硫矿硫化叶菌MTSase和MTHase基因的克隆与表达

从嗜热硫矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)ATCC35092的基因组中用PCR方法扩增得到编码MTSase和MTSase的基因,分别将其插入原核表达载体pTrc99a中,并转入大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达。MTSase和MTHase酶活产率达到了31·3U/g(wetcell)和403U/g(wetcell)。在75℃,pH5·0条件下,两酶联合作用转化淀粉生产海藻糖,当淀粉浓度为15%,DE值为10时,海藻糖转化率最高为53·6%。

海藻糖的MTSase及MTHase酶促合成条件的研究

本室收藏一株产 MTSase和 MTHase两酶并能将淀粉水解物转化为海藻糖的菌株 Micrococcus luteus。实验发现 ,菌体在对数生长期细胞内的 MTSase和 MTHase累积量极少 ,但在其基本停止生长后继续培养 12 h,胞内MTSase和 MTHase两酶含量急剧增加。两酶联合作用的最适反应条件为 p H6 .5 ,温度 4 0℃ ;最适底物是 DE值为11.6、浓度为 15 %的淀粉水解液。

MTSase和MTHase在Brevibacillus brevis中的克隆表达及应用研究

为实现将来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)ATCC 33909的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)在短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)中的重组表达,分别以重组质粒pET-24a(+)-treY和pET-24a(+)-treZ为模板PCR扩增得到MTSase和MTHase基因片段,通过与表达载体pSVN连接得到重组质粒,电转化表达宿主Brevibacillus brevis,成功构建重组菌Brevibacillus brevis/pSVN-treY和Brevibacillus brevis/p SVN-treZ。重组菌在TM培养基中发酵48 h,胞内酶活力分别达到MTSase 630.0 U/g(wet cell)、MTHase 170.0 U/g(wet cell)。对重组MTSase和MTHase进行酶转化实验,结果表明,当以质量浓度为100 g/L马铃薯淀粉为底物,酶转化温度为60℃,pH为5.5,加酶量为MTSase 80 U/g淀粉、MTHase 20 U/g淀粉,普鲁兰酶5 U/g淀粉和环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)15 U/g淀粉,反应48 h,海藻糖转化率达到80.2%。

芝田硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ 方法从芝田硫化叶菌中扩增了编码一种新酶，即麦芽寡糖基海藻糖合酶（ ＭＴＳａｓｅ） 的基因，扩增的２－２ｋｂ ＤＮＡ 插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０ 中，构建成重组质粒ｐＳＢＧＴ１ 。ｐＳＢＧＴ１ 中ＭＴＳａｓｅ 基因在大肠杆菌中得到表达。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物ＭＴＳａｓｅ蛋白的分子量约为７４ｋＤａ ，同核苷酸序列测定所推导的值相符。表达产物占细胞总蛋白约４－４ ％ 。ｐＳＢＧＴ１ 产生的重组酶作用于淀粉部分水解物，使ＤＥ 值降低，得到非还原糖或低还原糖。

硫矿硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆与表达

引言海藻糖（α-D-葡糖基-[1,1]-α-D葡糖苷）是一种广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫等的非还原性二糖.在自然界中,海藻糖既是一种贮藏性糖类,又是应激代谢的重要产物,具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能.

海藻酸钙固定麦芽寡糖基海藻糖合酶的研究

比较麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)与其固定化酶的最适反应pH值、pH稳定性、最适反应温度和热稳定性。结果表明,固定化酶的最适反应pH值(5.5)较原酶(6.0)低,最适反应温度(65℃)较原酶(60℃)高,pH稳定性和热稳定性均较原酶高。

海藻糖合成酶产生菌的筛选及生物合成途径的初步验证

从温泉土壤分离得到11株菌株,它们的胞内释放物能将淀粉转化成海藻糖.对菌株WX-10内含物将淀粉转化为海藻糖的途径进行了初步验证,证明其胞内含有麦芽糖基海藻糖生成酶(MTSase)和麦芽糖基海藻糖水解酶(MTHase).

TreY-TreZ途径高产海藻糖菌株的筛选

为筛选能以TreY-TreZ途径合成海藻糖的菌株,对采自鲁山中汤温泉水样、温泉土样及面粉厂附近的土样,经高渗平板高温培养,以碘-淀粉水解圈作为初筛方法,通过TLC及HPLC检测,获得了2株产海藻糖的节杆菌属新菌株,经过初步的途径验证,证实这2株菌均以TreY-TreZ途径生成海藻糖。

多酶催化制备海藻糖及分离提取工艺优化

以麦芽糊精为原料,利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)制备海藻糖。探究双酶法转化制备海藻糖以及复合卷式纳滤膜分离纯化海藻糖的工艺条件。结果表明当底物浓度200 g/L麦芽糊精,普鲁兰酶5 U/g麦芽糊精,MTSase 95 U/g麦芽糊精,MTHase 35 U/g麦芽糊精,转化温度60℃,pH 6.0,转化48 h,经糖化后海藻糖转化率达到74.7%;纳滤分离海藻糖时,当加水倍数为5、浓缩倍数为2时,采用连续式操作进行纳滤分离海藻糖效果最佳。

两种制备海藻糖的生物酶转化工艺技术

海藻糖作为具有特殊生物保护功能的非还原性双糖,被广泛应用在食品、医药等各个领域。以双酶法和单酶法为代表的生物酶转化技术是制备海藻糖的研究热点。双酶法以淀粉为原料,在低聚麦芽糖基海藻糖合成酶和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶的协同作用下,将直链淀粉转化成海藻糖。双酶法具有原料便宜易得、工艺较成熟、转化率较高等优点,是最早实现酶法工业化生产海藻糖的方法。单酶法直接利用海藻糖合酶将麦芽糖转化为海藻糖。单酶法因为具有反应过程易控、工艺流程简单、副产物少等优点而受到广泛关注。提高酶的耐高温性能及转化效率是目前2种方法的主要研究方向。随着蛋白基因工程领域的发展,生物酶的优化构建技术日趋成熟,为双酶法的进一步完善和单酶法的工业应用奠定了基础。

易错PCR技术提高源于Sulfolobus acidocaldarius麦芽寡糖基海藻糖合成酶活性

利用易错PCR技术结合高通量筛选技术对源于Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909的MTSase进行定向进化,获得一个酶活提高的突变体酶D-6。基因分析表明,突变体酶发生了2个位点突变:G432D/G586D,其中突变位点G586D位于Aβ8与AEα14的loop环上。将野生型MTSase和突变体酶D-6进行蛋白质纯化后,测定其酶学性质,结果表明:突变体酶D-6的比活力为野生型MTSase的1.22倍;野生型的Km值为4.74 mmol/L,而突变体D-6为2.77 mmol/L,表明其对底物亲和性较野生型有所提高。

嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain 7中麦芽寡糖基海藻糖合酶的酶学性质

【目的】克隆表达嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain 7中的ST0929基因,并测定其酶活性。【方法】根据ST0929基因设计引物进行PCR扩增,将这段基因克隆到p ET-15b质粒上,重组质粒导入大肠杆菌BL21细胞中表达。亲和层析纯化酶蛋白,并测定其酶活性。【结果】SDS-PAGE分析表明其分子量大约为83 k D。酶学性质研究表明该酶的最适温度为75°C,最适p H为5.0,具有很强的热稳定性和p H稳定性。该酶还能对多种金属离子和有机溶剂具有一定的耐受性。底物特异性研究发现该酶能够利用麦芽糊精作底物,而不能利用壳寡糖、麦芽糖等。【结论】通过以上酶学性质的研究,说明这种来源于超嗜热古菌的麦芽寡糖基海藻糖合酶在工业生产海藻糖领域具有一定的应用前景。