Objective:To characterize the major allergens of Macrobrachium rosenbergii.(giant freshwater prawn).Methods:Raw and cooked extracts of the giant freshwater prawn were prepared.The IgE reactivity pattern was identified...Objective:To characterize the major allergens of Macrobrachium rosenbergii.(giant freshwater prawn).Methods:Raw and cooked extracts of the giant freshwater prawn were prepared.The IgE reactivity pattern was identified by sodium dodecyl sulfate polyaerylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)and immunoblotting technique with the sera of 20 skin prick test(SPT)positive patients.The major allergen identified was then characterized using the proteomics approach involving a combination of two-dimensional(2-DE)electrophoresis,mass spectrometry and bioinformatics tools.Results:SDS-PAGE of the raw extract showed 23 protein bands(15-250 kDa)but those ranging from 40 to 100 kDa were not found in the cooked extract.From immunoblotting experiments,raw and cooked extracts demonstrated 11 and 5 IgE-binding proteins,respectively,with a molecular mass ranging from 15 to 155 kDa.A heat-resistant 36 kDa protein was identified as the major allergen of both extracts.In addition,a 42 kDa heat-sensitive protein was shown to be a major allergen of the raw extract.The 2-DE gel fractionated the prawn proteins to more than 50 different protein spots.Of these,10 spots showed specific:IgE reactivity with patients'sera.Matrix assisted laser desorption/ionization-lime of flight(MALDI-TOF)analysis led to identification of 2 important allergens,tropomyosin and arginine kinase.Conclusions:It can be concluded that the availability of such allergens would help in component-based diagnosis and therapy of prawn allergies.展开更多
根据文献并结合生物信息学方法选取大豆主要过敏原Gly m Bd 30k的抗原表位区,采用PCR方法扩增出该抗原表位区基因片段,并通过酶切连接分别构建单体的pET表达载体(pET-sGly)和二聚体的pET表达载体(pET-dGly),重组质粒转化到大肠杆菌BL21(...根据文献并结合生物信息学方法选取大豆主要过敏原Gly m Bd 30k的抗原表位区,采用PCR方法扩增出该抗原表位区基因片段,并通过酶切连接分别构建单体的pET表达载体(pET-sGly)和二聚体的pET表达载体(pET-dGly),重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析;同时用Ni2+离子亲和层析柱纯化表达的sGly和dGly抗原表位蛋白,用western-blotting和ELISA检测重组蛋白的免疫原性。结果表明:表达的单体sGly蛋白以可溶性表达为主,而其二聚体dGly蛋白以包涵体形式存在,纯化的sGly和dGly蛋白都具有较好的免疫原性,重组蛋白sGly的抗原性更佳。成功构建的大豆主要过敏原Gly m Bd 30k蛋白的抗原表位区单体sGly蛋白及其二聚体dGly蛋白的工程菌,为研制大豆主要过敏原的单克隆抗体以制备用于大豆主要过敏原检测的试剂奠定了基础。展开更多
目的构建经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原Der p 1的T细胞表位肽疫苗重组载体。方法分别合成TAT、Ih C和含编码Der p 1的3段T细胞表位的融合核苷酸序列,用特异性引物PCR扩增相应的基因片段,分别用相应的双酶切后,用T4 DNA连接酶连接形成TAT...目的构建经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原Der p 1的T细胞表位肽疫苗重组载体。方法分别合成TAT、Ih C和含编码Der p 1的3段T细胞表位的融合核苷酸序列,用特异性引物PCR扩增相应的基因片段,分别用相应的双酶切后,用T4 DNA连接酶连接形成TAT-Ih C-Der p 1-3T融合基因,并插入至原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组原核表达载体p ET-28a(+)-TATIh C-Der p 1-3T,Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切和测序鉴定。重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株,IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析和Western blot验证,纯化TAT-Ih C-Der p 1-3T蛋白后进行Ig E结合试验。结果双酶切和测序结果表明,成功构建了p ET-28a-TAT-Ih C-Der p 1-3T重组原核表达载体;SDS-PAGE电泳分析显示TAT-Ih C-Der p 1-3T可诱导表达;Western blot检测表明该融合蛋白纯化成功;Ig E结合试验表明TAT-Ih C-Der p 1-3T结合屋尘螨过敏病人血清Ig E的能力强于Der p 1变应原(P<0.001)。结论成功构建了可表达经MHC通路的编码Der p 1的3段T细胞表位的重组p ET-28a-TAT-Ih C-Der p 1-3T载体,纯化的TAT-Ih C-Der p 1-3T具有较强的Ig E结合能力,从而为后续经MHC通路的特异性免疫治疗奠定基础。展开更多
目的预测猫主要过敏原Fel d 1的二级结构和B细胞抗原表位。方法以Fel d 1肽链Ⅰ和肽链Ⅱ的氨基酸序列为基础，通过DNASIar Protean软件，采用Chou—Fasman方法预测蛋白质的二级结构；用Kyte—Doolillle法预测亲水性；用Karplus—Sehulz...目的预测猫主要过敏原Fel d 1的二级结构和B细胞抗原表位。方法以Fel d 1肽链Ⅰ和肽链Ⅱ的氨基酸序列为基础，通过DNASIar Protean软件，采用Chou—Fasman方法预测蛋白质的二级结构；用Kyte—Doolillle法预测亲水性；用Karplus—Sehulz方法预测柔韧性；用Emini方法预测表面可及性；用Jaineson—Wolf方法预测抗原性指数。结果对Fel d 1的二级结构和B细胞抗原表位预测的结果表明，第15～21、48～57、103～111、138～143、151～161区段是潜在的B细胞抗原表位。结论本研究有助于确定Fel d 1的B细胞优势抗原表位，为Fel d展开更多
目的:预测猫主要过敏原Fel d 1与MHCⅠ、MHCⅡ类分子的结合力获得T细胞优势抗原表位,并模拟Fel d 1的三维结构,为猫主要过敏原的改造及其临床研究等提供依据。方法:从Uniprot数据库中得到猫主要过敏原Fel d 1的氨基酸序列,通过在线软件N...目的:预测猫主要过敏原Fel d 1与MHCⅠ、MHCⅡ类分子的结合力获得T细胞优势抗原表位,并模拟Fel d 1的三维结构,为猫主要过敏原的改造及其临床研究等提供依据。方法:从Uniprot数据库中得到猫主要过敏原Fel d 1的氨基酸序列,通过在线软件NetMHCⅡ2.2对Fel d 1氨基酸序列进行MHCⅡ抗原表位分析,使用软件SYFPEITHI分析MHCⅠ的抗原表位,再通过在线软件Swiss-Model预测Fel d 1的三维结构,以Ramachandran图评估三维结构的稳定性。结果:运用生物学软件分析得到Fel d 1上两个高值MHCⅡ抗原表位区域分别为22～43、80～95,MHCⅠ抗原表位优势区为17～30、56～84、91～103。Ramachandran图显示Fel d 1的空间构象稳定。结论:本研究有助于确定Fel d 1的T细胞优势抗原表位及其三维结构模型,为Fel d 1抗原性改造提供理论依据,及将来的临床研究奠定基础。展开更多
目的预测并鉴定粉尘螨3类变应原(Der f 3)中的B细胞线性表位。方法运用生物信息学技术,从抗原性、表面易接近性、柔韧性、亲水性、β转角等5个方面在线预测Der f3的B细胞线性抗原表位。同时,采用人工合成法合成相应B细胞表位肽分别与由1...目的预测并鉴定粉尘螨3类变应原(Der f 3)中的B细胞线性表位。方法运用生物信息学技术,从抗原性、表面易接近性、柔韧性、亲水性、β转角等5个方面在线预测Der f3的B细胞线性抗原表位。同时,采用人工合成法合成相应B细胞表位肽分别与由12份螨性过敏性哮喘患者血清组成的3个血清池共同作用,明确其中的强阳性表位肽序列。结果成功预测了Der f 3中的8个B细胞表位肽。其中,在过敏性患者血清与变应原特异性IgE结合试验中确认了33KAKAGDCP40、86HASGGEKIQVAEIYQHENYDSMTID110、118LKTPMTLDQTNAKPVPLPPQGSDVKVG144、199DVANGGVDSCQGDSGGPVVD218和156QEGSYSLP1635个强阳性表位肽序列。结论成功确认了Der f 3变应原中5个B细胞线性表位序列,为尘螨过敏性哮喘的诊断和治疗奠定基础。展开更多
目的克隆、表达腐食酪螨主要过敏原Tyr p 35的cDNA,检测其表达产物与血清IgE结合活性。方法根据Tyr p 35基因序列(GenBank Accession No.KX060612)设计引物,PCR扩增cDNA,构建原核表达载体pET-28a(+)-Try p 35,转化至E.coli BL21(DE3)ply...目的克隆、表达腐食酪螨主要过敏原Tyr p 35的cDNA,检测其表达产物与血清IgE结合活性。方法根据Tyr p 35基因序列(GenBank Accession No.KX060612)设计引物,PCR扩增cDNA,构建原核表达载体pET-28a(+)-Try p 35,转化至E.coli BL21(DE3)plysS,用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导表达,层析法纯化重组蛋白,Western blot法检测其与血清IgE的结合率。结果克隆Tyr p 35基因全长为1 461bp,编码486个氨基酸,为稳定的亲水性蛋白,含有醛/组氨醇脱氢酶活性位点。将测序正确的表达质粒pET28a(+)-Tyr p 35转化Competent cell BL21(DE3)T1R,经IPTG诱导表达目的蛋白,部分可溶性表达。Western blot检测rTyr p 35血清IgE结合率为82.35%(14/17)。结论成功克隆rTyr p 35基因,其表达产物为主要过敏原之一,纯化后仍具有血清IgE结合活性,为腐食酪螨过敏原标准化,诊断试剂以及脱敏治疗制品的研发奠定了基础。展开更多
基金Supported by a research grant from UPSI(grant No.UPSI2011-0018-102-01)
文摘Objective:To characterize the major allergens of Macrobrachium rosenbergii.(giant freshwater prawn).Methods:Raw and cooked extracts of the giant freshwater prawn were prepared.The IgE reactivity pattern was identified by sodium dodecyl sulfate polyaerylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)and immunoblotting technique with the sera of 20 skin prick test(SPT)positive patients.The major allergen identified was then characterized using the proteomics approach involving a combination of two-dimensional(2-DE)electrophoresis,mass spectrometry and bioinformatics tools.Results:SDS-PAGE of the raw extract showed 23 protein bands(15-250 kDa)but those ranging from 40 to 100 kDa were not found in the cooked extract.From immunoblotting experiments,raw and cooked extracts demonstrated 11 and 5 IgE-binding proteins,respectively,with a molecular mass ranging from 15 to 155 kDa.A heat-resistant 36 kDa protein was identified as the major allergen of both extracts.In addition,a 42 kDa heat-sensitive protein was shown to be a major allergen of the raw extract.The 2-DE gel fractionated the prawn proteins to more than 50 different protein spots.Of these,10 spots showed specific:IgE reactivity with patients'sera.Matrix assisted laser desorption/ionization-lime of flight(MALDI-TOF)analysis led to identification of 2 important allergens,tropomyosin and arginine kinase.Conclusions:It can be concluded that the availability of such allergens would help in component-based diagnosis and therapy of prawn allergies.
文摘根据文献并结合生物信息学方法选取大豆主要过敏原Gly m Bd 30k的抗原表位区,采用PCR方法扩增出该抗原表位区基因片段,并通过酶切连接分别构建单体的pET表达载体(pET-sGly)和二聚体的pET表达载体(pET-dGly),重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)plysS,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析;同时用Ni2+离子亲和层析柱纯化表达的sGly和dGly抗原表位蛋白,用western-blotting和ELISA检测重组蛋白的免疫原性。结果表明:表达的单体sGly蛋白以可溶性表达为主,而其二聚体dGly蛋白以包涵体形式存在,纯化的sGly和dGly蛋白都具有较好的免疫原性,重组蛋白sGly的抗原性更佳。成功构建的大豆主要过敏原Gly m Bd 30k蛋白的抗原表位区单体sGly蛋白及其二聚体dGly蛋白的工程菌,为研制大豆主要过敏原的单克隆抗体以制备用于大豆主要过敏原检测的试剂奠定了基础。
文摘目的构建经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原Der p 1的T细胞表位肽疫苗重组载体。方法分别合成TAT、Ih C和含编码Der p 1的3段T细胞表位的融合核苷酸序列,用特异性引物PCR扩增相应的基因片段,分别用相应的双酶切后,用T4 DNA连接酶连接形成TAT-Ih C-Der p 1-3T融合基因,并插入至原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组原核表达载体p ET-28a(+)-TATIh C-Der p 1-3T,Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切和测序鉴定。重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株,IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析和Western blot验证,纯化TAT-Ih C-Der p 1-3T蛋白后进行Ig E结合试验。结果双酶切和测序结果表明,成功构建了p ET-28a-TAT-Ih C-Der p 1-3T重组原核表达载体;SDS-PAGE电泳分析显示TAT-Ih C-Der p 1-3T可诱导表达;Western blot检测表明该融合蛋白纯化成功;Ig E结合试验表明TAT-Ih C-Der p 1-3T结合屋尘螨过敏病人血清Ig E的能力强于Der p 1变应原(P<0.001)。结论成功构建了可表达经MHC通路的编码Der p 1的3段T细胞表位的重组p ET-28a-TAT-Ih C-Der p 1-3T载体,纯化的TAT-Ih C-Der p 1-3T具有较强的Ig E结合能力,从而为后续经MHC通路的特异性免疫治疗奠定基础。
文摘目的预测猫主要过敏原Fel d 1的二级结构和B细胞抗原表位。方法以Fel d 1肽链Ⅰ和肽链Ⅱ的氨基酸序列为基础，通过DNASIar Protean软件，采用Chou—Fasman方法预测蛋白质的二级结构；用Kyte—Doolillle法预测亲水性；用Karplus—Sehulz方法预测柔韧性；用Emini方法预测表面可及性；用Jaineson—Wolf方法预测抗原性指数。结果对Fel d 1的二级结构和B细胞抗原表位预测的结果表明，第15～21、48～57、103～111、138～143、151～161区段是潜在的B细胞抗原表位。结论本研究有助于确定Fel d 1的B细胞优势抗原表位，为Fel d
文摘目的:预测猫主要过敏原Fel d 1与MHCⅠ、MHCⅡ类分子的结合力获得T细胞优势抗原表位,并模拟Fel d 1的三维结构,为猫主要过敏原的改造及其临床研究等提供依据。方法:从Uniprot数据库中得到猫主要过敏原Fel d 1的氨基酸序列,通过在线软件NetMHCⅡ2.2对Fel d 1氨基酸序列进行MHCⅡ抗原表位分析,使用软件SYFPEITHI分析MHCⅠ的抗原表位,再通过在线软件Swiss-Model预测Fel d 1的三维结构,以Ramachandran图评估三维结构的稳定性。结果:运用生物学软件分析得到Fel d 1上两个高值MHCⅡ抗原表位区域分别为22～43、80～95,MHCⅠ抗原表位优势区为17～30、56～84、91～103。Ramachandran图显示Fel d 1的空间构象稳定。结论:本研究有助于确定Fel d 1的T细胞优势抗原表位及其三维结构模型,为Fel d 1抗原性改造提供理论依据,及将来的临床研究奠定基础。
文摘目的预测并鉴定粉尘螨3类变应原(Der f 3)中的B细胞线性表位。方法运用生物信息学技术,从抗原性、表面易接近性、柔韧性、亲水性、β转角等5个方面在线预测Der f3的B细胞线性抗原表位。同时,采用人工合成法合成相应B细胞表位肽分别与由12份螨性过敏性哮喘患者血清组成的3个血清池共同作用,明确其中的强阳性表位肽序列。结果成功预测了Der f 3中的8个B细胞表位肽。其中,在过敏性患者血清与变应原特异性IgE结合试验中确认了33KAKAGDCP40、86HASGGEKIQVAEIYQHENYDSMTID110、118LKTPMTLDQTNAKPVPLPPQGSDVKVG144、199DVANGGVDSCQGDSGGPVVD218和156QEGSYSLP1635个强阳性表位肽序列。结论成功确认了Der f 3变应原中5个B细胞线性表位序列,为尘螨过敏性哮喘的诊断和治疗奠定基础。
文摘目的克隆、表达腐食酪螨主要过敏原Tyr p 35的cDNA,检测其表达产物与血清IgE结合活性。方法根据Tyr p 35基因序列(GenBank Accession No.KX060612)设计引物,PCR扩增cDNA,构建原核表达载体pET-28a(+)-Try p 35,转化至E.coli BL21(DE3)plysS,用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导表达,层析法纯化重组蛋白,Western blot法检测其与血清IgE的结合率。结果克隆Tyr p 35基因全长为1 461bp,编码486个氨基酸,为稳定的亲水性蛋白,含有醛/组氨醇脱氢酶活性位点。将测序正确的表达质粒pET28a(+)-Tyr p 35转化Competent cell BL21(DE3)T1R,经IPTG诱导表达目的蛋白,部分可溶性表达。Western blot检测rTyr p 35血清IgE结合率为82.35%(14/17)。结论成功克隆rTyr p 35基因,其表达产物为主要过敏原之一,纯化后仍具有血清IgE结合活性,为腐食酪螨过敏原标准化,诊断试剂以及脱敏治疗制品的研发奠定了基础。
