不同相对分子质量mPEG-SPA修饰血小板CD42a效果差异分析

目的观察mPEG-SPA对血小板抗原的修饰效果,并比较不同相对分子质量的mPEG-SPA修饰效果有无差别。方法分别用相对分子质量为5000、20000的mPEG-SPA对血小板CD42a进行化学修饰;流式法检测修饰前后CD42a荧光强度变化;模拟CD42a三维空间结构,分析赖氨酸区域在CD42a的分布情况。结果经5000和20000的mPEG-SPA修饰后,CD42a荧光强度与对照组相比明显降低,降低比例分别为85.54%和88.65%。CD42a分子表面表达多个赖氨酸区域。结论5000和20000的mPEG-SPA对血小板CD42a均具有良好的化学修饰作用,20000的mPEG-SPA修饰效果优于5000mPEG-SPA的修饰效果。

mPEG-SPA修饰人红细胞RhD血型抗原的研究

目的观察mPEG-SPA(甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯)对人红细胞RhD血型抗原修饰的效果,并探讨mPEG-SPA修饰的可行性。方法采用mPEG-SPA修饰人红细胞血型RhD抗原,并观察其对红细胞形态、结构和功能的影响。结果 2.0 mmol/L的mPEG-SPA在pH8.0室温条件下可有效遮蔽红细胞表面RhD抗原,且与红细胞结合牢固,对红细胞的形态、渗透脆性、自身溶血率、红细胞膜胆固醇含量、乙酰胆碱酯酶活性、Na+-K+ATP酶活性、2,3-DPG含量、血沉值、变形指数和常规指标均无明显影响。结论采用2.0 mmol/L mPEG-SPA遮蔽人红细胞RhD抗原获得了初步成功。

血小板经mPEG-SPA化学修饰后的效果研究

目的观察mPEG-SPA化学修饰血小板表面抗原的修饰效果,及修饰对血小板寿命、血小板凋亡的影响。方法用mPEG-SPA对血小板进行化学修饰;流式法检测修饰前后血小板CD42a及PS荧光强度变化;体外保存血小板检测其寿命。结果经mPEG-SPA修饰后,血小板CD42a表达率由修饰前的(13.48±2.92)%降至修饰后的(5.03±1.68)%;血小板死亡率及PS表达率随保存时间延长而升高,但修饰前后差异无统计学意义。结论mPEG-SPA可有效修饰遮蔽血小板表面抗原,并对血小板寿命、血小板凋亡无显著影响。

mPEG修饰红细胞解决AIHA患者配血困难的体外研究

目的探讨mPEG-SPA修饰对红细胞结构功能的影响,以及修饰O型红细胞解决AI HA患者疑难配血的可能性。方法对比2.0mmol/L mPEG-SPA修饰前后RBC保存期内的结构和功能指标,采用抗球蛋白法对比修饰前后的配血结果,采用流式细胞术观察mPEG-SPA修饰对自身抗体的遮蔽效果。结果保存期内2.0mmol/LmPEG-SPA修饰RBC对其结构功能无影响,配血结果表明2.0mmol/L mPEG-SPA修饰的RBC符合临床用血要求,流式检测结果显示mPEG-SPA修饰对自身抗体有很好的遮蔽效果。结论mPEG修饰RBC有可能为解决AI HA患者配血困难开辟一条实用有效途径。

mPEG修饰红细胞的动物实验

本研究采用异硫氰酸荧光素标记鼠、猕猴、猪和人的修饰与未修饰自体和异体红细胞(RBC)并给小鼠和猕猴实施输注,观察回输体内RBC24小时存活率的变化和差异。结果发现未修饰小鼠RBC在小鼠体内24小时存活率为74%,2.0mmol/LmPEG-SPA修饰的小鼠RBC在小鼠体内24小时存活率为45%,两者间有显著差异;未修饰人RBC在小鼠体内24小时存活率为8%,2.0mmol/LmPEG-SPA修饰人RBC在小鼠体内24小时存活率为5%,两者间无显著差异。修饰的猕猴RBC自体回输后24小时的存活率大于90%,而修饰的人RBC和猪RBC在给猕猴回输后2小时其存活率已降至零。结论RBC标记方法及不同种实验小鼠的选择对小鼠实验结果影响不大,但mPEG种类和浓度对鼠RBC寿命的有一定程度影响。用鼠RBC做自体回输来评价mPEG修饰人RBC的中mPEG是否影响人红细胞的寿命是不可靠的,修饰人RBC回输给小鼠可以作为评价修饰人RBC寿命和安全性的动物模型。大哺乳动物异种RBC输注很难观察到修饰RBC的存活率和寿命长短。适合评价修饰人RBC寿命和安全性的大动物模型有待于进一步探索。

mPEG修饰对保存期内红细胞结构和功能的影响

目的:用mPEG-SPA(20kD、2mmol/L)修饰红细胞悬液,对修饰前后的红细胞结构功能和保存期进行分析、研究,以验证是否符合临床用血的要求。方法:分别将4种血型的红细胞悬液,用mPEG-SPA修饰,将修饰前和修饰后红细胞标本按成分血储存要求储存,并分别在保存期的1、7、14、21、28、35d检测红细胞的PH值、K+浓度、Na+浓度、渗透脆性、血浆游离血红蛋白、乙酰胆碱酯酶活性、ATP含量、2,3-DPG含量、氧饱和度(P50)含量。结果:修饰对保存红细胞乙酰胆碱酯酶活性的含量无影响,修饰后红细胞悬液PH值、2,3-DPG含量在14d内正常、ATP含量在21d内正常,修饰后红细胞悬液的K+浓度保持低值达35d,修饰后红细胞悬液的Na+浓度、红细胞携氧能力、红细胞渗透脆性28d内正常,但血浆游离血红蛋白的含量在保存过程中增高。结论:mPEG修饰红细胞的大部分结构、功能指标在一定的保存期内可维持正常,但血浆游离血红蛋白含量超较高,这为进一步研究mPEG修饰红细胞用于临床打下了基础。

聚乙二醇修饰重组溶葡球菌酶的初步研究

目的:探讨聚乙二醇(PEG)修饰重组溶葡球菌酶(lysostaphin)的反应条件以及修饰后产物的纯化方法。方法:采用超声波细胞粉碎机进行菌体破碎,阳离子交换层析、疏水层析进行蛋白纯化;在不同条件下,将活化的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)与纯化后的lysostaphin反应,以单个PEG-Lysostaphin的比例为指标,用SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS方法确定其在修饰产物中的所占比例;采用Sephacryl S-200分子筛凝胶层析法对修饰产物进行分离纯化。结果:mPEG-SPA修饰lysostaphin的反应条件为pH 8.0,温度4℃,lysostaphin与mPEG-SPA的质量比为1∶5,反应时间2.0h;反应产物经一步Sephacryl S-200分子筛凝胶层析纯化后,初步实现分离。结论:初步确定了聚乙二醇修饰lysostaphin的反应条件及修饰产物的纯化方法。