠癌细胞LoVo的生物学行为的影响。方法:构建和应用ZAG过表达质粒pGCMV/EGFP/Neo/ZAG转染结直肠癌细胞LoVo,免疫组化检测ZAG的表达变化,MTT法检测转染前后细胞增殖能力的变化以及细胞的克隆形成能力和侵袭力的改变。结果:过表达质粒pGCMV/EGFP/Neo/ZAG可成功诱导结直肠癌细胞LoVo表达ZAG,同时其细胞增殖力受到抑制、克隆形成率降低以及细胞的侵袭能力明显降低。结论:结直肠癌细胞LoVo的生物学行为的改变可能与ZAG的过表达相关,其在结直肠癌的发生发展过程发挥抑癌的生物学效应。

高表达p55PIK细胞株的建立及其对结肠癌LoVo细胞周期的影响

目的构建p55PIK高表达的质粒,筛选稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系,检测其对LoVo细胞周期的影响。方法以基因组cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,通过限制性核酸内切酶进行酶切,T4DNA连接酶将目的片段插入pcDNA3.1质粒中;将携带p55PIK基因的pcDNA3.1质粒转染LoVo细胞,加入适量的G418筛选(500μg/mL),并通过实时定量PCR(qPCR)和Western blot方法检测p55PIK mRNA水平和蛋白水平,进一步通过BrdU/PI掺入法检测p55PIK对LoVo细胞周期和DNA合成的影响。结果成功构建了p55PIK高表达的质粒,并筛选出稳定高表达p55PIK的LoVo细胞系;在LoVo细胞中高表达p55PIK能够促进细胞S期的进程和DNA的合成。结论成功构建了pcDNA3.1-p55PIK质粒,并筛选出p55PIK稳定高表达的LoVo细胞系,高表达p55PIK能够促进LoVo细胞S期的进程和DNA的合成。

伊立替康、奥沙利铂及氟尿嘧啶对人大肠癌LoVo细胞株作用的实验研究

目的:研究国产盐酸伊立替康(CPT-11)、奥沙利铂(L-OHP)及氟尿嘧啶(5-FU)对人大肠癌细胞株LoVo的生长抑制作用。方法:采用MTT法观察上述药物单药应用、两药及三药同时或序贯联合应用对大肠癌LoVo细胞生长的影响,评价药物联合应用的效果。结果:单药应用、两药联合及三药联合应用均对大肠癌LoVo细胞有显著的抑制作用(P<0.05);两药联合应用均优于各自单药的抑制效果,CPT-11联合L-OHP弱于CPT-11或L-OHP与5-FU联合的抑制效果(P<0.05),由L-OHP到CPT-11小剂量序贯联合具有明显的协同作用;三药联合应用的抑制效果显著优于两药联合(P<0.05),由5-FU+L-OHP到5-FU+CPT-11的序贯联合应用与三药同步联合应用无显著性差异(P>0.05),但由5-FU+CPT-11到5-FU+L-OHP序贯应用时明显低于三药同步应用的效果(P<0.05),且三药全量及半量联合应用效果差异无显著性(P>0.05)。结论:由5-FU+L-OHP到5-FU+CPT-11的小剂量序贯联合应用具有高效协同抑制大肠癌细胞株LoVo的作用,可为临床难治性和复发性大肠癌患者的化疗及小剂量序贯化疗提供参考。

菝葜皂苷元对结肠癌细胞Lovo黏附和侵袭能力的影响

目的:本研究旨在探讨菝葜皂苷元体外对人结肠癌细胞Lovo增殖、黏附、侵袭的影响。方法:采用MTT法、黏附实验、Transwell小室侵袭实验,观察菝葜皂苷元对人结肠癌细胞Lovo增殖、黏附和侵袭能力的影响。结果:①菝葜皂苷元有抑制人结肠癌细胞Lovo增殖的作用,与对照组比较,随着药物浓度的增大,其对细胞的抑制率也明显增大(P<0.01)。②菝葜皂苷元作用人结肠癌细胞Lovo后,细胞的黏附能力明显降低(P<0.01)。③菝葜皂苷元作用人结肠癌细胞Lovo 24h后,侵袭的细胞数较对照组明显减少(P<0.01)。结论:菝葜皂苷元对人结肠癌细胞Lovo的增殖具有抑制作用;菝葜皂苷元能抑制人结肠癌细胞Lovo的黏附能力和侵袭能力。

结肠癌耐药细胞株LoVo/5-Fu中microRNA表达的初步研究

目的建立结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU并初步筛选可能的耐药相关的microRNA。方法采用5-FU浓度递增法建立人结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU,观察其生长规律并绘制细胞生长曲线;用MTT法鉴定耐药细胞株耐药性并计算耐药指数(RI);用microRNA芯片技术检测耐药细胞株LoVo/5-FU与其亲本细胞株LoVo中mi-croRNA的表达谱,筛选差异表达的microRNA;用实时荧光定量PCR方法对筛选出的部分差异microRNA在耐药细胞及其亲本细胞中的表达情况进行验证。结果 LoVo/5-FU细胞与LoVo细胞相比,生长缓慢,细胞体积增大,耐药株LoVo/5-FU细胞相对于其亲本LoVo细胞的耐药倍数为8.08。microRNA芯片的结果显示,耐药株LoVo/5-FU细胞与亲本LoVo细胞比较,有10个microRNA表达上调,13个microRNA表达下调;实时荧光定量pcr的结果进一步证实mir-210、mir196a、mir-1281在LoVo/5-FU中显著上调,而let-7f、mir-1228显著下调,其中mir-210在LoVo/5-FU与LoVo中的表达有明显差异。结论 LoVo/5-FU细胞株耐药性稳定,筛选获得的差异miRNA可能通过调控其靶基因而参与人结肠癌细胞对5-Fu的耐药,为进一步研究microRNA在结肠癌耐药机制中的作用奠定基础。

CXCR3B在结肠癌组织中的表达及对结肠癌LOVO细胞株迁移能力的影响

目的探讨趋化因子受体CXCR3B(CXC型趋化因子受体3变体B)在结肠癌组织中的表达及对结肠癌LOVO细胞株迁移能力的影响。方法常规收取结直肠癌及癌旁组织标本,用免疫组织化学(IHC)染色方法检测CXCR3B的表达;实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测正常肠上皮细胞株NCM460及结肠癌细胞株LOVO中的CXCR3B m RNA表达,过表达CXCR3B-RFP慢病毒感染LOVO细胞株,划痕实验及transwell实验检测LOVO细胞株的迁移变化。结果免疫组织化学结果显示在结直肠癌旁组织中CXCR3B的表达显著高于癌组织(P<0.001);NCM460细胞中CXCR3B m RNA表达高于LOVO细胞表达(P<0.01)。划痕实验及transwell迁移实验显示过表达CXCR3B组(LOVO-CXCR3B)细胞迁移较阴性对照组(LOVO-NC)低(P<0.01)。结论人结直肠癌组织中CXCR3B低表达,过表达CXCR3B可抑制结肠癌细胞株LOVO的迁移。

大黄素通过ROS介导大肠癌细胞株LOVO凋亡的实验研究

目的观察大黄素对人大肠癌细胞株LOVO凋亡的影响,并探讨活性氧(ROS)是否介导了大黄素诱导细胞凋亡的过程。方法体外分组培养人大肠癌细胞株LOVO,设空白对照组和大黄素3个不同浓度干预组(40,80,120μmol.L-)1,大黄素干预时间分别为12,24,48 h。以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖率、AnnexinⅤ-FITC和PI双染流式细胞术检测凋亡,激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内ROS水平,Western印迹法检测caspase-3表达。结果与空白对照组比较,大黄素干预组呈浓度依赖性诱导大肠癌细胞株LOVO凋亡,细胞内ROS水平明显增加,caspase-3的表达明显上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论大黄素通过ROS介导线粒体凋亡信号通路诱导大肠癌细胞凋亡,可能是大肠癌细胞凋亡诱导途径之一。

扶正抑癌方含药血清对结肠癌Lovo细胞TGF-/Smad信号转导通路的影响及意义

目的通过观察扶正抑癌方含药血清对结肠癌Lovo细胞TGF-β/smad信号转导通路中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表达的影响,明确扶正抑癌方抑制结肠癌细胞间质化转变的作用机制。方法 Lovo细胞体外培养,制备大鼠不同浓度含药血清后,MTT法测定不同浓度含药血清对细胞增殖的影响,以5-Fu作为阳性对照;通过Western blot检测TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白的表达。结果大剂量含药血清组24 h对Lovo细胞抑制率较中剂量、小剂量组作用更加明显,差异具有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测结果表明扶正抑癌方含药血清可以下调Lovo细胞TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表达,与正常组和空白组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论扶正抑癌方含药血清可能通过下调TGF-β/smad信号转导通路中TGF-β1、Smad3和p-Smad3的蛋白表达,抑制Lo-vo细胞间质化转变。

六磷酸肌醇对人结肠腺癌LoVo细胞增殖分化影响

目的 观察六磷酸肌醇 (IP6)对人结肠腺癌细胞株LoVo体外增殖、分化的影响。方法 直接细胞记数法、MTT法、平皿集落形成实验、肠型ALP比活性测定等方法观察LoVo细胞增殖、分化特性。结果 与对照组相比 ,IP6处理组在 6h后细胞增殖与集落形成能力呈现抑制状态 ,并呈时间、剂量依赖关系。分化标志酶ALP比活性增高。结论 IP6对LoVo细胞具有细胞毒作用 ,能明显抑制细胞增殖。

大肠癌细胞系Lovo中亚群(SP)细胞的分离培养和鉴定

目的:应用无血清培养液(SFM)培养Lovo细胞系,克隆分离具有干细胞样特性SP细胞.方法:应用SFM培养Lovo细胞,分离成球样生长的细胞群作为SP细胞,并通过有限稀释,分化,自我更新,含血清培养基(SSM)和SFM交替培养及Musashi-1化学染色方法来鉴定SP细胞.结果:Lovo细胞中约含有0.54%-0.62%的SP能够在无血清培养基中能够存活、增殖,形成悬浮的肿瘤细胞球;在SFM中加入血清可促使SP细胞分化;SP细胞可以连续传代,并可交替培养于SSM和SFM中,细胞形态无明显变化;SP细胞Musashi-1染色阳性.结论:应用SFM可从Lovo细胞中分离出极少量的具有干细胞特性的SP细胞.