pNEgr-mIL-12真核表达载体的体外和体内生物学活性检测

肿瘤的基因 放射治疗是近年来发展起来的新技术 .分别于体外和体内检测含辐射敏感启动子和mIL 12基因的真核表达载体 (pNEgr mIL 12 )的生物学活性 .体外经酶联免疫吸附试验 (enzymelinkedimmunosorbentassay ,ELISA)法检测转染 pNEgr mIL 12重组质粒的COS 7和B16细胞可经辐射诱导mIL 12p70表达 ,于 1 5～ 2 0Gy照射后表达增高最明显 ,COS 7细胞于照后4h达峰值 ,B16细胞的表达水平随照射后时间延长而逐渐增高 ;pNEgr mIL 12重组质粒联合电离辐射治疗小鼠移植肿瘤 ,单次或多次注射pNEgr mIL 12重组质粒 ,联合局部照射能够抑制小鼠移植肿瘤生长 ,与单纯照射组比较肿瘤生长速度减慢 ,瘤重降低 ,尤以多次给予质粒治疗组效果明显 .

mIL-12重组逆转录病毒载体的构建及包装细胞系的建立

目的:构建mIL-12重组逆转录病毒载体。方法:将mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒。结果:重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞后的上清感染NIH3T3细胞后,经共聚焦显微镜能观察到融合蛋白的表达。结论:包装细胞上清中有含mIL-12 DNA的重组逆转录病毒,mIL-12重组逆转录病毒可感染NIH3T3细胞并在细胞中进行有效的复制。

mIL-12质粒对哮喘模型抑制性细胞因子的影响

目的研究小鼠白介素12(mIL-12)基因表达质粒对小鼠支气管哮喘模型抑制性细胞因子TGF-β、IL-10以及Th2相关细胞因子IL-4和IL-5等的影响,并探讨其可能机制。方法卵白蛋白(OVA)致敏复制小鼠哮喘模型。BALB/c小鼠48只,随机分为8组,每组6只。8组小鼠分别是哮喘模型组、正常对照组、模型对照组、阳性药对照组、空质粒预防对照组、空质粒治疗对照组、mIL-12质粒预防组和mIL-12质粒治疗组。末次雾化处理24 h后,测定所有小鼠支气管-肺泡灌洗液(BALF)中TGF-β、IL-10、IL-4、IL-5水平以及血清中TGF-β、IL-10水平。结果①哮喘模型组BALF中的TGF-β、IL-10、IL-4和IL-5等各细胞因子水平明显高于正常对照组和模型对照组(P<0.05)。而mIL-12质粒预防组和mIL-12质粒治疗组BALF中的TGF-β、IL-10、IL-4和IL-5等各细胞因子水平则明显低于哮喘模型组(P<0.05)。②血清中的TGF-β和IL-10水平各组之间差异无统计学意义。结论 TGF-β、IL-10、IL-4、IL-5等各细胞因子水平与哮喘的发病机制密切相关,推测mIL-12质粒可以抑制小鼠哮喘的发展,其对哮喘的治疗作用可能部分是通过抑制性细胞因子而发挥的。

mIL-12基因转染J558肿瘤细胞疫苗的抗瘤实验研究

目的 探讨mIL -12基因转染的肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤作用。方法 将鼠源性mIL -12基因转染J5 5 8细胞制备工程瘤细胞后免疫 2 0只BALB/c小鼠 ,另选 2 0只小鼠为对照组 ,用ELISA法测定J5 5 8/mIL -12瘤细胞培养上清液及对照组中mIL -12水平。经工程瘤细胞免疫的小鼠淋巴结细胞与J5 5 8肿瘤细胞共同培养后用ELLSA法测定其上清液中mIFN -γ水平。用J5 5 8瘤细胞攻击免疫小鼠及对照组小鼠以观察其存活情况。结果 J5 5 8/mIL -12瘤细胞培养上清液中mIL -12水平显著高于对照组 (895 2± 2 8 4vs 6 64± 1 5 3pg/ml,P =0 0 0 0 ) ;免疫小鼠淋巴结细胞与肿瘤细胞共同培养后上清液mIFN -γ水平显著高于对照组 (997 61±116 3 6vs 6 3 6± 1 2 7pg/ml,P =0 0 0 0 ) ;CTL细胞毒实验证实免疫小鼠CTL杀伤J5 5 8肿瘤细胞为特异性杀伤 ;特异性肿瘤保护试验显示该型瘤苗具有良好的抗瘤作用。结论 mIL -12基因转染的J5 5 8肿瘤细胞疫苗具有良好的抗瘤作用。

鼠白细胞介素12(mIL-12)在昆虫细胞中的表达

人IL-12的作用具有种属特异性,无法对鼠淋巴细胞起作用。因此,为了在啮齿动物模型上研究该细胞因子的免疫学效应,并评价其临床应用前景,就很有必要获得重组鼠IL-12(mIL-12)。为此,我们首先构建了两个表达载体pVL1393-mp40和pVL1393-mp35,并分别与线性化多角体病毒基因组DNA共转染昆虫细胞株Sf9,用目视法筛选出重组病毒AcNPV-mp40和AcNPV-mp35,然后共感染昆虫细胞,使mp40和mp35在昆虫细胞中共表达。经实时BIA和Northern blot分析,表明重组mIL-12在昆虫细胞中表达成功。经还原条件下的SDS-PAGE分析,重组mp40和mp35的分子量分别为40KDa和22KDa。非还原条件下的Western blot结果显示,重组mIL-12的表观分子量为80KDa。用抗体捕获法在条件培液中测到了重组产物的生物活性,经与参照标准相比照,重组mIL-12的表达量约为10-15μg/10~6细胞。

人IL-12在昆虫细胞中的表达及其体外生物活性的检测

目的：建立表达具有生物活性的人 Ｉ Ｌ１２ 的杆状病毒／昆虫细胞表达系统。方法：将ｐ４０ 和ｐ３５ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 一起构建入杆状病毒转移载体ｐ Ａｃ Ｕ Ｗ４２，然后与杆状病毒 Ａｃ Ｕ Ｗ １．ｌａｃ Ｚ Ｄ Ｎ Ａ 共同转染昆虫细胞 Ｓｆ９，使两者产生同源重组；随后利用病毒空斑实验筛选重组的杆状病毒，再由 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 筛选及鉴定表达 Ｉ Ｌ１２ 的重组病毒，并进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ 和体外生物活性的检测。结果：经病毒空斑试验、 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ 逐步阳性选择的 Ｉ Ｌ１２ 重组杆状病毒，其感染 Ｓｆ９ 细胞的上清与 Ｉ Ｌ１２标准品一样具备刺激正常人外周血 Ｔ 淋巴细胞增生的生物活性。结论：本研究建立了能表达具有体外生物活性的人重组 Ｉ Ｌ１２ 的杆状病毒／昆虫表达系统。

重组腺病毒AdKDR-TK联合IL-12逆转录病毒血管靶向治疗裸鼠皮下人肝癌细胞移植瘤的实验研究

目的探讨重组腺病毒AdKDR-TK联合IL-12逆转录病毒通过血管靶向治疗裸鼠皮下人肝癌细胞移植瘤的疗效及作用机制。方法 SCID小鼠腋部皮下植入1×107(0.2mL)HepG2细胞,同时腹腔注射PBL2×107(0.5mL),当瘤体达0.5cm3时,随机分成4组,分别为更昔洛韦(GCV)组(第I组)、IL-12逆转录病毒组(第Ⅱ组)、重组腺病毒AdKDR-TK组(第Ⅲ组)及重组腺病AdKDR-TK联合IL-12逆转录病毒组(第Ⅳ组)。各治疗组瘤内分别注入重组病毒液或/及重组逆转录病毒液0.1mL,第二天重复注射一次,重组腺病毒治疗在病毒给予24h后分别在腹腔内注射GCV,连续l0d;对照组腹腔内注入GCV。观察各组瘤体生长情况及免疫组化法测定肿瘤微血管密度(MVD)。结果第Ⅳ组经治疗后肿瘤的生长受到明显的抑制,其抑瘤率为62.14%,与第II组及Ⅲ组比较,后两者的抑瘤率分别为18.32%和32.73%(与第IV组比较,两者P<0.01)。肿瘤组织内的MVD,第I组为(40.1±6.7)个/mm2、第II组为(32.2±7.3)个/mm2、第III组为(27.6±7.1)个/mm2、第Ⅳ组为(7.7±4.1)个/mm2,其中第Ⅲ组与第Ⅱ组(P<0.05)、第Ⅳ组与第Ⅱ组(P<0.01)、第Ⅳ组与第Ⅲ组(P<0.01)之问的肿瘤内MVD比较均有统计学差异。结论 IL-12逆转录病毒能够增强重组腙病毒介导以KDR为启动子的胸苷激酶系统的血管靶向性地有效抑制肿瘤的生长。

小鼠白介素12质粒对哮喘模型CD4^+CD25^+T细胞的影响

目的研究小鼠白介素12(mIL-12)基因表达质粒对小鼠支气管哮喘模型CD4+CD25+T细胞的影响,并探讨其可能机制。方法卵白蛋白(OVA)致敏建立小鼠哮喘模型。BALB/c小鼠48只,随机分为8组,即哮喘模型组、正常对照组、模型对照组、阳性药对照组、空质粒预防对照组、空质粒治疗对照组、mIL-12质粒预防组和mIL-12质粒治疗组。末次雾化攻击24 h后,测定各组小鼠脾脏、外周血中CD4+CD25+T细胞百分比。结果①哮喘模型组脾脏中CD4+CD25+T细胞比例明显高于正常对照组和模型对照组(P<0.05)。②与哮喘模型组相比,mIL-12质粒预防组和mIL-12质粒治疗组脾脏中CD4+CD25+T细胞百分比则明显下降(P<0.05)。③外周血中CD4+CD25+T细胞百分比各组之间无显著性差异。结论 CD4+CD25+T细胞与哮喘的发病机制密切相关,推测肌注mIL-12质粒可以抑制哮喘的发展,从而使该细胞百分比发生改变。

准分子激光屈光性角膜切削术治疗近视眼的远期效果分析

目的 :评价准分子激光屈光性角膜切削术 (PRK)治疗不同程度近视眼的远期疗效。方法 :应用 VISX 2 0 / 2 0型准分子激光机对 2 5 8只不同程度的近视眼进行 PRK治疗 ,对 3～ 5年随访结果进行统计分析 ,按术前近视度分两组 ,A组 - 1.0 0～- 6 .0 0 D(等值球镜 ,下同 ) 116只眼 ,B组 - 6 .2 5～ - 12 .0 0 D 142只眼。 结果 :经 PRK治疗后 ,A组裸眼视力≥ 1.0占86 .2 % ,≥ 0 .5占 97.4% ,剩余屈光度为 (- 0 .36± 0 .40 ) D,95 .7%角膜已完全透明。 B组裸眼视力≥ 1.0占 5 4.9% ,≥ 0 .5占86 .6 % ,剩余屈光度为 (- 0 .6 9± 0 .6 6 ) D,85 .9%角膜已完全透明。 结论 :PRK治疗轻、中度近视安全有效 ,预测性及稳定性好 ;治疗高度及超高度近视在大多数患者可获得满意效果 ,在部分患者预测性及稳定性较差 。

变应性鼻炎豚鼠鼻粘膜组胺含量对血流量的影响

目的 :探讨变应性鼻炎豚鼠不同病程中鼻粘膜组胺含量对血流量的影响。 方法 :6 0只豚鼠随机分成正常组和致敏组 (n=30 ) ,分别检测致敏后激发前和激发后即刻 ,2 4,48,72 h豚鼠鼻粘膜中的组胺含量 ,每组动物处死前均用激光多谱勒探测仪测定其鼻粘膜血流量 ,用直线相关与回归分析比较不同时相点豚鼠鼻粘膜中的组胺含量与鼻粘膜血流量的关系。 结果 :致敏原激发前致敏组动物鼻粘膜中组胺含量和鼻粘膜血流量均明显高于正常对照组 (P<0 .0 1) ;致敏原激发即刻迅速下降至低于正常对照组 ,以后呈逐渐回升趋势 ,72 h后基本接近于激发前水平。致敏组动物鼻粘膜中组胺含量和鼻粘膜血流量呈正相关 ,相关性非常显著 (P<0 .0 0 1,r=0 .96 7)。 结论

含mIL-12基因多顺反子逆转录病毒载体构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建含小鼠白细胞介素 12双亚基及新霉素磷酸转移酶基因多顺反子逆转录病毒载体 ,并观察其在小鼠肝癌细胞中的表达。方法 利用脑心肌炎病毒 (EMCV)及脊髓灰质炎 (Polio)病毒内核糖体进入位点 (IRES) ,连接mIL 12p40及p35cDNAs和筛选基因新霉素磷酸转移酶 (NeoR) ,克隆至逆转录病毒载体pGCEN中 ,使三个基因同时受逆转录病毒载体 5′端LTR启动子控制 ,转录至同一mRNA转录本上 ,通过不同机制翻译成蛋白质 ,从而构建成多顺反子逆转录病毒载体 ,即pGCEN/mIL 12。在LipofectAMINE介导下将pGCEN/mIL 12转染包装细胞PA317,G418筛选 ,直至出现阳性克隆 ,挑取抗性克隆 ,扩大培养 ,收集上清 ,用小鼠成纤维细胞NIH3T3测定病毒滴度。然后用重组转录病毒感染小鼠肝癌细胞MM45T .Li,G418筛选 ,直至出现抗性克隆 ,扩大培养 ,对阳性克隆进行鉴定。结果 由PA317包装细胞产生的重组逆转录病毒的滴度为 5× 10 5CFU/ml,将其感染小鼠肝癌细胞MM45T .Li,后经PCR及Southernblot证明 ,外源基因已整合至小鼠肝癌细胞基因组中 ,RT PCR及Northernblot分析外源基因在mRNA水平上的表达 ,并证实mIL 12p40及p35cDNA和NeoR基因转录在同一mRNA上。ELISA显示mIL 12的表达量 48h为 10ng/ 10 6细胞。并且M45 /mIL

米力农对瓣膜置换术患者血流动力学的影响

目的 :观察风湿性心脏病患者瓣膜置换术中应用米力农对其血流动力学及预后的影响。 方法 :2 0例风湿性心脏病瓣膜置换术患者 ,随机分为 A,B两组 :A组在麻醉诱导前 10 min内给予负荷剂量米力农 30μg/ kg、继以 0 .5μg/ (kg· min)的速度微泵持续静推 ;B组以相同速度推注生理盐水。分别于给予负荷剂量米力农前、后 ,麻醉诱导后、锯胸骨后、体外循环(CPB)结束时 ,关胸前、后测取血流动力学指标 ;记录液体出入量、机械通气时间、ICU留滞及术后住院时间。 结果 :(1)应用负荷剂量米力农后 ,A组与 B组相比 :CI,L VSWI明显增加 (P<0 .0 5 ) ,PAP,CVP,SVR,PVRI下降明显 (P<0 .0 5 ) ,HR及MAP无明显变化 (P>0 .0 5 ) ;其中两组 CI,L VSWI,SVR的显著差异一直持续至 CPB结束后。 (2 ) A组 CPB前的胶体入量显著多于 B组。 (3) A组 CPB中缩血管药物用量高于 B组。结论 :应用负荷剂量米力农可明显增加心脏指数和左心室收缩功指数 ,同时可降低肺动脉压和心脏的前后负荷 。

部分液体通气对大鼠内毒素肺损伤的治疗作用

目的 :探索部分液体通气对内毒素急性肺损伤的治疗效果。方法 :16只 SD大鼠经颈静脉注射内毒素制成急性肺损伤模型后 ,随机分为两组 :急性肺损伤 (AL I)组和部分液体通气 (PL V)组。所有动物行机械通气 ,PL V组在注射内毒素 30 min后经气管插管给予氟碳液 ,剂量 10 ml/ kg,造成 AL I,在 6 h内测定血气、血流动力学和外周血白细胞计数 ,实验结束后取肺作病理检查。结果 :两组对循环功能无明显影响 ,PL V可改善内毒素引起的 Pa O2 和 p H下降 ,病理显示部分液体通气时肺间质及肺泡毛细血管扩张不明显 ,仅有少量的炎性细胞浸润。结论 :急性肺损伤的大鼠行部分液体通气能够显著改善气体交换 。

HBx和mIL-12双基因重组腺病毒的构建

目的构建携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12。方法采用酶切、连接的方法分别将基因HBx和mIL-12连接到穿梭质粒载体pAdenoVator-CMV5。将构建正确的穿梭质粒pAdV-HBx-mIL-12经EcoRⅠ酶切线性化后,转化于含腺病毒骨架质粒pAdenoVatorΔE1/E3的BJ5183感受态细菌,实现细菌内同源重组。将鉴定正确的重组腺病毒质粒pAd-HBx-mIL-12经PacⅠ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞,包装并扩增获得携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12。结果经鉴定携带HBx和mIL-12双基因的重组腺病毒构建成功,并可在293细胞中有效表达。结论成功构建了携带双基因HBx和mIL-12的重组腺病毒Ad-HBx-mIL-12,为探讨其联合抗肿瘤机制及后续基因治疗奠定了基础。

鼠白细胞介素12质粒对小鼠支气管哮喘模型气道炎症及细胞因子的影响

目的 研究鼠白细胞介素 12 (IL 12 )基因表达 (mIL 12 )质粒对小鼠支气管哮喘 (简称哮喘 )模型气道炎症及细胞因子的影响 ,并分析其作用机制。方法 卵白蛋白 (OVA)致敏建立小鼠哮喘模型。BALB/c小鼠 4 1只 ,分为 6组。即哮喘模型组 (A组 ) 8只 :OVA致敏 +OVA气雾攻击 ;模型对照组 (B组 ) 6只 :用生理盐水代替 1%OVA溶液雾化 ,余处理同A组 ;mIL 12质粒预防组 (C组 ) 8只 :实验第 1、3、5天各肌肉注射mIL 12质粒 10 0 μg ;mIL 12质粒治疗组 (D组 ) 8只 :实验第 14、16、18天各肌肉注射mIL 12质粒 10 0 μg ;空质粒预防组 (E组 ) 5只 :实验第 1、3、5天各肌肉注射空质粒 10 0 μg ;空质粒治疗组 (F组 ) 6只 :实验第 14、16、18天各肌肉注射空质粒 10 0 μg。测定所有小鼠支气管 肺泡灌洗液 (BALF)中的嗜酸粒细胞 (EOS)个数和IL 4、IL 5、γ干扰素 (IFN γ)水平。结果B组小鼠EOS个数和IL 4、IL 5、IFN γ浓度分别为 (0 0 1± 0 0 3)× 10 8/L、(2 4± 4 ) pg/ml、(33± 6 ) pg/ml、(72 5± 5 9) pg/ml,C组为 (0 0 6± 0 0 4 )× 10 8/L、(43± 13) pg/ml、(6 3± 10 )pg/ml、(6 2 6± 6 0 ) pg/ml,D组为 (0 11± 0 12 )× 10 8/L、(38± 14 )pg/ml、(6 6± 14 ) pg/ml、(6 6 1± 4 0 ) pg/ml,与A?