一种可用于OBI检测的高灵敏度核酸提取方法的建立与验证

目的 建立和验证1种可用于隐匿性HBV感染(OBI)检测的大体积高灵敏度核酸提取方法,并将其应用于低病毒载量OBI标本的定量检测。方法 参考罗氏核酸检测试剂盒核酸提取方法,建立1种大体积核酸提取方法。将HBV标准品分别配置成10 000 IU/mL、1 000 IU/mL、100 IU/mL、10 IU/mL和1 IU/mL浓度,采用磁珠法从10 mL相应浓度的标准品中提取核酸,采用荧光定量PCR法检测各浓度的CT值,每个浓度梯度进行平行双份检测,以病毒浓度的对数为X轴,2次检测CT值的平均值为Y轴,构建荧光定量标准曲线和回归方程。通过3次重复实验验证该方法的稳定性。应用本方法提取低病毒载量OBI标本核酸并进行荧光定量。结果 3次HBV病毒荧光定量标准曲线扩增效率(E)均在90%~105%,回归方程(R2)均>0.99。不同浓度标准品CT值的变异系数(CV)分别为0.63%、0.78%、1.52%、1.36%和0.78%。本方法可以提取出病毒载量低至1 IU/mL的OBI标本核酸并进行定量。结论 本方法HBV核酸定量检测系统检测下限可达1 IU/mL,并且具有较强稳定性和灵敏度,可用于低病毒载量OBI的定量检测。

批分析(多管同测)法检测低浓度新型冠状病毒核酸

目的探讨批分析(多管同测)法实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸的临床意义。方法用细胞保存液将SARS-CoV-2全基因组假病毒质控品阶梯稀释形成S1(1∶10)、S2(1∶20)、S3(1∶40)、S4(1∶80)、S5(1∶160)、S6(1∶320)、S7(1∶640)系列梯度浓度样本盘,用SARS-CoV-2核酸实时荧光PCR检测试剂检测样本盘样本,每批各浓度平行检测6管,共检测6批次。结果ORF1ab单管阳性检出率与批分析阳性检出率分别为S1(50.00%/100.00%)、S2(47.22%/100.00%)、S3(16.67%/66.67%)、S4(13.89%/66.67%);N基因单管阳性检出率与批分析阳性检出率分别为S1(100.00%/100.00%)、S2(91.67%/100.00%)、S3(61.11%/100.00%)、S4(30.56%/83.33%)、S5(27.78%/100.00%)、S6(11.11%/50.00%)、S7(5.55%/33.33%)。结论批分析(多管同测)法可以提高低浓度核酸样本的阳性检出率,在临床有提高检测灵敏度需求时可以采用此方法。

快速核酸检测仪温度校准装置研制

新冠病毒的全球蔓延,催生快速核酸检测仪的发展,从而提出快速核酸检测仪的计量校准需求。温度控制在快速核酸检测仪的基因扩增过程中起着关键作用,由于其升降温速度快,比常规的PCR仪对温度的控制要求更高,从而对其温度参数的计量校准提出新的要求。该文通过对目前市上使用较多的两种试剂孔结构的快速核酸检测仪模型仿真,采用高精度温度传感器,通过低功耗高速数模转换设计、模块对接与协同集成、数据存储与保护设计、供电系统与能耗分配优化、无线传输模块设计与接口调试,成功研制锥形孔型和扁平孔型无线温度采集器,能独立完成温度数据采集、ADC转换和无线传输的功能。通过PC专用校准软件开发实现对实时荧光PCR快速核酸检测仪温度参数的校准。校准装置经计量检测和试验验证,温度测量最大允许误差为±0.1℃,最高采集频率为10Hz,满足快速核酸检测仪校准的要求。

低浓度HIV窗口期标本的检测——附1例报告

目的利用血清学和分子生物学方法,确认1例低浓度HIV RNA窗口期献血者的感染状态。方法使用酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印记试验(WB),以及定性、定量核酸检测(NAT)方法,对低浓度HIV RNA窗口期献血者不同时期的血液标本进行检测。在定量NAT检测无法检出的情况下,采用probit分析方法,估算该献血者初次献血时血液中病毒载量。结果献血者首次献血标本检测结果为血清学ELISA检测阴性,核酸定性试验为反应性,随后进行的核酸定量试验和血清学抗体确认试验,二者结果均为阴性。对随访后的标本进行的血清学和核酸检测的结果均为阳性,确认为血清学转阳。采用probit分析方法估算出该献血者初次献血时血液中HIV病毒载量约为9.3 IU/m L。结论该献血者是1例病毒载量极低的HIV窗口期献血者。对于低浓度的HIV窗口期标本,不同核酸检测模式的检测能力有所不同。

基于流式细胞特性的LNA和HNA细菌相关性研究

采用流式细胞技术分析了7种不同陆地环境介质中LNA和HNA细菌的浓度变化及流式细胞特性特征.结果显示,在水体和土壤等环境中都存在LNA和HNA细菌的分类,其中,土壤环境中LNA细菌浓度（107~108cells/g数量级）高于水环境中浓度（105~106cells/m L数量级）,但其相对比重（29.80%~33.94%）低于水环境（除地下水外,21.60%）中LNA细菌（42.25%~65.92%）,主成分分析（PCA）显示水体和土壤环境介质中LNA和HNA流式细胞参数具有明显差异;相关分析表明,LNA与HNA细菌的流式细胞参数（绿色荧光信号FL1和侧向散色信号SSC）之间具有显著相关性（FL1：R2=0.711,P〈0.01,SSC：R2=0.762,P〈0.01）,在不同生态系统中SSC变异大于FL1变异.结果表明,LNA和HNA细菌之间既不是各自对应的某一特殊生理阶段细菌,也不是两个完全相互独立的细菌群体,而是具有特殊共变关系的细菌.

卡介菌多糖核酸注射液对继发性暂时性免疫功能低下儿童的调节作用

目的观察卡介菌多糖核酸注射液对继发性暂时性免疫功能低下儿童的调节作用。方法选择临床上反复呼吸道感染的儿童,检测T细胞亚群和免疫球蛋白,以其中至少一项指标低于同年龄段正常值最低限的52名为观察对象,给予卡介菌多糖核酸注射液治疗,疗程3个月。3个月后复查T细胞亚群和免疫球蛋白。结果治疗后细胞免疫和体液免疫均得到不同程度的改善,治疗前后各项指标相比,差异均有非常显著或显著意义。结论卡介菌多糖核酸注射液对反复呼吸道感染所致免疫功能低下儿童疗效确切。

高灵敏度real-time PCR在低病毒载量病毒性肝病中的临床应用价值

目的 评估高灵敏度实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)在病毒性肝病病毒核酸定量检测中的临床应用价值,为该方法的普及应用提供依据.方法 收集2016年1月~2018年12月于湖北省中医院(以下简称“我院”)就诊的病毒性肝病患者895例,同期选取我院100名健康体检者作为对照组.分别应用常规方法和高灵敏度real-time PCR方法检测血清病毒核酸载量,比较两种方法检测结果的差异.对其中低病毒载量患者的生物化学指标、免疫学指标、凝血国际标准化比值(INR)和肝纤维化FIB-4指数的变化趋势、特点及其与病毒核酸载量的相关性进行统计分析.结果 受检人群中低病毒载量患者呈高比例分布.高灵敏度real-time PCR方法检测HBV DNA的阳性率远高于常规方法(P<0.05),而对于HCV RNA,两种方法检测结果的一致性较好.低病毒载量患者的多项生物化学指标波动并不明显,且多项生物化学指标与病毒核酸载量无相关性(P>0.05).大部分低病毒载量乙肝患者表现为HBeAg阴性的低水平复制状态.免疫学诊断指标与病毒核酸载量间存在不同程度的不一致和弱关联度.低病毒载量患者的凝血INR和肝纤维化FIB-4指数均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但其与病毒核酸载量无相关性(P>0.05).结论 高灵敏度real-time PCR方法对病毒核酸载量的检测具有不可比拟的优势,结合其他的诊断指标,其可在低拷贝病毒性肝病的病程管理中发挥不可替代的重要作用.

内源激素和核酸与紫苏花芽生理分化关系

在干旱和弱光两种抑花处理条件下 ,对紫苏花芽生理分化期叶内核酸、内源激素含量变化进行了研究。结果显示

低分子肽/核酸衍生物/氨基酸/糖脂等与糖代谢

低分子肽/核酸衍生物/氨基酸/糖脂(LNAG,商品名:爱维治)是一种改善细胞能量代谢的药物,主要表现为改善糖的代谢。因它具有胰岛素样活性、能促进葡萄糖的摄取、增强了葡萄糖代谢酶的活性、抑制乳酸合成等作用。LNAG最初主要用于老年性痴呆的治疗,近年来其适应证在不断扩大。

低温对玉米幼苗叶片中核酸含量和核酸酶活力的影响

耐冷性明显不同的两个玉米自交系幼苗在4℃低温处理期间,叶片中的核酸含量随处理时间延长而减少.RNA减少量比DNA明显.核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶活力随处理时间延长而增强.可溶性蛋白质含量的变化趋势是先增加,后减少.两个自交系相比,上述指标均是耐冷性弱的自交系比耐冷性强的自交系变化明显.

中温淡盐法制备低核酸酵母抽提物的工艺研究

通过建立一种新的酵母核酸中温淡盐去除法,成功研制出品质优良的低核酸酵母抽提物。工艺简单,处理时间短,温度不超过70℃,可避免高温对酵母营养物质的破坏;该法氯化钠用量少,无需脱盐处理,易产业化及应用推广;研究制备的酵母抽提物,核酸去除量达70%以上,色浅、肉香味鲜,适合食品加工。同时,附加得到高提取率、高纯度的核酸。中温淡盐法去除酵母核酸的技术,扩展了酵母制品的应用领域,更为尿酸偏高及痛风人群食用安全营养的酵母食品提供了解决方案。

一种低成本血液HIV病毒核酸筛查系统的开发和应用

目的开发一种低成本,有效和方便快捷的血源筛查核酸检测系统。方法利用临床上使用的HIV-1核酸定量检测试剂,用酶免实验用的加样器对血液标本进行混样和核酸提取。结果使用常规方法和加样器改进方法的检测有效性没有差异,经过加样器改进的方法检测速度快,比常规手工方法劳动强度大大降低。结论低成本血液HIV病毒核酸筛查系统,成本低,效率高,可以有效提高血液的安全性。

利用侧流核酸试纸条快速检测非洲猪瘟病毒

为满足基层普通实验室或养殖场等资源有限的实验室对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的检测需求,该研究开发了一种简单、快速、低成本的检测技术,可以用肉眼观察检测结果。研究将传统聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)与胶体金试纸条技术结合,开发一种低成本的侧流核酸测定试纸条(lateral flow nucleic acid assay,LFNAA)。该体系设计了独特的尾引物,避免了传统核酸试纸条的半抗原标记及抗体的使用。经过PCR扩增后产生一端带着单链寡核苷酸尾巴的双链DNA产物,能够与胶体金标记的寡核苷酸捕获探针结合,从而在试纸条上形成可以用肉眼观察的目标产物。该LFNAA试纸条能够在猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CFSV)、猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒1型(Porcine circovirus 1,PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus virus,PPV)中特异的鉴定出ASFV的存在,其灵敏度与琼脂糖凝胶电泳的分析结果一致,均能达到103 copies/μL。因此,仅需要一台普通PCR仪,即可对ASFV进行快速灵敏的鉴定(<2 h),其低成本、操作简便的特点非常适合资源有限的实验室中非专业人员的操作。此外,该技术可进一步结合等温扩增技术,能够在食品安全和医学诊断中实现更快更简便的现场检测。

水环境中微小细菌的分布及生态作用研究进展

由于微生物本身的生理特性及现有检测方法的限制,自然界中大部分细菌不能被传统微生物工具所观察,这类微小细菌被称之为"看不见的主体(Unseen majority,USM)",在大多数天然水环境中营养物浓度较低,微小细菌(USM)占有主导优势,具有重要的生态作用。但是,微小细菌对传统富营养培养基比较敏感,且生物体积微小(小于0.1μm3),难以被传统培养基所检测分离,人们对其认识仍然很局限。总结关于微小细菌的一些特性概念,概括微小细菌的检测和培养方法及在水环境中的分布情况,进一步讨论其生态作用及应用,最后对微小细菌的生理及其在水质评价中的应用等方面进行展望。

3种淡水环境中低核酸含量细菌的滤过性

【目的】增加低核酸含量(LNA)细菌与过滤性细菌之间的认识。【方法】采用流式细胞技术(FCM)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)及统计学分析研究3种典型淡水环境中细菌群落与滤过性。【结果】LNA细菌与过滤性细菌在数量上具有很好的相关性(y=0.646x+22.42,R2=0.984,P<0.01),细菌的滤过性不仅与细菌大小有关,还与细胞整体形状及其伸缩性有关;细菌群落组织与LNA细菌比重呈负相关性,而与HNA细菌呈正相关性。【结论】0.45μm膜过滤对水样微生物群落中的LNA细菌具有极强的筛选效果;细菌群落组织与其基于流式细胞技术测定的基因含量具有密切联系。

LNA和HNA细菌在反硝化过程中的迁移特征分析

低核酸(low nucleic acid,LNA)和高核酸(high nucleic acid,HNA)细菌在不同环境条件下表现出不同特性,当前尚不清楚反硝化过程对细菌的影响。为此,通过对不同反硝化条件下游离态的LNA和HNA细菌沿程变化情况及相关细菌群基因测序分析,发现游离菌在反硝化过程中会快速增多,且反硝化速率越大,增速越高。结果显示:反硝化时LNA细菌比HNA细菌更快脱离污泥絮体,只有在反硝化达到一定程度,使絮体结构疏松甚至破碎时HNA细菌才会表现出快速增多,由此推测低核酸(LNA)细菌位于污泥表面或者填充于絮体之间,而高核酸(HNA)细菌是污泥絮体的骨架部分。淀粉在反硝化时会因其网捕作用使游离菌减少,但乙酸钠的反硝化作用比淀粉的网捕作用对游离菌的影响更为显著。同时HNA细菌具有较高的丰度和多样性,是主要功能菌,而LNA细菌对反硝化反应能做出更快的响应,可作为反硝化启动的指示参数。

高敏乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸定量检测在低病毒载量患者治疗监测中的应用

目的对高敏乙型肝炎(乙肝)病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)定量检测进行方法学评价,并探讨该方法在低病毒载量的乙肝患者治疗监测中的应用价值。方法采用全自动核酸提纯及荧光聚合酶链式反应分析系统检测HBV DNA,评价该方法的线性范围、精密度、最低定量检测限、防污染能力和最低检测限等性能指标,采用电化学发光法检测HBV血清学标志物和全自动生化仪检测丙氨酸氨基转移酶(ALT),并分析两者之间的相互关系。结果高敏HBV DNA定量检测方法的线性范围为50~5.0×10~8 IU/ml,最低定量检测限为50 IU/ml,批内精密度与批间精密度均<5%,最低检测限为20 IU/ml,防污染能力强。在抗病毒治疗的中,HBV DNA载量<500 IU/ml的乙肝患者占总数的46.40%;HBVDNA载量为30~500 IU/ml的HBeAg阳性或阴性患者的ALT异常率明显高于HBV DNA载量<30 IU/ml的患者(P=0.012、0.001),但不同HBV DNA载量与两对半血清学模式差异无统计学意义(P=0.179)。结论基于全自动核酸提纯及荧光PCR分析系统的高敏HBV DNA定量检测方法各性能指标良好,适于低病毒载量的乙肝患者治疗监测,临床应加强该类乙肝患者的治疗监测。

无偿献血者HBsAg阴性HBV DNA阳性标本的病毒载量及基因型分析

目的分析邯郸地区核酸检测无偿献血者低病毒载量HBV DNA标本的血清学及基因型情况。方法选取邯郸市中心血站2020年1—8月乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阴性或单试剂阳性合并华益美核酸检测(nucleic acid testing,NAT)阳性的献血者标本,经罗氏核酸定性检测为HBV DNA阳性的标本,对其进行化学发光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay,CLIA)、核酸定量及基因型测序试验,并对其血清学及基因型进行分析。结果77351份献血者标本中,定性检测HBV DNA阳性28份,核酸定量检测数值<5~1371.00 IU/ml,其中25份<100 IU/ml,占89.29%。基因型分布:C型18份,占64.29%;B型5份,占17.86%;未定型5份,占17.86%。6份血清学检测全阴性的窗口期标本中,C型5份;22份隐匿性乙肝病毒感染(occult hepatitis B infection,OBI)标本中,C型13份、B型5份。结论邯郸地区无偿献血者核酸检测HBV DNA标本大多呈病毒低水平复制,且基因型以C型和B型为主,有效保障了血液安全。

1026例育龄妇女HPV感染情况调查及分析

目的:了解厦门市思明区已婚育龄期妇女HPV感染情况,HPV感染者宫颈细胞DNA定量异常情况,HPV感染者宫颈细胞学检查异常情况。方法:由麦克奥迪病理诊断中心对1 026例育龄妇女的宫颈细胞进行DNA定量分析及宫颈细胞TCT检查,采用TBS分类报告,采用凯普HPV分型诊断系统进行HPV核酸分析。结果:HPV感染人数119例,感染率11.6%,高危型HPV感染105例,感染率10.2%,低危型HPV感染14例,感染率1.4%,以高危型HPV感染为主,同时感染两种及以上高、低危HPV型别者19例,感染率1.9%,均存在高危型HPV感染。1 026例中,宫颈细胞DNA定量分析异常者54例,异常率5.3%,119例HPV感染者,25例存在宫颈细胞DNA定量分析异常,异常率21.0%,均为高危型HPV感染,907例无HPV感染者,29例存在宫颈细胞DNA定量分析异常,发生率3.2%,明显低于HPV感染者,两者差异有统计学意义。1 026例中,TCT检查异常26例,异常率2.5%,119例HPV感染中17例存在TCT检查异常,异常率14.3%,而907例无HPV感染者,TCT检查异常9例,异常率1.0%,HPV感染者TCT异常率明显高于无HPV感染者,差异有统计学意义。结论:已婚育龄期妇女HPV感染率11.6%,以高危型HPV感染为主;部分妇女存在两种型别以上HPV混合感染;HPV感染者宫颈细胞DNA定量异常率明显高于无HPV感染者,高危型HPV感染率明显高于低危型HPV感染者,宫颈细胞染色体DNA定量异常,宫颈液基细胞学检查可无异常。HPV感染者细胞学检查异常率明显高于无HPV感染者,30岁以上妇女宫颈癌筛查最佳的筛查方法是HPV检查联合宫颈细胞学检查。