紫苏溶血磷脂酰转移酶基因PfLPAAT的克隆及功能研究

溶血磷脂酰转移酶(Lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAAT)是植物甘油三酯生物合成的关键酶,通过研究紫苏LPAAT基因(PfLPAAT)在油脂积累过程中的功能,为揭示植物油脂积累的分子机制提供参考。本研究利用RT-PCR法获得PfLPAAT,采用生物信息学方法分析PfLPAAT的推定蛋白的基本理化性质、跨膜结构域和亚细胞定位等,并进行同源蛋白的系统发育分析。使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对PfLPAAT在紫苏不同组织及种子不同发育时期的表达水平进行了分析。构建植物表达载体pCAMBIA1303-PfLPAAT,通过花序侵染法转化拟南芥,并对转基因拟南芥种子的含油量及脂肪酸组成进行分析。结果表明PfLPAAT序列长度为1149 bp,编码382个氨基酸,推定蛋白的理论等电点为9.60,分子质量为43.02 kD。生物信息学分析表明,PfLPAAT蛋白在内质网行使功能,属于PLN02380超家族。qRT-PCR表明,PfLPAAT在紫苏的各组织中均有表达,其中在叶片和开花后15 d的种子中达到最高水平。与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥种子含油量增加2.04%~13.40%。脂肪酸组成分析结果表明,油酸、亚油酸、亚麻酸和花生一烯酸的含量显著增加,棕榈酸、硬脂酸、花生酸、花生二烯酸和芥酸含量降低。紫苏PfLPAAT的过表达不仅可以提高拟南芥种子含油量,还可以不同程度地提高油脂中不饱和脂肪酸的含量。本研究结果为油料作物紫苏的种质资源挖掘和创新利用提供了新颖候选基因。

水稻溶血磷脂酸酰基转移酶基因(LPAT)家族生物信息学分析及在籽粒油脂合成中的作用

【目的】挖掘水稻溶血磷脂酸酰基转移酶(Lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAT)基因家族成员信息,分析其生物信息学特征及在水稻籽粒油脂合成中的作用。【方法】通过生物信息学分析,对OsLPAT基因家族进行基因结构、系统进化树、组织表达谱以及激素和逆境表达谱等分析。利用比较代谢组和转录组学的方法,分析OsLPAT家族各成员在水稻籽粒油脂合成中的作用。【结果】水稻基因组中LPAT家族包含5个成员,分别命名为OsLPAT1~OsLPAT5。除OsLPAT1外,其他成员均含有4~6个外显子,且各成员均包含Acyltransferase C-terminus(PF01553)结构域;进化分析显示,LPAT基因在单子叶植物中较为保守;OsLPAT2的表达受多种逆境条件及激素诱导,OsLPAT3和OsLPAT5的表达受到脱落酸(Abscisic acid,ABA)的强烈诱导,而OsLPAT4则特异性地受到渗透胁迫的诱导;比较代谢组和转录组学分析显示,OsLPAT家族各成员分别在籽粒发育的不同阶段发挥功能,从而促进油脂(Triacylglycerol,TAG)合成。【结论】水稻基因组中存在5个LPAT基因,其表达受到不同激素的诱导,可能在水稻激素响应过程中发挥作用。该家族成员参与了不同发育阶段籽粒中的油脂前体磷脂酸(Phosphatidic acid,PA)的合成,从而正调控籽粒中的油脂合成。

花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆与表达分析

溶血磷脂酰基转移酶(LPAT)是植物油脂合成途径的一个关键酶,在植物油脂品质改良和提高种子含油量方面具有重要的应用价值。本研究通过构建花生种子全长cDNA文库,结合大规模EST测序和功能注释,从花生中克隆了溶血磷脂酸酰基转移酶基因,命名为AhLPAT。该基因cDNA全长1629bp,对应的基因组序列5531bp,由11个外显子和10个内含子组成,内含子剪接方式符合GT-AG剪接规则。根据编码区预测AhLPAT编码一条387个氨基酸组成的多肽,预测分子量为43.2kD,等电点为9.42。AhLPAT蛋白含有一个典型的酰基转移酶保守功能结构域以及溶血磷脂酰基转移酶相似的保守区域。该蛋白的氨基酸序列与已报道的其他物种LPAT蛋白序列有较高的一致性。AhLPAT与旱金莲、油菜、海甘蓝、蓖麻和拟南芥的LPAT蛋白氨基酸相似性依次为90%、89%、89%、88%和87%。系统进化分析表明,AhLPAT与拟南芥AtLPAT2亲缘关系较近,且同属于内质网型LPAT蛋白。RT-PCR分析表明,AhLPAT基因在花生根、茎、叶、花、果针和种子中均有表达,在花生开花后50～60d,果针和种子中的表达量最高,且AhLPAT的表达量与花生种子含油量积累速率变化一致,二者显著相关(r=0.63,P<0.05)。推测AhLPAT基因在花生种子油脂合成中起重要作用。

溶血磷脂酸酰基转移酶β与肿瘤关系研究进展

磷脂酸(PA)是一种多功能的生物活性磷脂。研究证实:溶血磷脂酸酰基转移酶β(lysophosphatidic acidacyltransferaseβ,LPAATβ)催化溶血磷脂酸(LPA)产生的PA与肿瘤细胞内多种信号途径的活化有关,参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭、呼吸爆发及细胞因子表达释放。LPAATβ在肿瘤组织中的表达显著增加以及抑制LPAATβ表达在体内外抗肿瘤(实体瘤和血液肿瘤)的作用研究取得的效果,提示以LPAATβ为靶点对肿瘤进行干预将成为重要的抗肿瘤治疗策略之一。本文就溶血磷脂酸酰基转移酶β与肿瘤治疗的相关基础及临床前研究进行综述。

椰子溶磷脂酸酰基转移酶基因克隆及农杆菌介导甘蓝型油菜的遗传转化

月桂酸是在清洁用品和医药产品中有重要用途的中链脂肪酸。椰子中富含月桂酸特异的溶磷脂酸酰基转移酶基因,克隆该基因在油菜中表达若可获得含月桂酸的油菜新种质,将具有良好的应用价值。为获得脂肪酸成分改良的油菜种质资源,从椰子胚乳中克隆出该基因并构建35S驱动的植物表达载体,通过农杆菌介导法转化油菜子叶柄,在获得的约20株的转化苗中已鉴定有6株转化植株。

三个花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆与序列分析

溶血磷脂酸酰基转移酶在植物油脂合成途径中具有重要的作用。本研究通过构建花生种子全长cDNA文库,结合大规模EST测序和RACE克隆等方法,从花生中克隆得到了三个LPAT基因,分别命名为AhLPAT2,AhLPAT4和AhLPAT5。其中AhLPAT2全长为1626bp,ORF为1164bp,理论分子量为43.2kD,理论等电点为9.42;AhLPAT4全长为1618bp,ORF为1152bp,理论分子量为43.9kD,理论等电点为9.23;AhLPAT5全长为1911bp,ORF为1137bp,理论分子量为43.7kD,理论等电点为8.99。它们推导的氨基酸序列与拟南芥的同源性依次为78%,65%和65%;与大豆的同源性分别是82%,80%和82%。将这三个基因在GenBank上注册,注册号分别为JN032677,KC160499,KC160500。

CGI-58在动物脂类代谢中的作用

细胞中脂滴(Lipid droplets,LDs)表面存在多个调控脂肪储存和分解的蛋白,这些蛋白对机体的脂肪代谢起着很重要的调控作用。CGI-58(Comparative gene identification-58)分布在LDs表面,属于α/β水解酶折叠家族,是脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase,ATGL)和依赖酰基辅酶A溶血磷脂酸酰基转移酶(Lyso-phosphatidic acid acyltransferase,LPAAT)的激活剂。在脂肪分解过程中,CGI-58结合PAT蛋白家族成员之一的脂滴包被蛋白(Perlipin)和ATGL,促进脂肪分解,同时CGI-58对ATGL的激活功能受脂滴包被蛋白家族成员间蛋白质与蛋白质相互作用的影响。文章结合国内外研究热点,针对CGI-58在动物脂类代谢中的作用进行了综述。

花生及其野生种质溶血磷脂酸酰基转移酶基因(LPAAT)的克隆及序列分析

溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)是植物种子油脂合成的关键酶。本研究从花生(Arachis hypogaea L.)栽培品种花育32号和4个花生区组二倍体野生种中克隆得到编码LPAAT的基因序列。从花育32号获得的两条cDNA序列rlpaat-1和rlpaat-2开放阅读框均为1 131 bp,编码376个氨基酸,二者存在11个SNP差异位点,编码的氨基酸序列LPAAT-1和LPAAT-2有1个氨基酸残基的差异。LPAAT蛋白具有典型的酰基转移酶功能结构域以及4个保守氨基酸基序。之后从花育32号得到两条DNA序列,glpaat-1和glpaat-2长度分别为3 729 bp和3 736 bp,均由12个外显子和11个内含子组成,二者共存在37处碱基差异,其中34处为SNP位点。4个花生区组二倍体野生种各获得一条LPAAT序列,A.correntina,A.duranensis,A.batizocoi和A.ipaensis LPAAT的序列长度分别为3 757 bp、3 757 bp、3 742 bp和3 756 bp。核苷酸序列多态性和系统进化树分析表明,栽培品种LPAAT的两条序列glpaat-2与glpaat-1分别来自A、B染色体组。

拟南芥异源表达紫斑牡丹PrLPAAT1对种子脂肪酸含量的影响

克隆得到的紫斑牡丹(Paeonia rockii)脂肪酸代谢相关基因PrLPAAT1,构建2S2::PrLPAAT1过表达载体并利用花序浸染法转化拟南芥,通过潮霉素抗性筛选以及PCR检测得到3个T3代纯合转基因拟南芥株系L1OX-11、L1OX-17和L1OX-19。半定量RT-PCR证明PrLPAAT1在3个转基因拟南芥株系中均显著表达。与野生型相比,过表达PrLPAAT1拟南芥的单株种子产量未产生明显变化。GC–MS测定结果表明,L1OX-11、L1OX-17和L1OX-19株系的总脂肪酸含量较野生型分别为无显著差异和提高了5.3%和5.2%;油酸(C18:1)含量分别提高了19.9%、24.6%和19.4%。实时荧光定量PCR分析表明,过表达PrLPAAT1拟南芥中油脂合成相关基因AtACP1、AtDGAT1和AtSUS3的表达水平均显著增加。由此推测PrLPAAT1在牡丹种子的脂肪酸合成过程中发挥重要的作用。

二酰甘油从头合成途径的关键酶及其功能

二酰甘油(diacylglycerol, DAG)是脂代谢,包括储存三酰甘油和膜脂代谢中的一个重要中间体。多条途径可以合成DAG,如磷脂酶C水解膜脂产生DAG等,但是本文主要概述从头合成的Kennedy途径。这条途径中,主要由甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶等催化完成。我们将综述这三类酶的基因及其功能,着重介绍它们在油脂合成、抗逆和发育信号方面的研究进展。

甘油-3-磷酸酰基转移酶在植物脂质代谢、生长及逆境反应中的作用

甘油脂质是高等植物中含量最丰富的脂质,其种类包括磷脂、糖脂、油脂及胞外脂质等,广泛参与不同的生物过程。甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)利用各种脂肪族酰基或其衍生物作为底物催化甘油-3-磷酸(G3P)脂酰基化反应形成溶血磷脂酸(LPA),是脂质合成代谢途径中的限速酶。植物GPAT家族含有多个成员,根据其亚细胞定位、酶活性及底物选择性,拟南芥GPAT家族10个成员可分为3类。不同的GPAT具有独特的分子结构、活性调控及时空分布,并参与膜磷脂、甘油三脂、角质及软木脂合成代谢过程。研究表明极具分子异质性的GPAT在植物生长、发育和逆境胁迫反应过程中发挥着重要作用。

紫苏溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆与功能分析

紫苏(Perillafrutescens)是一种重要食药同源油料作物,种子含油量高达46%-58%,其中α-亚麻酸(C18:3)含量占60%以上。溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophosphatidicacid acyltransferase, LPAT)是植物种子三酰基甘油组装过程中的一类关键限速酶。本研究从紫苏发育种子中克隆了其编码基因(PfLPAT2),并利用qRT-PCR技术检测PfLPAT2基因在紫苏不同组织及不同发育时期种子的表达特性。构建PfLPAT2/GFP融合表达载体并通过农杆菌介导瞬时侵染本氏烟草叶片,检测PfLPAT2蛋白的亚细胞定位。构建大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体、酵母表达载体和组成型植物过表达载体,分别转化大肠杆菌突变株SM2-1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)野生型菌株INVSc1和普通烟草(Nicotiana tabacum),分析PfLPAT2蛋白的酶活性及生物学功能。结果表明,紫苏PfLPAT2基因ORF为1 155 bp,编码384个氨基酸。功能结构域预测显示PfLPAT2蛋白具有溶血磷脂酸酰基转移酶典型的保守区。PfLPAT2基因在紫苏根、茎、叶、花和开花后10、20、30、40 d的种子中均有表达,且在开花后20 d的种子中高表达。亚细胞定位结果显示PfLPAT2蛋白定位于细胞质。大肠杆菌功能互补测试表明,PfLPAT2可恢复SM2-1细胞膜脂生物合成,具有LPAT酶活性。与非转基因对照相比,转PfLPAT2基因酵母的总油脂含量显著提高,且脂肪酸各组分的含量发生改变,油酸(C18:1)含量增加明显,预示PfLPAT2对C18:1具有较高的底物偏好性。转基因烟草叶片总脂肪酸含量比对照组提高了约0.42倍,C18:1含量增加了约1倍。转基因株系总脂提高和脂肪酸组分的改变表明PfLPAT2异源表达可以促进宿主油脂合成和健康有益型脂肪酸(C18:1和C18:3)的积累。本研究为深入解析紫苏油脂特别是不饱和脂肪酸合成的分子调控机制和改良油料作物油脂品质提供理论依据和基因元件。