巨大芽胞杆菌luxAB标记菌株的根际定殖研究

通过三亲本杂交方法成功地用发光酶基因luxAB标记巨大芽胞杆菌ATCC1 45 81 ,所获得的标记菌株ATCC1 45 81 L在不同的条件下能稳定发光。将该标记菌株制成微生物接种剂 ,并利用土壤微缩系统将其接种小麦进一步研究它在小麦根际的定殖动态和散布规律。结果发现 ,ATCC1 45 81 L在灭菌土壤中的定殖水平高于不灭菌土壤 ,在垂直方向上主要的定殖在 0～ 7cm根段间 ,且随深度增加而降低。ATCC1 45 81 L在小麦种后第 7d之前就已达到最高定殖水平 ,在初始接种量为 3 40× 1 0 7cfu/g根情况下 ,第 7d时灭菌土壤处理的根际菌数为 2 5 4× 1 0 5cfu/g根 ,而不灭菌土壤的根际菌数为 8 87× 1 0 4 cfu/g根 ;随着时间的增长 ,定殖数量明显降低。

用发光酶基因(luxAB)标记法研究慢生花生根瘤菌的竞争结瘤能力

lux AB基因标记是一种新型基因标记技术 ,在很多研究领域都有着良好的应用前景。研究通过三亲本杂交将 lux AB基因成功地向慢生型花生根瘤菌进行了转移 ,并获得了一株带 Lux AB基因标记的菌株Cspr7- 1。对 Cspr7- 1进行性状、标记基因的遗传稳定性检测 ,结果表明 ,Lux AB基因不仅能有效表达 ,而且性状稳定。在无氮水培条件下进行标记菌株与土著根瘤菌的竞争结瘤试验。结果证实 ,Cspr7- 1在植物根系上的占瘤率平均达到 61 .3% ,比土著根瘤菌的竞争结瘤能力强 ,而且 Cspr7- 1在主根上的侵染能力远较侧根上的强 ,平均高出 2 2 .3%～ 39.6%。

luxAB基因标记的K2116L菌株在棉花根际中的定殖

采用三亲本杂交法将发光酶luxAB基因转移进棉花根际促生菌芽胞杆菌K2116菌株中,获得标记菌株K2116L。标记菌株连续传代15次均未发生质粒丢失现象,表明标记菌株具有较好的遗传稳定性;K2116L菌株的生长及其释钾能力未受到标记质粒的影响。K2116L菌株在灭菌和非灭菌的黄褐土、黄潮土和红壤3种土壤中均能长期存活;在灭菌土壤中的数量稍高于非灭菌土壤;在3种土壤中的数量依次为:黄褐土>黄潮土>红壤;在不同土壤中,K2116L菌株具有与土著菌株进行空间和营养竞争的能力。采用根盒试验追踪标记菌株在棉花根部的定殖动态,棉花播种12d时标记菌株在0～2、2～4cm深度根际土壤定殖密度达到最大;18d时在4cm以下的深度达到最高水平。棉花播种18d时标记菌株在所有深度的根表均达到最高定殖水平,0～2cm根段定殖密度为1.76×106cfu.g-1,8cm以下根段达到1.6×105cfu.g-1。补充营养后,根际和根表标记的菌株数量均有明显上升。试验数据显示,随着根的生长标记菌株不断向根尖方向扩散。

荧光假单胞菌AS1.867和3-PHB的luxAB基因标记及其在小麦根际的定殖

通过三亲本杂交方法成功地用发光酶基因 lux AB标记荧光假单胞菌 ( Pseudomonasflu-orescens) AS1 .86 7- L和 3 - PHB菌株 ,获得的标记菌株 AS1 .86 7- L和 3 - PHB- L在不同的条件下能稳定发光。将 AS1 .86 7- L和 3 - PHB- L制成固体微生物接种剂 ,并利用土壤微缩系统将其接种于小麦 ,研究它们在小麦根际的定殖动态和散布规律。结果发现 ,二株标记菌株在灭菌土壤上的定殖水平高于不灭菌土壤 ,在垂直方向上定殖主要发生于 0～ 8cm根段间 ,且随着深度的增加而降低。接种菌株在第 7天之前就已达到最高定殖水平 ,在每克根的初始接种量为 2 .3 2× 1 0 8cfu时 ,第 7天的灭菌土壤中 AS1 .86 7- L和 3 - PHB- L的根际菌数分别为 9.6 7× 1 0 6cfu和 6 .90× 1 0 6cfu,不灭菌土壤的根际菌数为 1 .41× 1 0 5cfu和 7.71× 1 0 5cfu。随着时间的延长 ,定殖数量均明显降低 ,3 - PHB- L在 40

以luxAB为报告基因的大豆根瘤菌的竞争结瘤研究

将来自pHN101的luxAB基因和来自pTR102的parCBA /DE基因,经过一系列中间载体整合到PLAFR3上构建成广宿主、稳定性质粒PHN158。通过三亲本杂交将pHN158导入费氏中华根瘤菌得到4株能在癸醛的激发下发出荧光的转移接合子WZRL、HWRL、HZRL和WWRL。将它们与3株大豆慢生根瘤菌WHB1、WHB2和WWB组配成12对组合,并以黑龙33和Williams为宿主以luxAB为报告基因进行竞争结瘤试验。结果表明,费氏中华根瘤菌与大豆慢生根瘤菌之间的平均竞争结瘤能力相当;同类型根瘤菌不同菌株之间的竞争结瘤能力存在着显著的差异;同时根瘤菌的竞争结瘤能力也明显受到宿主的影响。表明费氏中华根瘤菌与大豆慢生根瘤菌之间的竞争结瘤是一个菌株之间、菌植之间复杂的相互作用的过程。

基模势对luxAB标记的快生型大豆根瘤菌在土壤中存活的影响

经接合转移将luxAB基因插入快生型大豆根瘤菌 (Rhizobiumfredii)染色体 ,取可高效结瘤固氮的R .frediilux3菌株用于分子生态学研究 .在不同基模势下 ,研究了lux3在土壤中的存活 ,基模势为 - 30和 - 750kPa时 ,lux3在灭菌土中的生存能力明显 (P<0 .0 5)高于未灭菌土 ,当基模势为 - 1 50 0kPa时 ,土壤是否灭菌对lux3的存活影响没有差异 .不同基模势对lux3活性影响显著 ,在 - 1 50 0kPa的未灭菌土中 ,随着饥饿时间延长 ,可恢复活性的细菌数量显著下降 .同时比较了测定微生物活性的 3种方法 (即生物发光、脱氢酶活性和微生物呼吸 ) ,发光值变化与活细胞密度变化一致 ,PLf值 (即潜在发光 ,Potentialluminescence)反映了可恢复活性的饥饿种群密度 .

一种应用luxAB基因标记大豆根瘤菌的新方法

研究构建了带有luxAB基因和 parCBA/DE基因的重组质粒 pHN2 0 8,并通过三亲本杂交法将该质粒导入 6株大豆根瘤菌中 ,获得工程菌株。工程菌株在自生条件下和共生条件下的发光稳定性研究结果表明 ,重组质粒 pHN2 0 8可在根瘤菌中稳定传代。比较了工程菌与出发菌株的竞争结瘤能力 ,结果表明 pHN2 0 8的导入不影响根瘤菌的竞争结瘤能力。从而建立了一种更为简便的应用luxAB基因标记大豆根瘤菌的新方法 ,为检测大豆根瘤菌的结瘤情况以及进一步筛选强竞争结瘤大豆根瘤菌提供了一种适用的方法。

luxAB基因标记甲基对硫磷降解菌DLL-1在土壤和植株根部的生态行为研究

发光酶标记是 1种有效的跟踪微生物在生态环境中动态行为的技术手段。采用luxAB基因标记技术对甲基对硫磷降解菌DLL - 1在土壤中的分布和植株内的定殖情况进行了研究。结果表明 ,DLL - 1可以较长时间的在植株根际定殖 ,3 0d后仍可用X -感光片检测到菌体的存在 ,而根际外未检测到DLL - 1。植株根剖开后在培养基上培养 2 4h后进行X -光片曝光 ,发现DLL - 1能够进入植株根内并定殖。菌株回收后采用测定其农药降解活力和检查质粒图谱 2种方法证实 ,所观测的回收菌株就是接种的DLL -

一株克服地黄连作障碍有益菌的鉴定及其LuxAB基因标记

[目的]研究对克服地黄(Rehmannia glutinosa)连作障碍有益的43号菌的性质及其对地黄连作障碍的作用效果。[方法]利用细菌16S rDNA的保守序列进行比对,结合形态学观察、革兰氏染色和生理生化等特征对筛选得到的能够克服地黄连作障碍的43号菌进行鉴定;利用LuxAB发光酶基因对其进行标记,经抗性平板筛选,滴加葵醛在暗室进行检测,看是否得到了重组菌株;比较标记前后菌株对培养基中加入生地提取液的组培苗的作用效果。[结果]鉴定结果表明,43号菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。检测结果表明,得到重组菌株,命名为C-43。经过比较,标记前后菌株的生理生化特性基本没有变化,确定C-43对克服地黄连作障碍仍然有益。[结论]经过标记后的恶臭假单胞菌C-43号菌可用于后续的大田研究。

黄单胞菌属(Xanthomonas)P2126菌株luxAB基因标记及其生理活性的研究

为了研究棉花PGPR菌株黄单胞菌属(Xanthomonas)P2126的有效使用条件,以提高其根圈适应性,充分发挥其促生防病的应用潜力,本项研究采用发光酶基因(luxAB)标记检测技术研究了棉花PGPR菌株黄单胞菌属(Xanthomonas)P2126。研究菌株被luxAB基因标记后标记基因的遗传稳定性及标记菌株的生理生化特性。采用三亲本杂交法将发光酶luxAB基因转移进与棉花根际促生菌黄单胞菌P2126菌株中,获得标记菌株P2126L。标记菌株连续传代15次均未发生质粒丢失现象,表明标记菌株具有较好的遗传稳定性;P2126L菌株的生长及其解磷能力也没有受到标记质粒的影响,证明可以应用P2126L进行菌株根际定植生态学研究。

不同基模势下luxAB标记的弗氏中华根瘤菌在土壤中的存活能力

经接合转移将luxAB基因插入弗氏中华根瘤菌 (Rhizobiumfredii)染色体 ,取可高效结瘤固氮的R .frediilux3菌株用于分子生态学研究 .在不同基模势下 ,研究了lux3在土壤中的存活 ,基模势为 - 30和 - 75 0kPa时 ,lux3在灭菌土中的存活能力明显 (P <0 .0 5 )高于未灭菌土 ,当基模势为 - 15 0 0kPa时 ,土壤是否灭菌对lux3的存活影响没有差异 .不同基模势对lux3活性影响显著 ,在 - 15 0 0kPa的未灭菌土中随着饥饿时间的延长 ,可恢复活性的细菌数量显著下降 .比较了测定微生物活性的 3种方法 (即脱氢酶活性、生物发光和微生物呼吸 ) ,发光值变化与活细胞密度变化一致 .图 4表 2参

LuxAB标记荧光假单胞菌的菜心根际定殖研究

目的:利用三亲本杂交方法将luxAB发光酶基因标记至荧光假单胞菌PF20001上,所获得的标记菌株PF20001-Lux能稳定发光。将该标记菌株制成微生物制剂,接种菜心进一步研究它在菜心根际的定殖动态和散布规律。方法:利用三亲本杂交方法将luxAB发光酶基因标记至荧光假单胞菌PF20001上,将该菌施与菜心生长土壤中,通过接合子发光检测及发光菌落的平板计数来分析荧光假单胞菌在菜心根际的定殖分布情况。结果:PF20001-Lux在根系周围的土壤中的有一定的定殖率,在根内主要定殖在3～4cm根内。PF20001-Lux在菜心种植后7d前就达到最高定殖水平达3.8×105CFU/g,随后逐渐下降。结论:PF20001-lux在菜心根际具备良好的适应能力。

基于luxAB标记菌株的发光定量分析及其在镉毒性检测方面的应用

以E.coli(pHN102)为研究对象,探讨了luxAB标记菌株的发光定量方法以及影响其发光测定的相关因素.结果表明,该标记菌株在癸醛诱导发光后存在动态变化的发光曲线,发光强度随时间变化先升后降.增大癸醛浓度会提高发光强度,当癸醛浓度达到1%时出现最大发光值;供试菌株在35℃和pH6条件下的发光强度最大,与E.coli的最适生长条件相一致.应用此标记菌株检测镉(Cd)毒性,其相对发光度与Cd浓度存在负相关,线性回归分析可达到1%显著水平.Cd在LB培养基、M9培养基和水中的EC50值分别为4.27mmol/L、34.8mmol/L和62μmol/L,说明Cd在水介质中的毒性远大于在LB、M9培养基中的毒性.

发光酶基因(luxAB)标记的荧光假单胞菌CP1108的定殖能力研究

利用三亲本杂交方法,将luxAB发光酶基因标记至荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CP1108上,研究标记菌株CP1108L的个体生态学特征及其在棉花根圈的定殖动态。结果表明,标记菌株连续传代20次均未发生质粒丢失现象,标记质粒在受体菌株中较为稳定,CP1108L菌株的生长及部分生理生化特性没有受到标记质粒的影响;标记菌株能够在棉花根圈中成功定殖,棉花生长14 d时,CP1108L在所有深度的根段均达到最高定殖水平,定殖密度分别为2.31×105 cfu.g-1根土、3.18×105 cfu.g-1鲜根,而其中以0～2 cm根段处标记菌株的定殖密度最大,根际和根表的菌数分别为9.08×104 cfu.g-1根土、1.44×105 cfu.g-1鲜根;接种CP1108和CP1108L菌液处理棉花植株的干重、主根长和株高显著高于对照组;两个菌株处理之间差异不显著。

应用luxAB基因和gusA基因标记大豆根瘤菌的效果

应用发光酶基因ｌｕｘＡＢ和β－葡萄糖苷酶基因ｇｕｓＡ分别对快生型大豆根瘤菌ＨＮ０１进行了标记，研究了这两种标记系统的检测方法和检测效果，并对这两种标记系统在大豆根瘤菌中的应用进行了分析比较。

钝顶螺旋藻luxAB载体的构建

实验拟构建钝顶螺旋藻luxAB载体,为螺旋藻遗传转化操作系统的建立提供技术参考和支持。使用EcoRI和SmaI双酶切质粒pUCΩGUS,胶回收获得含有Ubil启动子基因及amp基因的载体大片段;根据质粒pRL1063a中luxAB基因的序列设计引物,以质粒pRL1063a为模板(SalI酶切),PCR扩增luxAB基因片段;在T4 DNA连接酶的作用下将载体大片段和luxAB基因片段进行体外连接重组并转化感受态细胞,构建成新型质粒载体pUCΩluxAB。

马拉硫磷降解菌缺陷短波单胞菌L19菌株的luxAB基因标记及其在土壤中的存活

采用电转化法成功的将带有发光酶基因luxAB的质粒pTR102导入缺陷短波单胞菌L19菌株(Brevundimonas diminuta L19)中,考察了电击时间、电击场强、细胞生长时期等因素对转化效率的影响。测定了转化子L19-luxAB菌株的遗传稳定性以及标记基因的介入对L19菌株降解有机磷农药能力的影响,研究了L19菌株在土壤中的定殖动态和降解马拉硫磷的能力。结果表明,转化子L19-luxAB具有发光活性和对卡那霉素的抗性,遗传稳定性强,在抗性平板上传代15次仍有很强的发光活性,并且标记菌株与出发菌株对有机磷农药的降解能力无显著差异。证明可以应用L19-luxAB进行菌株土壤定殖生态学研究。标记菌株在灭菌土壤和自然土壤中均能很好的存活,具有明显的降解马拉硫磷的能力。

LuxAB标记的N2106-L在小麦根圈的定植动态

目的研究小麦PGPR（植物根际促生菌）菌株的个体生态学及其在小麦根圈的定植动态。方法采用三亲本杂交法将发光酶基因luxAB转人具有固氮能力的小麦根际促生菌Azotobacter N2106菌株中，获得标记菌株N2106-L，将标记菌株接种到灭菌和非灭菌的黄褐土、红壤和黄潮土中研究其存活状况，采用根盒试验追踪标记菌株在小麦根圈的定植动态。结果标记菌株N2106-L具有发光活性和对km、str、tet三种抗生素的抗性，且具有较好的遗传稳定性。N2106-L在灭菌土壤中的数量稍高于非灭菌土壤；在3种土壤中的数量依次为：黄褐土〉黄潮土〉红壤。N2106-L在小麦根表定植密度大于根际定植密度；在小麦根际，小麦播种10d时标记菌株在0-2cm深度根际土壤定植达到最大值（2．17±0．25）×10^6CFU／g土，20d时在2-4cm深度的根际土壤中达到最高定植水平（3．92±0．47）×10^5CFU／g土；在小麦根表，标记菌株在小麦播种10d时在所有深度的根段均达到最高定植水平，0-2cm根段定植密度为（3．60±0．60）×10^6CFU／g鲜根，12cm以下根段达到（2．78±0．56）×10^4CFU／g鲜根。结论标记菌株随着根的伸长不断向根尖方向扩散，且较为稳定地在小麦根圈定植，研究结果为小麦PGPR菌株的应用提供了可靠实验数据。

青海弧菌荧光素酶基因LuxAB的原核表达

为研究青海弧菌的发光机制,参考霍乱弧菌的发光基因,设计了青海弧菌Lux AB基因的扩增引物,经PCR反应得到相应的片段,并建立了与其他常见荧光素酶的系统发育关系;同时对青海弧菌的16S r DNA进行克隆和测序,并基于16S r DNA建立青海弧菌与其他相近细菌之间的亲缘关系;随后,成功将Lux AB克隆到表达载体PHSG396中,转化大肠杆菌Top10,成功实现重组质粒在大肠杆菌中的表达。

细菌荧光酶的融合luxAB基因在肝癌细胞中的表达

目的 探索细菌荧光酶的融合luxAB基因作为新的报告基因在肝癌细胞中表达的可行性。方法 基于PCR的位点突变技术 ,构建了含有细菌荧光酶融合AB基因的哺乳动物表达载体pcDNA3 luxAB ,通过脂质体转染 ,使其在肝癌细胞BEL740 2中稳定表达。以序列测定和PCR分别确定融合luxAB基因构建的正确性和质粒转染的成功。以MTT和生物发光法分别测定细胞群体生长曲线和细菌荧光酶发光强度。结果 构建的融合luxAB基因是单顺反子 ,与设计完全一致 ;pcDNA3 luxAB的转染对BEL740 2肝癌细胞的群体生长无显著影响 ;表达载体在BEL740 2细胞中可稳定表达 ,在细胞水平可检测到 (8.71± 1.2 1)mV/ 40 μg蛋白的细菌荧光酶发光强度。