抗菌肽Magainin基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽magainin基因片段 ,合成片段拼接后 ,与pUC19重组 ,获得magainin基因 .Magainin基因与酵母表达载体pPIC3重组 ,构建胞内表达载体pPIC3 Mag ,电击法转化GS115宿主菌 ,经表型筛选和PCR鉴定证实了目的基因已稳定整合入Pichiapastoris酵母基因组中 .阳性克隆用甲醇诱导表达 ,用免疫印迹法确定了产物的正确性 .

抗菌肽MagaininⅡ基因的克隆及其在E.coli BLP中的融合表达

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽MagaininⅡ基因,定向克隆至表达载体pET 28a,将构建的重组质粒pET 28a-Mag转化至E.coliBLP,Amp抗性筛选的阳性克隆用IPTG诱导融合表达。利用Tricine-SDS-PAGE确定了产物的正确性,利用琼脂孔穴扩散法证明表达产物具有抗菌活性。

抗菌肽Magainin Ⅱ的原核表达与抗菌活性分析

根据Magainin Ⅱ氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,化学合成了2个DNA片段,利用重叠区互补PCR法得到Magainin Ⅱ的基因序列。构建了融合表达载体pET21b-Magainin Ⅱ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,在5.1 kD处可见目的蛋白条带,经Western blot检测表明成功地在大肠杆菌中表达了融合蛋白。诱导温度在20℃,IPTG终浓度为0.4 mmol/L,诱导时间为12 h,融合蛋白表达效果较好,且主要以可溶性形式存在,对纯化得到的融合蛋白进行活性分析,抑菌活性试验表明,表达产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。

抗菌肽MagaininⅡ基因穿梭表达载体的构建

采用SOE法人工设计并合成抗菌肽MagaininⅡ基因。按正确的阅读框架定向克隆至高效穿梭表达载体pPICZαA上,经PCR鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌JM109菌落中含有插入MagaininⅡ基因的重组质粒pPICZαA-Mag,结果表明成功构建了抗菌肽MagaininⅡ基因穿梭表达载体pPICZαA-Mag。

抗菌肽magaininⅡ对E.coli杀伤作用的AFM观察

利用原子力显微镜(AFM)观察了不同浓度magaininⅡ对E.coli的作用效果。分别用低于MIC和高于MIC浓度的magaininⅡ作用E.coliD31,结果发现当magaininⅡ浓度低于最低抑制浓度MIC时,细菌外膜的粘弹性增大,膜表面产生数量、大小不等的囊泡结构。当magaininⅡ高于MIC时,细胞很快破损,胞浆内容物外泄,菌体破裂导致死亡。推测magaininⅡ分子可能以“地毯”模式迅速集结于细胞膜上,环绕菌体切断细胞膜。这些结果都说明微生物的细胞膜结构是抗菌肽攻击的首要靶点。

一种新融合抗菌肽Hex-Mag基因的克隆、表达及其抗菌活性的研究

通过在Magainin1-12(GIGKFLHSAKKF)的N端添加碱性氨基酸片段Hexapeptide(RRWQWR)以增强其对细胞膜的吸附能力来提高Magainin1-12的抗菌活性。利用Hexapeptide和Magainin1-12的基因序列,结合酵母偏爱密码子设计出新的融合基因Hex-Mag,通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,gene SOEing)利用PCR扩增出基因片段,再将融合基因进行酶切并纯化后导入穿梭质粒pPIC9中,构建受乙醇氧化酶1基因(AOX1)的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化GS115毕赤酵母宿主菌,经表型筛选,阳性克隆用甲醇诱导表达。表达出的融合肽Hex-Mag分子量约2.3kDa,其耐热性强,在100℃条件下,其活性可维持3h以上。琼脂糖孔穴扩散法检测显示Hex-Mag对多种革兰氏阴性菌和阳性菌具有抑制活性,与Magainin1-12相比,其活性有明显增强,N端正电荷增加的预期效应得到初步体现。

抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达

目的将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法通过RT—PCR从两株抗MagaininⅡ杂交瘤细胞株 (2D1 ,3F8)中克隆出VH 和VL 基因 ,然后利用重组PCR技术 ,将VH 和VL 基因通过柔性肽段(GLY4Ser)3 的Linker拼接成单链抗体基因(ScFv) ,将ScFv克隆到表达载体 pCANTAB5E上并将其分别在大肠杆菌E.coliHB2151及TG1 中进行表达。结果SDS PAGE和Western blot分析表明 ,ScFv在大肠杆菌E.coliHB2151中得到了分泌表达。间接ELISA结果显示可溶性ScFv及其表面展示噬菌体均具有抗原结合活性。结论成功地获得了ScFv 2D1和ScFv 3F8基因并在大肠杆菌中得到了功能性表达 ,为新型抗菌肽的设计打下了基础。

抗菌肽Magainin II单克隆抗体的制备及应用

本文采用硝酸纤维素膜脾内埋植免疫， 利用淋巴细胞杂交瘤技术， 首次制备了抗菌肽ｍａｇａｉｎｉｎ ＩＩ的单克隆抗体（ｍＡｂ）， 获得４ 株稳定分泌抗ｍａｇａｉｎｉｎＩＩｍＡｂ 的杂交瘤细胞株。利用该ｍＡｂ 对提取的ｍａｇａｉｎｉｎ ＩＩ进行竞争性ＥＬＩＳＡ 和免疫组化分析， 均获得较满意的效果。

杂合肽基因的合成及在大肠杆菌中的表达

将LfcinB15-Ma12杂合肽基因克隆到载体pET32a上,构建抗菌肽LfcinB15-Ma12杂合肽基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。根据已报道的抗菌肽LfcinB和Magainin基因的氨基酸序列,推导出其cDNA序列,将两者连接为杂合基因并克隆到载体pET32a上,IPTG诱导表达。构建了LfcinB15-Ma12杂合肽基因重组质粒,经PCR扩增和DNA测序分析,成功构建了LfcinB15-Ma12杂合肽基因重组质粒,经IPTG诱导,成功表达了杂合肽LfcinB15-Ma12。这为利用基因工程表达其他抗菌肽奠定了基础。

蛙源抗菌肽Magainin Ⅱ对畜禽常见病原菌抑菌活性与体外稳定性测定

抗菌肽MagaininⅡ是来源于非洲爪蟾体内的一种具有抗菌活性的小肽类物质。试验采用微量肉汤稀释法测定蛙源抗菌肽MagaininⅡ对几种常见畜禽致病菌的抑菌活性;在此基础上将抗菌肽MagaininⅡ在不同温度、pH值及人工胃蛋白酶与胰蛋白酶进行处理,进而评价其稳定性。试验结果表明,抗菌肽MagaininⅡ对革兰氏阳性菌不具有抑菌作用,但对几种革兰氏阴性菌表现出一定的抗菌活性,MIC值处于64~256μg/ml;由时间杀菌曲线可知,MagaininⅡ不能有效抑制金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌落的形成,但能够在90 min内对大肠杆菌ATCC 25922发挥抑制作用;MagaininⅡ的稳定性测试结果表明,分别经不同温度、pH值以及人工胃蛋白酶与胰蛋白酶处理后的MagaininⅡ对金黄色葡萄球菌ATCC 29523和表皮葡萄球菌ATCC 12228始终没有发挥抑菌活性,在经50~70℃处理后能够对大肠杆菌K12和肠炎沙门氏菌CMCC 50041稳定发挥抗菌效果,MIC值始终为64μg/ml;经两种人工酶处理后的MagaininⅡ对两种试验革兰氏阴性菌不再具有抑菌作用;经pH值为2处理后,MagaininⅡ对大肠杆菌K12和肠炎沙门氏菌CMCC 50041的MIC均为256μg/ml,比未处理时明显增大,经pH值为8处理后,MagaininⅡ不能抑制大肠杆菌K12,对肠炎沙门氏菌CMCC50041的MIC为128μg/ml。基于试验结果可推断:MagaininⅡ对革兰氏阳性菌抗菌效果不明显,对革兰氏阴性菌具有一定的抗菌效果,经人工酶处理后性质不稳定,该研究为MagaininⅡ在畜禽生产上的应用提供参考。

用于病原菌快速和高灵敏检测的电化学方法研究

为了检测水样中致病性强的大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌,合成了一种抗菌肽基超顺磁性纳米颗粒,利用抗菌肽和病原菌之间的静电相互作用,将其黏附在病原菌表面。然后利用广泛使用的电化学检测法-循环伏安法(CV),根据细菌浓度和种类的变化引起的电流信号的变化来完成对两种细菌浓度和种类的快速、高效和高灵敏度检测。

抗菌肽magainin Ⅱ的密码子优化及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

Magainin Ⅱ是非洲爪蟾皮肤分泌的一种抗菌肽,在低浓度下即能够对细菌、真菌、原虫、肿瘤等都具有杀伤作用,并且与同是来源于非洲爪蟾皮肤的另一种抗菌肽PGLa在杀菌、抗肿瘤等方面具有很好的协同效应。文中分别按照大肠杆菌和毕赤酵母的密码子利用频率,对抗菌肽magainin Ⅱ以及杂合抗菌肽magainin Ⅱ-PGLa,进行了密码子优化。构建了高效表达抗菌肽magainin Ⅱ的原核表达载体,经过蛋白酶切割获得纯化的抗菌肽magainin Ⅱ。同时进一步构建了杂合抗菌肽magainin Ⅱ-PGLa的分泌型毕赤酵母表达载体,实现了杂合抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达。本研究为magainin Ⅱ和magainin Ⅱ-PGLa的生产与应用奠定了基础。

不同Alloferon-1体外抗病毒效果

Alloferon-1是Chernysh等于2002报道的一种由13个氨基酸组成、相对分子质量为1481．53的新型抗菌肽，动物实验证实该抗菌肽有较强的抗流感病毒和抗白血病细胞的活性。人工合成或重组表达的抗菌肽Magainin—Ⅱ的生物学活性与天然产物相同。本研究中构建了串联式表达Alloferon-1的原核重组表达系统得到rAlloferon-1-EK，同时人工合成了sAlloferon-1和sAlloferon-1-EK，比较重组及人工合成的3种Alloferon-1体外抗病毒活性，以期为抗病毒新药研发提供实验依据。

抗菌肽MagaininⅡ多拷贝串联体的设计与构建

目的:分析设计抗菌肽MagaininⅡ多拷贝串联体表达质粒并进行构建验证。方法:根据GeneBank中提供的抗菌肽MagaininⅡ氨基酸序列,结合表达菌株毕赤酵母密码子偏爱性,设计出MagaininⅡ的表达序列,并于其两端插入一对同尾酶SalⅠ和XhoⅠ的酶切识别序列及裂解位点AGA,人工合成后插入质粒载体pUC19中,利用同尾酶法构建抗菌肽MagaininⅡ多拷贝串联体。结果:经M13引物进行PCR及SalⅠ/PstⅠ双酶切进行鉴定,成功构建出抗菌肽MagaininⅡ1-5拷贝串联体重组质粒。结论:该研究设计的MagaininⅡ串联体构建方法可行。