RNA干扰对LCDV-cn在牙鲆体内复制的影响

海水养殖生物病毒病是世界性难题,淋巴囊肿病毒中国分离株(LCDV-cn)是牙鲆(Paralichthys olivaceus)淋巴囊肿病的病原。以mcp基因为靶基因,设计siRNA-mcp1、siRNA-mcp2、siRNA-mcp3等3条siRNA序列,研究RNA干扰(RNAi)对淋巴囊肿病毒在牙鲆体内复制的影响。结果表明,牙鲆体内注入siRNA-mcp1和siRNA-mcp3后,mcp基因的表达有所下调;统计分析表明,注入siRNA-mcp1后,mcp基因的表达下调明显,具有显著性差异(p<0.05),注入siRNA-mcp2、siRNA-mcp3后,mcp基因的表达下调不明显,差异不显著(p>0.05)。本实验中初步实现了RNAi对LCDV-cn复制的抑制作用。

牙鲆淋巴囊肿病毒中国株(LCDV-C)羟类固醇脱氢酶基因的特征分析

属于虹彩病毒科的淋巴囊肿病毒(Lymphoeystisdiseasevirus,LCDV)是一类能引起全球各地上百种淡、海水鱼产生囊肿的病原。在新分离到淋巴囊肿病毒中国株(LymphocystisdiseasevirusisolatefromChina,LCDV—C)并完成序列测定的基础上,用计算机辅助分析了LCDV—C羟类固醇脱氢酶(hydroxysteroiddehydrogenase,HSD)基因结构特征,LCDV—CHSD读码框为1023bp,推导其编码含340个氨基酸、分子量约为39.3kD的蛋白质。对来自10个不同病毒株或物种的HSD蛋白序列进行的比较分析显示,LCDV-C与淋巴囊肿病毒代表株(LCDV-1)的HSD氨基酸同源性最高,为60.5%。对LCDV-CHSD的二级结构进行了预测,有亲水区5个,抗原区、α螺旋区和β折叠区各有6个。经密度排列界面(densealignmentsurface,DAS)的方法预测,表明LCDV-CHSD有一个跨膜结构域。

牙鲆淋巴囊肿病的PCR诊断方法研究

以中国养殖牙鲆 (Paralichthysolivaceus)淋巴囊肿病毒 (Lymphocystisdiseasevirus,LCDVcn)主要衣壳蛋白 (majorcapsidprotein ,MCP)基因的中间保守序列为目标基因 ,设计了一对特异性引物。该引物可扩增出 172bp的病毒DNA片段 ,其最小DNA检出量为 0 0 183ng。用PCR法从人工感染淋巴囊肿病毒 3天的牙鲆血、鳃、肝、脾、肠、胃及自然发病牙鲆的肿瘤中 ,分别检测到了LCDV的存在。本实验结果证明 ,PCR法对于早期检测LCDV是十分有效的。

姬松茸提取物组分体外抗病毒感染活性的研究

为了探明姬松茸提取物的体外抗病毒感染活性及其作用方式,进而为水产养殖鱼类高效抗淋巴囊肿病毒(lym-phocystis disease virus,LCDV)感染活性物质的开发和鲆蝶类淋巴囊肿病的防治奠定基础,利用热水浸提和酒精沉淀法得到了5种姬松茸提取物组分(E1～5),并利用MTT、细胞病变程度观察等方法研究了5种组分对LCDV感染体外培养大菱鲆鳍细胞(turbot fin cells,TF细胞)的影响作用。细胞毒性实验结果显示,5种组分对体外培养TF细胞均无毒性。细胞病变程度结果表明,本文所得5种姬松茸提取物组分尤其是E5组分具有显著的抗LCDV感染TF细胞的活性。不同方式感染的实验结果进一步显示,5种姬松茸提取物组分抗LCDV感染TF细胞的作用可能主要是通过直接灭活病毒和/或阻断病毒吸附细胞来实现的。

淋巴囊肿病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

根据淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守序列,利用PrimerExplorer 3软件设计了5条引物,对LAMP反应温度和反应时间等参数进行了优化。与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒等其它虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都没有交叉反应。将LAMP检测方法与常规PCR进行灵敏度的比较分析,结果显示LAMP的检测灵敏度约为15 fg,比常规PCR灵敏度高一个数量级。该方法检测时间短,在1 h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明12尾外观有淋巴囊肿病症状的牙鲆样品中都含有淋巴囊肿病毒,而10尾外观正常牙鲆鱼苗则没有检测到淋巴囊肿病毒(与预期结果一致),说明LAMP方法比较适合淋巴囊肿病毒的早期及现场诊断。

淋巴囊肿病毒中国分离株基因组序列和结构分析

LCDV-cn是分离自中国养殖牙鲆的淋巴囊肿病病原,给中国牙鲆养殖业带来了严重危害。通过PCR、克隆和测序,获得了LCDV-cn部分基因的序列,证明LCDV-cn与LCDV-C的基因组序列是一致的。比较基因组学分析发现,LCDV-cn基因组中有137个ORF是其独有的、与LCDV-1及其它虹彩病毒无同源区域。对LCDV-cn基因组进行生物信息学分析发现,在LCDV-cn独有的ORF中,有的编码与宿主同源的蛋白,有的编码与DNA复制相关的蛋白,某些ORF编码的蛋白含有跨膜区等。LCDV-cn的独有基因或许对其毒力和宿主范围有关。

军曹鱼淋巴囊肿病毒的系统关系研究及基因型分析

从患淋巴囊肿病的养殖军曹鱼肿瘤中分离到一种虹彩病毒,命名为淋巴囊肿病毒军曹鱼分离株（LCDV-rc）。为探讨LCDV-rc的系统地位,从DNA水平上分析了该病毒株与淋巴囊肿病毒中国牙鲆分离株（LCDV-cn）、淋巴囊肿病毒韩国鲈鱼分离株（LCDV-sb）、淋巴囊肿病毒日本牙鲆分离株（LCDV-jf）、淋巴囊肿病毒欧洲分离株（LCDV-1）和淋巴囊肿病毒日本岩鱼分离株（LCDV-rf）的系统关系。以核衣壳蛋白（MCP）基因为分子标记,通过PCR扩增和克隆测序获得了长度为1356bp的含178个信息位点的mcp基因序列;用最大简约法、最大似然法、邻接法和Bayesian法构建了分子系统树并进行了置信度检验。结果表明,构建的淋巴囊肿病毒ML、NJ、MP和Bayesian系统树的拓扑结构一致,LCDV-rc和LCDV-sb聚为一支,LCDV-cn和LCDV-jf聚为一支,LCDV-1和LCDV-rf分别各为一支。在35种虹彩病毒的系统关系分析中,LCDV-rc与另5株淋巴囊肿病毒在系统树上聚为一大支,说明LCDV-rc与淋巴囊肿病毒的关系近于其他虹彩病毒。根据遗传距离和系统关系分析认为,LCDV-rc属于一种新的基因型,称其为淋巴囊肿病毒Ⅳ型基因型。

鱼淋巴囊肿病毒研究进展

淋巴囊肿病毒是最早发现的鱼类病毒,广泛分布于世界各地的淡水、盐水和海水中,可感染140种以上鱼类,危害巨大。本文对该病毒的形态结构特征、化学组成和理化特性、基因组及编码多肽、细胞培养特性和该病的致病机理、传播方式、诊断防治等方面进行了综述。

牙鲆淋巴囊肿病毒一抗原蛋白的确认及定位

以牙鲆淋巴囊肿病毒(LCDV)为抗原免疫Balb/c小鼠,而后将小鼠脾细胞与P3U1骨髓瘤细胞融合,以囊肿组织冰冻切片的免疫荧光染色筛选杂交瘤细胞,阳性结果显示特异性块状荧光信号集中在囊肿细胞的细胞质边缘部分,且多个荧光信号相连呈现链圈状,有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞,三次克隆后获得4株稳定产生抗LCDV抗体的单克隆杂交瘤细胞株(1A8、1D72、B6、2D11)。应用Western blotting法分析单抗识别蛋白的分子量,结果显示,单抗1D7和2B6均能特异性结合一条分子量116kD病毒多肽;应用免疫电镜技术定位单抗识别的抗原决定簇,结果发现胶体金颗粒集中吸附在病毒粒子衣壳周围,且背景清洁,无散在的金颗粒或其他污染物。实验结果说明分子量约为116kD的蛋白多肽为LCDV病毒衣壳蛋白,且具有线性抗原决定簇。

牙鲆淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因片段真核表达载体的构建、表达与免疫效果评价

用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白（MCP）0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将重组质粒转染入牙鲆鳃细胞系FEC,并进行瞬时表达.通过荧光显微镜观察和特异性RT-PCR检测,证实重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6kb已成功转染到FEC细胞,并得到了初步表达.将重组质粒肌注入牙鲆体内,检测牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾和淋巴细胞的增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.结果表明,构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6可诱导牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫,具有明显的免疫保护作用.

牙鲆淋巴囊肿病毒纯化及不同来源病毒免疫特性比较

比较了3种不同的牙鲆淋巴囊肿病毒纯化方法,优化后的方法如下:剥离囊肿表面薄膜,收集内容物,匀浆后再用超声波细胞破碎仪破碎,反复冻融,650×g、1800×g差速离心,30%(W/W)蔗糖垫底超速离心(78500×g)浓缩病毒,最后蔗糖密度梯度超速离心(78500×g)纯化病毒。电镜观察发现,出现在47%～52%蔗糖密度区域的病毒带含有多量、纯净和结构一致的病毒粒子。此外,利用制备的兔抗血清对不同地区的病毒进行了免疫特性分析,Westernblotting检测显示来自威海、青岛及秦皇岛3个地区的淋巴囊肿病毒反应结果是一致的,均有3条蛋白带发生反应,其分子量分别为125、66和55kDa。

牙鲆淋巴囊肿病毒靶器官上病毒结合蛋白的鉴定

利用抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的间接免疫荧光检测技术,在患淋巴囊肿病牙鲆的表皮、鳃、胃、肠及肾中发现淋巴囊肿病毒的感染,以此确定为病毒感染的主要靶器官。用NP-40细胞裂解液分别抽提靶器官的总蛋白,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)对靶器官上淋巴囊肿病毒结合蛋白进行鉴定,结果显示在胃、肠及肾的组织蛋白中均有1个分子量为27.8 kDa的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合,在鳃和表皮的组织蛋白中分别存在分子量为37.6 kDa和56.0 kDa的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合。推测在淋巴囊肿病毒靶器官上的这3种病毒结合蛋白有可能是病毒的受体蛋白。

病毒铺膜印迹技术分离牙鲆鳃细胞上的淋巴囊肿病毒结合蛋白

利用非变性电泳与病毒铺膜印迹技术(VOPBA)分离了牙鲆(Paralichthys olivaceus)鳃细胞(FG)上淋巴囊肿病毒结合蛋白,结果显示在FG细胞膜上有分子量为135 kD的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合;对该蛋白切胶回收后进行SDS-PAGE与双向电泳,发现135 kD蛋白由3个蛋白组成,分子量分别为58.3 kD、44.6 kD及37.6 kD;135 kD蛋白SDS-PAGE的VOPBA显示,仅出现37.6 kD的蛋白带,而58.3 kD、44.6 kD蛋白皆不与淋巴囊肿病毒结合。结果表明牙鲆FG细胞上135 kD蛋白是淋巴囊肿病毒的结合蛋白,其37.6 kD蛋白具有病毒结合活性。