巨大芽胞杆菌luxAB标记菌株的根际定殖研究

通过三亲本杂交方法成功地用发光酶基因luxAB标记巨大芽胞杆菌ATCC1 45 81 ,所获得的标记菌株ATCC1 45 81 L在不同的条件下能稳定发光。将该标记菌株制成微生物接种剂 ,并利用土壤微缩系统将其接种小麦进一步研究它在小麦根际的定殖动态和散布规律。结果发现 ,ATCC1 45 81 L在灭菌土壤中的定殖水平高于不灭菌土壤 ,在垂直方向上主要的定殖在 0～ 7cm根段间 ,且随深度增加而降低。ATCC1 45 81 L在小麦种后第 7d之前就已达到最高定殖水平 ,在初始接种量为 3 40× 1 0 7cfu/g根情况下 ,第 7d时灭菌土壤处理的根际菌数为 2 5 4× 1 0 5cfu/g根 ,而不灭菌土壤的根际菌数为 8 87× 1 0 4 cfu/g根 ;随着时间的增长 ,定殖数量明显降低。

luxAB基因标记的K2116L菌株在棉花根际中的定殖

采用三亲本杂交法将发光酶luxAB基因转移进棉花根际促生菌芽胞杆菌K2116菌株中,获得标记菌株K2116L。标记菌株连续传代15次均未发生质粒丢失现象,表明标记菌株具有较好的遗传稳定性;K2116L菌株的生长及其释钾能力未受到标记质粒的影响。K2116L菌株在灭菌和非灭菌的黄褐土、黄潮土和红壤3种土壤中均能长期存活;在灭菌土壤中的数量稍高于非灭菌土壤;在3种土壤中的数量依次为:黄褐土>黄潮土>红壤;在不同土壤中,K2116L菌株具有与土著菌株进行空间和营养竞争的能力。采用根盒试验追踪标记菌株在棉花根部的定殖动态,棉花播种12d时标记菌株在0～2、2～4cm深度根际土壤定殖密度达到最大;18d时在4cm以下的深度达到最高水平。棉花播种18d时标记菌株在所有深度的根表均达到最高定殖水平,0～2cm根段定殖密度为1.76×106cfu.g-1,8cm以下根段达到1.6×105cfu.g-1。补充营养后,根际和根表标记的菌株数量均有明显上升。试验数据显示,随着根的生长标记菌株不断向根尖方向扩散。

用发光酶基因(luxAB)标记法研究慢生花生根瘤菌的竞争结瘤能力

lux AB基因标记是一种新型基因标记技术 ,在很多研究领域都有着良好的应用前景。研究通过三亲本杂交将 lux AB基因成功地向慢生型花生根瘤菌进行了转移 ,并获得了一株带 Lux AB基因标记的菌株Cspr7- 1。对 Cspr7- 1进行性状、标记基因的遗传稳定性检测 ,结果表明 ,Lux AB基因不仅能有效表达 ,而且性状稳定。在无氮水培条件下进行标记菌株与土著根瘤菌的竞争结瘤试验。结果证实 ,Cspr7- 1在植物根系上的占瘤率平均达到 61 .3% ,比土著根瘤菌的竞争结瘤能力强 ,而且 Cspr7- 1在主根上的侵染能力远较侧根上的强 ,平均高出 2 2 .3%～ 39.6%。

荧光假单胞菌AS1.867和3-PHB的luxAB基因标记及其在小麦根际的定殖

通过三亲本杂交方法成功地用发光酶基因 lux AB标记荧光假单胞菌 ( Pseudomonasflu-orescens) AS1 .86 7- L和 3 - PHB菌株 ,获得的标记菌株 AS1 .86 7- L和 3 - PHB- L在不同的条件下能稳定发光。将 AS1 .86 7- L和 3 - PHB- L制成固体微生物接种剂 ,并利用土壤微缩系统将其接种于小麦 ,研究它们在小麦根际的定殖动态和散布规律。结果发现 ,二株标记菌株在灭菌土壤上的定殖水平高于不灭菌土壤 ,在垂直方向上定殖主要发生于 0～ 8cm根段间 ,且随着深度的增加而降低。接种菌株在第 7天之前就已达到最高定殖水平 ,在每克根的初始接种量为 2 .3 2× 1 0 8cfu时 ,第 7天的灭菌土壤中 AS1 .86 7- L和 3 - PHB- L的根际菌数分别为 9.6 7× 1 0 6cfu和 6 .90× 1 0 6cfu,不灭菌土壤的根际菌数为 1 .41× 1 0 5cfu和 7.71× 1 0 5cfu。随着时间的延长 ,定殖数量均明显降低 ,3 - PHB- L在 40

基模势对luxAB标记的快生型大豆根瘤菌在土壤中存活的影响

经接合转移将luxAB基因插入快生型大豆根瘤菌 (Rhizobiumfredii)染色体 ,取可高效结瘤固氮的R .frediilux3菌株用于分子生态学研究 .在不同基模势下 ,研究了lux3在土壤中的存活 ,基模势为 - 30和 - 750kPa时 ,lux3在灭菌土中的生存能力明显 (P<0 .0 5)高于未灭菌土 ,当基模势为 - 1 50 0kPa时 ,土壤是否灭菌对lux3的存活影响没有差异 .不同基模势对lux3活性影响显著 ,在 - 1 50 0kPa的未灭菌土中 ,随着饥饿时间延长 ,可恢复活性的细菌数量显著下降 .同时比较了测定微生物活性的 3种方法 (即生物发光、脱氢酶活性和微生物呼吸 ) ,发光值变化与活细胞密度变化一致 ,PLf值 (即潜在发光 ,Potentialluminescence)反映了可恢复活性的饥饿种群密度 .

一种应用luxAB基因标记大豆根瘤菌的新方法

研究构建了带有luxAB基因和 parCBA/DE基因的重组质粒 pHN2 0 8,并通过三亲本杂交法将该质粒导入 6株大豆根瘤菌中 ,获得工程菌株。工程菌株在自生条件下和共生条件下的发光稳定性研究结果表明 ,重组质粒 pHN2 0 8可在根瘤菌中稳定传代。比较了工程菌与出发菌株的竞争结瘤能力 ,结果表明 pHN2 0 8的导入不影响根瘤菌的竞争结瘤能力。从而建立了一种更为简便的应用luxAB基因标记大豆根瘤菌的新方法 ,为检测大豆根瘤菌的结瘤情况以及进一步筛选强竞争结瘤大豆根瘤菌提供了一种适用的方法。

应用luxAB基因和gusA基因标记大豆根瘤菌的效果

应用发光酶基因ｌｕｘＡＢ和β－葡萄糖苷酶基因ｇｕｓＡ分别对快生型大豆根瘤菌ＨＮ０１进行了标记，研究了这两种标记系统的检测方法和检测效果，并对这两种标记系统在大豆根瘤菌中的应用进行了分析比较。

一株克服地黄连作障碍有益菌的鉴定及其LuxAB基因标记

[目的]研究对克服地黄(Rehmannia glutinosa)连作障碍有益的43号菌的性质及其对地黄连作障碍的作用效果。[方法]利用细菌16S rDNA的保守序列进行比对,结合形态学观察、革兰氏染色和生理生化等特征对筛选得到的能够克服地黄连作障碍的43号菌进行鉴定;利用LuxAB发光酶基因对其进行标记,经抗性平板筛选,滴加葵醛在暗室进行检测,看是否得到了重组菌株;比较标记前后菌株对培养基中加入生地提取液的组培苗的作用效果。[结果]鉴定结果表明,43号菌为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。检测结果表明,得到重组菌株,命名为C-43。经过比较,标记前后菌株的生理生化特性基本没有变化,确定C-43对克服地黄连作障碍仍然有益。[结论]经过标记后的恶臭假单胞菌C-43号菌可用于后续的大田研究。

LuxAB标记荧光假单胞菌的菜心根际定殖研究

目的:利用三亲本杂交方法将luxAB发光酶基因标记至荧光假单胞菌PF20001上,所获得的标记菌株PF20001-Lux能稳定发光。将该标记菌株制成微生物制剂,接种菜心进一步研究它在菜心根际的定殖动态和散布规律。方法:利用三亲本杂交方法将luxAB发光酶基因标记至荧光假单胞菌PF20001上,将该菌施与菜心生长土壤中,通过接合子发光检测及发光菌落的平板计数来分析荧光假单胞菌在菜心根际的定殖分布情况。结果:PF20001-Lux在根系周围的土壤中的有一定的定殖率,在根内主要定殖在3～4cm根内。PF20001-Lux在菜心种植后7d前就达到最高定殖水平达3.8×105CFU/g,随后逐渐下降。结论:PF20001-lux在菜心根际具备良好的适应能力。

发光酶基因(luxAB)标记的荧光假单胞菌CP1108的定殖能力研究

利用三亲本杂交方法,将luxAB发光酶基因标记至荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CP1108上,研究标记菌株CP1108L的个体生态学特征及其在棉花根圈的定殖动态。结果表明,标记菌株连续传代20次均未发生质粒丢失现象,标记质粒在受体菌株中较为稳定,CP1108L菌株的生长及部分生理生化特性没有受到标记质粒的影响;标记菌株能够在棉花根圈中成功定殖,棉花生长14 d时,CP1108L在所有深度的根段均达到最高定殖水平,定殖密度分别为2.31×105 cfu.g-1根土、3.18×105 cfu.g-1鲜根,而其中以0～2 cm根段处标记菌株的定殖密度最大,根际和根表的菌数分别为9.08×104 cfu.g-1根土、1.44×105 cfu.g-1鲜根;接种CP1108和CP1108L菌液处理棉花植株的干重、主根长和株高显著高于对照组;两个菌株处理之间差异不显著。

应用发光酶基因对快生型大豆根瘤菌HN01结瘤作用进行检测

含发光酶基因luxAB的Tn5转座子自杀质粒pHNC3，在辅助质粒pRK2013的帮助下，转入快生型大豆根瘤菌HN01中小，pHNC3经自杀重组，其Tn5－luxAB转座插入HN01基因组中，从而赋予HN01以发光活性。挑取具有发光活性的HN01杂交单菌落，进行质粒快检和以luxAB为探针的分子杂交，选取Tn5-luxAB分别插入到HN01染色体上和不同质粒上的标记菌株，进行灭菌盆栽实验，并对一株Tn5-luxAB标记于染色体上的菌株HN01LC02进行了模拟大豆栽培条件下的有菌盆栽实验，包括对发光根瘤菌占瘤率的测定和发光根瘤在根系上分布情况的测定。

转绿色荧光蛋白基因的青枯雷尔氏菌生物学特性

【目的】采用电击法对青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)进行gfp/luxAB基因双标记,研究标记前后菌株的生长差异、以及侵染性和致病性的变化。【方法】通过电击法进行青枯雷尔氏菌的遗传转化,采用番茄组培苗对标记菌株的侵染条件和侵染过程进行初步研究。【结果】成功地采用gfp/luxAB基因标记了青枯雷尔氏菌。标记后的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同,均为长椭圆形,近杆状,整个细胞呈现绿色荧光,PCR结果表明,从标记青枯雷尔氏菌菌株的基因组DNA中扩增出约3.0kb的gfp基因片段。标记菌在对数生长期,荧光素酶活性快速增加,到稳定期,荧光素酶活性降低。在无选择压力条件下连续移植20次,仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光,荧光稳定性保持在100%。gfp基因标记前后的菌株在培养的最适温度、最佳pH值及生长曲线上基本一致,在番茄组培苗内的侵染路线相同,致病力均达到90%以上。【结论】将gfp和luxAB融合基因成功转入青枯雷尔氏菌,融合基因在标记菌株中的表达高效稳定。导入的gfp基因对宿主的生长特性及致病性没有影响。

含发光酶基因的转座子质粒载体的改造及向根瘤菌HN01的转座

将从自杀性重组质粒pDB30上分离的3．6kb含卡那霉素抗性基因和发光酶基因（luxAB）的BglⅡ酶切片段，克隆到小Mr的高拷贝质粒pIJ2925上，构成新的质粒，pHNLX1011；然后将pHNLX1011经BglⅡ部分酶切，酶连在含蔗糖酶基因（sacB）的自杀性重组质粒载体pMH1701上，载体分别采用BglⅡ酶切和BamHⅠ酶切．连接转化后共得到4种重组质粒类型的菌株，它们具有不同发光活性；将它们分别与快生型大豆根瘤菌HN01进行三亲本杂交，发现它们的转座频率均较pDB30高．对经转座标记后的根瘤菌进行发光活性检测，只有pHNC3质粒所转座的根瘤菌浇具有较强发光活性．所得发光根瘤菌衍生菌株能在野大豆和栽培大豆黑农39根际形成正常根瘤，能用X光片记录下根瘤的发光活性．

假单胞菌JK45菌株lux基因标记及在土壤中的存活

为研究植物根部重要促生菌株的个体生态学,利用三亲接合法成功地将发光酶基因luxAB转入具有解钾能力的假单胞菌Pseudomonassp.JK45菌株中。研究表明,获得的标记菌株JK45-L具有发光活性和对Cm、Km、Tet3种抗生素的抗性,杂交比例以1∶1∶1适宜。JK45-L菌株在抗生素平板中传代15次,仍具发光活性和对3种抗生素的抗性,说明标记质粒在受体菌株中较为稳定,JK45-L菌株的生长及生理生化特性没有受到标记质粒的影响,其解钾能力也没有发生明显的变化。将JK45-L菌株接种到土壤中利用luxAB基因的活性研究菌株的存活情况,结果发现,标记菌株在灭菌土壤和自然土壤中均能很好的生存,在黄褐土和黄潮土中存活规律相似,说明JK45-L菌株具有在不同土壤中与土著菌株进行空间和营养竞争的能力。

Tet抗性铜绿假单胞菌接合转移pHN102方法研究

二亲本杂交实验通常要求受体菌不能携带有与质粒上相同的抗性.本次实验中受体菌铜绿假单胞菌(Pseudo-monas aeruginosa)和重组质粒pHN102都带有四环素(Tc)抗性.考虑到质粒pHN102导入受体菌后至少带有两个Tc抗性基因片段,转移接合子的抗性会增强,所以提高四环素浓度至20μg/mL,并利用pHN102上携带的luxAB发光酶基因标记受体菌筛选转移接合子,并设立对照菌株.通过抽提质粒、琼脂糖凝胶电泳检测,确定pHN102成功转入P.aeruginosa中.转移接合子经4次转接后,质粒仍可以稳定存在且能够稳定表达.P.aeruginosa(pHN102)的发光动力学曲线表明,加入底物20min后,发光强度趋于稳定.经液体培养稀释后进行发光度和活菌数测定,发现二者呈显著的线性关系(r=0.994).

动物病原大肠杆菌K88的绿色荧光蛋白基因标记及其稳定性研究

成功地将gfp/luxAB双标记基因整合到K88染色体上,得到绿色荧光蛋白基因标记的大肠杆菌K88∶gfp/lux,其菌体和菌落形态与原始菌株K88完全一致,引入的新质粒不影响菌株的基本形态。从含gfp基因的质粒DNA和K88∶gfp/lux基因组DNA上均可扩增出大小约700 bp的gfp基因片段。大肠杆菌特异性基因检测结果表明,从大肠杆菌K88和K88∶gfp/lux基因组DNA上均扩增出大小约260 bp的大肠杆菌特异性基因片段,说明gfp基因标记后的菌株均为大肠杆菌。在相同的培养条件下,K88∶gfp/lux和K88的生长曲线的变化趋势基本相同。通过检测肠毒性基因(estA)发现,从大肠杆菌K88和K88∶gfp/lux基因组DNA上均扩增出大小约158 bp的肠毒性基因片段,说明gfp基因标记后的菌株在肠毒性方面未发生变化。在无选择压力条件下将K88∶gfp/lux菌株每隔12 h连续转接10次后,所有菌落均保持着均匀并且强烈的绿色荧光,说明标记基因在K88∶gfp/lux中的表达稳定性很高。K88∶gfp/lux和K88在中性偏酸性的环境中生长较好,当初始pH值偏碱性时,生长较差。

土壤因子对发光酶基因标记的荧光假单胞菌X16L2在小麦根圈定殖的影响

采用发光酶基因 (luxAB)标记检测技术研究了根盒土壤微宇宙 (microcosm)中土壤灭菌、土壤含水量和土壤类型对荧光假单胞菌 (Pseudonmonasfluorescens,简称Pf)Xl6L2在小麦根圈定殖的影响。研究结果表明 ,灭菌土壤中Pf·Xl6L2在小麦根圈的定殖水平较不灭菌土壤中的高。土壤类型对Pf·Xl6L2的定殖水平有较大影响 ,在黄棕壤中的定殖水平显著高于灰潮土中的。土壤含水量对定殖情况的影响与土壤类型有关 ,当土壤含水量为 50 %田间持水量 (Fieldcontents,简称FC)时 ,在黄棕壤中 ,Pf·Xl6L2主要定殖在种子下方 4cm以内的根段上 ,但仍可散布至 8cm处 ,而在灰潮土中 ,Pf·Xl6L2只能散布至种子下方 4cm以内 ;在黄棕壤中 ,土壤含水量为 60 %FC和 75%FC时 ,Pf·Xl6L2的定殖水平显著高于在 50 %FC条件下的 ,不但能散布至种子下方 8cm处 ,而且定殖水平可达 3 0× 1 0 2 cfu·g- 1 根 ,在灰潮土中 ,不同土壤含水量之间Pf·Xl6L2的定殖水平差异不大 ,但Pf·Xl6L2的散布范围不一 ,在 60 %FC和75%FC条件下 ,Pf·Xl6L2可散布至种子下方 8cm处 ,而在 50 %FC下则不能。

应用发光酶基因标记检测大豆遗传改造根瘤菌在田间应用中的占瘤率

通过含发光酶基因ｌｕｘＡＢ的转座自杀质粒ｐＨＮＣ３，将发光酶基因整合到优良快生型大豆根瘤菌ＨＮ０１基因组中，得到具有发光活性的遗传改造菌株ＨＮＯ１ＬＣ０２。应用ＨＮ０１ＬＣ０２进行无菌盆栽和田间试验。结果表明，无菌盆栽条件下发光工程根瘤菌在黑农３９大豆根系上所形成的根瘤均具有发光活性，并能用Ｘ光片记录下来，利用发光工程根瘤菌所形成根瘤的发光活性，考察了发光工程根瘤菌在田间栽培条件下的检测方法和占瘤率的测定。

甲基对硫磷降解菌DLL-1的发光酶基因标记及在土壤中的变化

采用三亲接合法成功地将携带有发光酶基因的pTR1 0 2转入了甲基对硫磷降解菌Pseudomonassp .DLL -1菌株中。获得的接合子在液体培养、固体培养过程中以及在土壤中其标记质粒非常稳定。标记质粒并没有给受体细胞的生长、降解甲基对硫磷的能力带来严重的影响。因此 ,将标记菌株DLL -1-B用于土壤生态研究是可行的。在土壤中 ,DLL -1 -B的数量在接种后最初 2天下降幅度较小 ,随后下降速度较快 ,但当下降到 1 0 3～ 1 0 4 g- 1时趋于稳定。DLL -1 -B在水中下降速度更快 ,存活时间更短。DLL -1 -B在旱地土壤中的移动性较差 ,大多存在于 0～ 1 0cm土壤中。在水田中 ,DLL -1 -B的移动性较好 ,2周后 ,2 0～ 3 0cm土壤中测得DLL -1 -B为 2× 1 0 2 g- 1。

导入四碳二羧酸转移酶基因对费氏中华根瘤菌共生固氮效率的影响

将来自苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti)的四碳二羧酸转移酶基因(dctABD)经 pIJ2 92 5克隆到广宿主、稳定性质粒 pTR10 2上 ,获得诱导型表达的重组质粒 pHN2 0 2。在此基础上再引入来自 pDB30所含的发光酶基因 (luxAB)作分子标记 ,以 pTR10 2为基础构建成带有dctABD和luxAB的重组质粒 pHN2 0 5。经三亲本接合转移 ,将重组质粒 pHN2 0 5导入费氏中华根瘤菌 (Sinorhizobium fredii)HNO1,GR3和YC4。与出发菌相比较的盆栽试验结果表明 :HN0 1(pHN2 0 5)和GR3(pHN2 0 5)分别在宁镇一号和川早一号大豆上能显著提高植株地上部分干重 (生物量 )和总氮量 ,YC4 (pHN2 0 5)在黑龙 33大豆上能同时显著提高植株地上部分干重 (生物量 ) ,总氮量和根瘤鲜重。本研究结果表明 :导入dctABD基因对共生固氮效率的增效性与受体根瘤菌和大豆品种等因素有关。以luxAB为报告基因进行的转移接合子培养条件下分离单菌落和共生条件下形成根瘤的发光活性检测结果表明 :pHN2 0 5可在供试费氏中华根瘤菌中稳定遗传。