LuxS/AI-2群体感应系统在乳酸菌细菌素合成中的作用

乳酸菌细菌素具有抑菌谱广、稳定性高、安全性高等优势,作为新型生物防腐剂备受青睐,但目前工业化应用的细菌素数量有限,合成量低是其应用受限的重要原因。国内外研究显示与特定的微生物共培养是提高乳酸菌细菌素合成量的有效方法,该过程受到LuxS/AI-2群体感应系统的调控。文章从乳酸菌LuxS/AI-2群体感应系统的组成及LuxS/AI-2群体感应系统在乳酸菌细菌素合成中的作用两个方面进行论述,为乳酸菌细菌素合成量的提高和工业化应用的实现提供了一定的理论依据。

基于LuxS/AI-2群体感应系统研究疮愈膏促进肛周慢性创面愈合的作用机制

目的:研究疮愈膏对肛周慢性创面形成的抑制作用及其对创面细菌生物被膜主要调控基因LuxS和信号分子AI-2的影响。方法:采用SD大鼠60只(200±20)g雄性大鼠随机分为普通创面组(n=15),实验组(n=15),阳性对照组(n=15),安慰剂组(n=15);通过背部新鲜创面每日滴加离心粪液构建肛周慢性创面模型。造模成功后,实验组给予疮愈膏外敷,阳性对照组给予莫匹罗星软膏外敷,安慰剂组给予凡士林纱条外敷,普通创面组给予生理盐水纱条外敷,1次/d,持续14 d。于治疗前和治疗后对各组大鼠创面进行记录分析;实时荧光定量聚合酶链式反应(RTPCR)检测生物被膜主要调控基因LuxS的变化;哈氏弧菌测定AI-2信号分子活性。结果:与安慰剂组比较,实验组和阳性对照组大鼠创面面积均明显缩小,差异具有统计学意义(P<0.05);实验组与阳性对照组差异无统计学意义。与安慰剂组对比,实验组和阳性对照组大鼠创面组织提取细菌中LuxS mRNA相对表达量,信号分子AI-2活性均明显降低(P<0.05),实验组和阳性对照组则无明显差异(P<0.05)。结论:疮愈膏能够加速肛周慢性创面的愈合同时抑制创面细菌生物被膜的形成,其机制可能与下调创面细菌LuxS基因的表达及降低其AI-2信号分子活性有关,LuxS/AI-2群体感应系统可能为疮愈膏治疗肛周慢性创面的机制之一。

副溶血弧菌lux报告基因系统的建立与应用

目的:建立副溶血弧菌的lux报告基因融合实验平台,为后续研究基因转录调控机制奠定基础。方法:采用PCR扩增opaR的启动子区序列,并将其克隆入pBBRlux质粒中,构建重组质粒opaR-lux。将opaR-lux重组质粒分别转入野生株(WT)、opaR突变株(ΔopaR)和aphA突变株(ΔaphA)中,检测特定培养条件下三者发出的冷光值(Lux)以及在600 nm处的吸光度值(OD600),以“Lux/OD600”表示单位OD600下的相对平均冷光单位(relative light unit,RLU)。通过比较各菌株的RLU大小,判断OpaR和AphA对opaR的调控关系,以检验实验平台的稳定性。结果:成功构建出带有opaR的pBBRlux重组质粒;在低密度(OD600<0.4)时,AphA负调控opaR的转录,当细菌达到高密度(OD600=0.8)时,AphA则对opaR的转录不起调控作用;在细菌从低密度生长到高密度(即OD600<0.8)中,OpaR对自身的转录存在负调控作用。结论:成功建立了副溶血弧菌的lux报告基因融合实验平台,用于后续转录调控机制的研究。

副溶血性弧菌luxS缺失株的构建及其生物学特性

本实验通过同源重组技术构建副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)luxS突变株,比较野生株和突变株的生长能力、4,5-二羟基-2,3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione,DPD)含量、生物被膜形成能力、运动能力、药物敏感性、胞外蛋白分泌能力以及群体感应相关基因的表达量,研究LuxS/AI-2群体感应系统LuxS基因缺失后对副溶血性弧菌生物学特性的影响。结果显示,敲除luxS基因并不影响菌株的药物敏感性和生长能力;与野生株相比,突变株的DPD含量、泳动能力显著降低,而生物被膜形成能力、培养24 h的胞外蛋白酶分泌能力显著增强;实时聚合酶链式反应结果显示突变株的鞭毛合成基因flgM的表达量显著上升,而溶血素分泌相关基因toxS、鞭毛合成基因flaA、外膜蛋白基因ompW的表达量均显著下降。本实验可为进一步研究副溶血性弧菌LuxS/AI-2群体感应系统对其生物学特性的调控机制提供参考,有助于预防和控制副溶血性弧菌。

变形链球菌LuxS基因缺失对生物膜结构的影响探究

目的探究变形链球菌LuxS基因缺陷株与标准株在生物膜结构上的差异。方法采用釉质磨片为载体,将变形链球菌标准菌株及luxS基因缺陷株按照1∶1比例接种于培养基中,通过培养后观察两者菌落形态学的变化和生长曲线的变化,比较两者生物膜中单个细菌的情况,比较两者在24 h后形成的生物膜结构情况,采用RT-PCR检测菌液中信号分子自诱导物(AI)-2 mRNA的表达水平。结果变形链球菌标准菌株和LuxS基因缺失菌株在菌落形态学上未见明显的表型差别,两者生长曲线的总体变化一致,两者形成的生物膜存在差异,变形链球菌标准菌株形成生物膜结构更紧密,而缺陷株生物膜菌间结构比较稀疏,RT-PCR检测变形链球菌LuxS基因缺陷株的AI-2 mRNA表达水平低于标准菌,差异有统计学意义(P<0.05)。结论变形链球菌LuxS基因缺陷株与标准株在离体模型上培养的生物膜结构发生了变化,LuxS基因缺失会影响生物膜结构。

反刍动物瘤胃微生物LuxS/AI-2群体感应研究进展

群体感应(quorum sensing, QS)是细菌利用信号分子进行种内或种间交流的一种通讯机制,借助该通讯机制微生物群体可以实现微生物个体无法完成的生理功能或行为调节,如生物膜形成、毒素分泌和生物发光等,以增强对外界胁迫环境的适应性。近期多组学研究发现,以自体诱导物-2(autoinducer-2, AI-2)为信号分子、LuxS为调节蛋白介导的LuxS/AI-2 QS是瘤胃微生物之间交流的主要通讯机制,影响着瘤胃微生物对饲料的利用效率。本文从AI-2的化学结构和转导途径对微生物LuxS/AI-2 QS进行总结,对LuxS/AI--2 QS在反刍动物瘤胃微生物定殖和饲料消化过程中的作用进行综述,并对LuxS/AI-2 QS在饲料消化、应激调控中的潜在作用进行展望,以期为通过LuxS/AI-2 QS调控瘤胃微生物消化代谢和稳态的生产策略提供理论参考。

LuX-Valve经导管三尖瓣置换系统血流动力学分析

目的探讨LuX-Valve经导管三尖瓣置换(TTVR)系统血流动力学特征。方法前瞻性纳入2020年4月至2022年9月海军军医大学第一附属医院心血管外科收治的53例因重度三尖瓣关闭不全(TR)行TTVR患者,其中男性18例,年龄(65.8±9.6)岁,超声心动图提示TR瞬时反流量为(67.8±50.3)ml。所有患者在Lux-Valve置入前后利用6F猪尾巴导管分别测量有创右心房、右心室以及肺动脉压力。结果Lux-Valve置入前后右心房峰压分别为(22.5±8.4)mmHg及(20.2±7.4)mmHg(P<0.001),右心房谷压分别为(12.5±5.6)mmHg及(13.8±5.4)mmHg(P<0.05),右心房压差分别为(10.0±5.8)mmHg及(6.4±3.9)mmHg(P<0.0001)。相比于置入前,置入后右心房峰压及压差均显著下降,相反,右心房谷压显著上升。置入前后肺动脉收缩压、舒张压以及平均压未见统计学差异。结论Lux-Valve置入后在消除TR的同时可显著改善右心房压,但对肺动脉压无明显影响,右心血流动力学值得进一步研究。

LuxS/AI-2型群体感应系统调控细菌生物被膜形成研究进展

生物被膜是大多数细菌在自然状态下的一种生长方式,使菌体具有浮游态时不具有的优势。它的形成和发展受到群体感应系统的调控,该系统是细菌依赖于群体密度而调控其生理行为的一种机制。其中Lux S/2型自诱导物(autoinducer 2,AI-2)群体感应系统又称种间群体感应系统,广泛存在于G^(+)及G^-菌中。其信号分子AI-2被认为是种间通用的信号分子,参与调控多种细菌的生物被膜。此外,目前已发现多种Lux S/AI-2型群体感应系统抑制剂,它们可以影响许多细菌生物被膜的形成。目前研究人员已开始致力于揭示Lux S/AI-2型群体感应系统调控生物被膜形成的分子机制,这对于进一步理解Lux S/AI-2型群体感应系统与生物被膜的关系具有重要意义。

牛疱疹病毒Ⅰ型二重LUX荧光PCR鉴别检测方法的建立

采用LUX新型荧光PCR技术原理，建立了快速检测牛疱疹病毒I型（BHV-1）以及鉴别野毒感染和基因缺失疫苗免疫动物的二重实时荧光PCR方法。结果显示，该方法对多株BHV-1病毒均呈典型gE、gC双基因阳性反应，对其他常见动物疱疹病毒以及健康牛基因组DNA等均呈阴性反应；对细胞增殖病毒液的gE、gC双基因鉴别的检测敏感性可达0．4～O．04TCID50比常规PCR方法高100倍以上；对带毒牛血清、抗凝全血、牛新鲜精液和冷冻精液基因鉴别的检测敏感性分别达0．04TCID50、0．4TCID50、0．4TCID50和4TCID50。采用该方法从临床牛血样、鼻拭子样品中检出IBRV阳性样品，检测全程仅需约2h。对单基因克隆质粒的检测进一步证实该方法能特异地鉴定gE、gC基因，检测灵敏度分别达90、30拷贝。结果表明，该方法可应用于临床快速诊断BHV-1病毒感染，鉴别BHV-1病毒感染与对应的基因缺失疫苗免疫动物。

水泡性口炎病毒血清型特异LUX实时荧光RT-PCR检测方法的建立

采用LUX荧光核酸扩增技术原理,以水泡性口炎病毒(VSV)NJ、IND型NS基因为模板分别设计并合成单标记LUX荧光引物,建立血清型特异的VSV荧光RT-PCR检测方法。试验表明,两种型特异的LUX荧光RT-PCR能分别特异地鉴定VSV血清型,对口蹄疫、猪水泡病等病毒以及对照细胞、健康动物组织RNA样品的检测结果均为阴性。对比检测试验表明,LUX荧光RT-PCR的检测敏感性比常规RT-PCR提高达10倍以上,对VSV细胞增殖病毒液的检测灵敏度可达1 TCID50。对人工感染豚鼠样品以及临床样品的检测试验证实,该LUX荧光RT-PCR可有效检测到人工感染动物组织以及进口牛临床样品中的水泡性口炎病毒,并能鉴定感染病毒血清型。所报道的检测方法,包括样品核酸提取、LUX荧光RT-PCR以及熔解曲线分析,可在3 h内完成。

嗜水气单胞菌ATCC7966 luxS基因缺失株构建及特性研究

目的研究群体感应信号分子AI-2合成酶编码基因luxS对嗜水气单胞菌ATCC 7966生理特性及毒力因子的影响。方法利用同源重组原理,构建含有中间为卡那霉素抗性基因,两侧为luxS基因上、下游同源序列片段的基因敲除质粒,将构建好的质粒转化大肠埃希氏菌SM 10(λpir)感受态细胞,利用接合法将质粒转入嗜水气单胞菌ATCC 7966,通过抗性筛选、PCR和DNA测序确认嗜水气单胞菌luxS基因缺失突变株。比较野生株ATCC 7966和luxS基因缺失突变株生长速度、AI-2合成、胞外蛋白酶合成及生物膜形成的差异。结果嗜水气单胞菌luxS基因缺失突变株ΔluxS构建成功。与野生株相比,突变株生长周期延长,基本丧失合成AI-2和胞外蛋白酶的能力;突变株生物膜形成能力降低,生长24h时生物膜形成能力为野生株的14.5%,36h时生物膜形成能力为野生株的60.0%,突变株生物膜形成速度明显比野生株缓慢,结构更为疏松。结论 luxS基因参与调控嗜水气单胞菌的生长、AI-2合成和毒力因子表达,本研究为进一步研究luxS基因在嗜水气单胞菌致病性中发挥的作用奠定基础。

重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化

目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTA Purification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD6_（600nm）为0.6~0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。

变异链球菌luxS基因对多糖基质代谢的影响

目的:利用变异链球菌luxS基因敲除的突变株,研究该基因缺陷对于生物膜多糖基质的影响。方法:通过向生物膜培养悬液中加入与细菌直径相近的磁性小珠,利用这些小珠由于生物膜约束而在磁场中位移受限的原理,采用生物膜定量分析仪,定量比较luxS突变株与野生株在利用外源性碳水化合物合成生物膜多糖基质能力方面的差异。采用SPSS 10.0软件包对实验数据,进行Dunnet双侧t检验。结果:变异链球菌luxS基因突变株与野生株均可利用碳水化合物合成胞外多糖基质,且外源性糖的加入可显著促进生物膜的形成。在加入1%蔗糖时,2菌株生物膜均在1h内迅速形成,而两者之间无显著差异。在加入1%葡萄糖时,两菌株的生物膜形成速度均有所加快,突变株的改变则更为明显。结论:luxS基因参与调节细菌对多糖基质代谢的过程,而其对于生物膜形成的影响也更多是通过调节多糖基质代谢实现的。

变形链球菌luxS基因突变对口腔混合细菌生物膜的影响

目的 :研究致龋菌变形链球菌luxS基因在口腔细菌混合培养形成牙菌斑生物膜中的作用。方法 :将变形链球菌野生株(UA159)及其2种luxS基因突变株(luxS基因高表达株和luxS基因缺陷株)分别与口腔细菌嗜酸乳杆菌(ATCC4356)按照1∶1比例接种于牛心脑浸液培养基,体外混合培养不同时间,包括生物膜形成过程中的初期(4 h)、中期(14 h)、晚期(24 h),通过MTT法检测混合菌在生物膜形成的量。通过激光共聚焦显微镜观察混合细菌24 h形成的生物膜结构,实时定量PCR检测变形链球菌相关基因(ftf, smu630, brpA, gbpB, gtfB, vicR, comDE和relA)的表达。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:变形链球菌野生株及其2种luxS基因突变株与嗜酸乳杆菌混合培养14 h后,生物膜的量分别为0.481±0.024、0.591±0.023和0.279±0.019;24 h后,混合细菌形成生物膜的量趋势与该时间点一致,变形链球菌高表达株高于野生株,而缺陷株明显降低;但4 h后形成的生物膜组间无显著差异。激光共聚焦显微镜结果表明,高表达株和野生株的集聚程度更高,形成生物膜的结构更加紧密;而缺陷株生物膜菌间结构比较稀疏。以变形链球菌野生株和嗜酸乳杆菌混合形成的生物膜中相关基因的表达为标准,高表达株相关基因的表达均增加,缺陷株表达均降低,且各组间存在显著差异(P<0.05)。结论:变形链球菌luxS基因影响与具核梭杆菌混合培养形成的牙菌斑生物膜,为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制提供了依据。

肠炎沙门菌luxS缺失株的构建及其生物学特性研究

拟研究LuxS/AI-2群体感应系统对肠炎沙门菌(Salmonella enterica Serovar Enteritidis,SE)生物学特性的影响。利用Red同源重组系统构建LuxS/AI-2系统关键基因luxS缺失株,通过比较亲本株和luxS缺失株体外生长速率、药物敏感性、细胞黏附侵袭能力及生物被膜形成能力等生物学特性,初步分析AI-2/LuxS系统对SE生物学特性的影响。结果显示,luxS缺失株能够稳定遗传缺失的△luxS基因;体外生长速率略快;生物被膜形成能力明显增强;对DF-1细胞和Caco-2细胞黏附侵袭能力均显著增加;对氟喹诺酮类药物敏感性提高128~256倍,对氨苄西林、四环素、多西环素、氯霉素和氟苯尼考类等的药物敏感性提高了8倍。以上结果表明,LuxS系统影响肠炎沙门菌的生物学特性(如生物被膜形成、对细胞的黏附侵袭能力),并且该系统也通过某种耐药机制影响肠炎沙门菌的药物敏感性。

植物乳杆菌HE-1由AI-2/LuxS介导的群体感应与生物膜形成关系的研究

本研究从AI-2/LuxS群体感应出发,研究植物乳杆菌HE-1的AI-2信号分子生成与生物膜形成的关系,同时对luxS基因进行扩增,从分子生物学角度验证菌株HE-1的AI-2信号分子产生。研究使用生物发光的方法检测植物乳杆菌HE-1不同培养时间AI-2的产生量;使用微孔板法确定不同时间点生物膜的生成量;之后使用PCR的方法扩增其luxS基因片段,对扩增片段进行同源性和系统发育分析。结果显示植物乳杆菌HE-1的生物膜生成时间和生成量与AI-2信号分子的产生时间和产生量非常吻合,luxS基因成功扩增,同源性分析显示植物乳杆菌HE-1与已知植物乳杆菌luxS基因同源性高达99%以上。分析实验结果得出植物乳杆菌HE-1生物膜生成与AI-2/LuxS群体感应系统二者之间有密切的关系,并且luxS基因的扩增成功和同源性分析从分子生物学上验证了植物乳杆菌HE-1具有产生AI-2信号分子的关键基因。

Lux 1540nm点阵激光治疗瘢痕疗效观察

目的:观察运用Lux 1540nm点阵激光治疗瘢痕的临床疗效。方法:选取瘢痕患者75例,其中外伤性瘢痕37例,痤疮后瘢痕38例,运用Lux 1540nm点阵激光进行治疗,观察疗效及副作用。结果:痊愈6例(8.00%),显效23例(30.67%),有效25例(33.33%),无效21例(28.00%),总有效率72.00%;随着治疗次数的增加,疗效逐渐提高。外伤性瘢痕与痤疮后瘢痕两组之间总有效率无差异(P>0.05)。术后出现暂时性色素沉着3例(4%),红斑1例(1.33%),均于数周内消退。结论:Lux 1540nm点阵激光治疗瘢痕疗效确切,安全性高,副作用低,不影响患者的学习及工作,值得临床推广。

产膜表皮葡萄球菌LuxS/AI-2型密度感应系统AI-2的活性及苦参碱对其的影响

【目的】研究产膜表皮葡萄球菌生物被膜菌和液相浮游菌LuxS/AI-2型密度感应系统中AI-2信号分子的活性及苦参碱对其的影响。【方法】绘制产膜表皮葡萄球菌ATCC35984液相浮游菌及生物被膜菌的生长曲线;利用哈维氏弧菌BB170(Vibrio harveyi BB170)作为报告菌株检测表皮葡萄球菌AI-2信号分子的活性;用荧光定量PCR法检测luxS基因的转录水平;用苦参碱对产膜表皮葡萄球菌ATCC35984进行处理,检测其AI-2信号分子活性的变化情况。【结果】在产膜表皮葡萄球菌液相浮游菌生长过程中,AI-2信号分子与luxS基因的相对表达量都是在对数生长期达到最大值,而后逐渐降低,与液相浮游菌生长曲线基本一致。在产膜表皮葡萄球菌生物被膜菌生长过程中,AI-2信号分子活性曲线与其生物被膜生长曲线变化趋势一致,但luxS基因的相对表达量曲线与生物被膜生长曲线变化趋势相反。中药苦参碱对产膜表皮葡萄球菌液相浮游菌和生物被膜菌AI-2信号分子活性有抑制作用,并且对液相浮游菌AI-2信号分子活性的抑制作用强于生物被膜菌。【结论】AI-2信号分子活性和luxS基因的相对表达量与产膜表皮葡萄球菌生物被膜菌及其液相浮游菌的生长相关;苦参碱能够显著下调产膜表皮葡萄球菌生物被膜菌和液相浮游菌的AI-2信号分子活性。

luxS基因对盐胁迫下植物乳杆菌生长及细菌素合成的影响

以植物乳杆菌KLDS1.0391野生株及其luxS基因缺失突变株为研究对象,探究luxS基因对该菌盐耐受能力的影响,并测定在0%、2%、3%、4%和6%质量分数NaCl胁迫条件下,luxS基因缺失对该菌生长及细菌素合成的影响,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术在转录水平上测定该菌细菌素合成相关基因的表达水平。结果表明:随NaCl质量分数的升高,2株菌的存活率均逐渐下降,当NaCl质量分数大于3%时,相同条件下野生株对盐的耐受能力显著强于突变株(P<0.05);除此之外,NaCl质量分数越高,菌株进入稳定期的时间越向后延迟,luxS基因缺失突变株在各NaCl质量分数下生长及细菌素合成能力均显著弱于野生株(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,当培养至稳定期24 h时,细菌素结构基因plnEF以及双组分调节基因plnD和plNC8HK均因luxS基因的缺失,表达显著下调(P<0.05)。因此,luxS基因缺失显著降低植物乳杆菌KLDS1.0391盐耐受能力,并且在NaCl胁迫条件下,该菌生长及细菌素合成能力也因luxS基因缺失而显著下降。

非剥脱性Lux1540nm点阵激光治疗黄褐斑的疗效和安全性

目的:观察非剥脱性Lux1540nm点阵激光对黄褐斑的治疗效果和安全性。方法:黄褐斑患者29例,运用Lux1540nm点阵激光(美国Palomar公司生产),波长1540nm,光斑直径15mm,能量6至8J/cm2,每4周一次,6次为一疗程,观察其临床疗效及副作用。结果:29例患者经过治疗后,基本治愈13例(44.8%),显效9例(31%),好转6例(20.7%),无效1例,总有效率为75.9%。治疗后患者的皮肤微红,不出血、不结痂。恢复后无色素脱失,不易产生色素沉着,不产生瘢痕。结论:非剥脱性Lux1540nm点阵激光治疗黄褐斑安全性高,疗效显著,不影响患者的日常生活及工作,是一种安全,有效的方法。