利用慢病毒载体快速建立表达外源基因的哺乳动物细胞系

建立稳定表达外源基因的哺乳动物细胞系是一项重要的生物技术,介绍了联合使用慢病毒载体和流式细胞仪分选技术来建立稳定表达绿色荧光蛋白的293T细胞系。结果表明,在1个月左右的时间里即可获得表达绿色荧光蛋白的293T细胞系,阳性细胞率高达96.5%,而且建立的细胞系能够稳定传代。因此,联合慢病毒载体和流式细胞仪分选技术的策略对于建立稳定表达外源基因的哺乳动物细胞系快捷和可靠。

沙蜇和白色霞水母刺丝囊毒素的细胞毒性比较研究

分别自沙蜇和白色霞水母提取刺丝囊毒素蛋白,以小鼠皮下结缔组织细胞(A9)和人横纹肌瘤细胞(A-673)为受试对象,比较两种水母的刺丝囊毒素蛋白对其的细胞毒性,以期为评估和管理两种水母的毒害风险提供科学依据。结果显示:沙蜇和白色霞水母刺丝囊毒素对培养中的A9和A-673细胞存活率都具有抑制作用,且该抑制作用呈显著的时间和剂量依赖性。白色霞水母刺丝囊毒素对A9和A-673细胞毒性的半数效应浓度(如:对A9和A-673的EC50-24h分别为49.8μg/mL和43.6μg/mL)低于沙蜇刺丝囊毒素的半数效应浓度(如:对A9和A-673的EC50-24h分别为78.0μg/mL和70.1μg/mL);两种水母毒素对A-673或A9的细胞毒性强于已报道的根口类和旗口类水母毒素对哺乳动物肺、肝、血管平滑肌、神经、乳腺等的细胞毒性。由此可见,白色霞水母刺丝囊毒素的细胞毒性更强,横纹肌、结缔组织对水母刺丝囊毒素作用敏感。研究结果对于评估水母毒害风险和制定防护对策有重要意义。

人胚胎干细胞向肝脏样细胞诱导分化中限定性内胚层分化的研究进展

胚胎干细胞(ESC)是来源于囊胚内细胞团的一种高度未分化细胞,具有无限增殖和发育全能性等特点,可自发分化为多种细胞类型,如神经细胞、肝脏细胞、胰腺细胞和心肌细胞等。在之前的诱导分化方案中,主要通过ESC形成拟胚体后,再进一步进行各种细胞的诱导分化,诱导分化效率较低。目前的研究表明,直接添加诱导因子能够使ESC直接分化成限定性内胚层,并在此基础上进一步诱导分化形成肝脏细胞,从而显著提高向肝脏细胞的诱导分化效率。通过鉴定限定性内胚层的表面标记因子SOX17和FOX2来评定限定性内胚层的诱导分化效率。但是,何种诱导因子的组合诱导分化效率最高并最接近人胚胎正常发育过程并不十分明确。

山奈酚抑制人胆囊癌细胞增殖及其对mTORC1通路的影响

目的:探讨山奈酚对人胆囊癌细胞(SGC-996细胞)增殖的影响及其机制.方法:采用浓度为0、25、50、75、100、125、150、175μmol/L的山奈酚干预SGC-996细胞24、48、72h后,CCK-8法检测SGC-996细胞的体外增殖能力;干预48h后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Westernblot法检测P-S6K1及P-S6等哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)途径相关蛋白的表达.结果:干预24h时,浓度为0~175μmol/L的山奈酚对SGC-996细胞增殖的抑制作用不明显;干预48h时,浓度为75μmol/L及以上的山奈酚可明显抑制SGC-996细胞的增殖(P<0.05);干预72h时,浓度为50μmol/L的山奈酚也可显著抑制SGC-996细胞的增殖(P<0.05).浓度为100μmol/L山奈酚干预48h,可显著诱导细胞凋亡(P<0.05),显著降低P-S6K1和P-S6蛋白的表达水平(P<0.05).结论:在一定浓度范围内,山奈酚随浓度的增加和时间的延长而明显抑制SGC-996细胞的增殖,并诱导其凋亡,而对细胞增殖的抑制作用可能是通过影响mTORC1信号通路实现的.

雷帕霉素靶蛋白信号通路在食管癌细胞系中激活状态的研究

[目的]研究雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号传导通路在食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109中的激活状态。[方法]采用细胞免疫组化检测mTOR及其下游靶分子(p70S6K)在两细胞系中的表达,并采用RT-PCR和Westernblot方法分别从mRNA水平及蛋白水平测定此通路的活性。[结果]mTOR在两种细胞系中均有表达,且在EC9706中的表达水平明显高于Eca109,mTOR下游靶点(p706S6K)的磷酸化水平也是EC9706明显高。[结论]mTOR信号通路在两种细胞系中都是特异性激活。激活状态与细胞的分化程度有关,细胞分化程度越低,通路的激活水平越高。

Prosaposin基因哺乳动物细胞表达质粒的构建及稳定转染细胞系的建立

目的构建前凋亡因子prosaposin的哺乳动物细胞表达质粒,转染NIH3T3细胞,建立稳定转染prosaposin的细胞系。方法采用PCR方法扩增prosaposin的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c-Myc抗原表位标签,共同克隆至pcDNA3.1(+)哺乳动物细胞表达载体中,构建pcDNA-Psap-Myc融合表达质粒。用脂质体将经过验证、测序的pcDNA-Psap-Myc质粒转染NIH3T3细胞,通过G418筛选建立稳定过表达prosaposin的NIH3T3细胞系。采用RT-PCR和western blotting方法,检测prosaposin在稳定转染的NIH3T3细胞系中的表达。结果成功构建了pcDNA-Psap-Myc融合表达质粒,建立了稳定过表达prosaposin的NIH3T3细胞系。RT-PCR和Western blotting结果表明,构建的稳定细胞系中成功表达prosaposin-Myc融合蛋白。结论Prosaposin哺乳动物细胞表达质粒的成功构建和稳定转染NIH3T3细胞系的建立,为进一步体外研究prosaposin蛋白的功能及其与其他分子间的相互作用奠定了基础。

二甲双胍抑制人宫颈鳞癌细胞系SiHa和CaSKi增殖及促进细胞凋亡

目的研究二甲双胍(Met)对宫颈鳞癌细胞增殖的影响及作用机制。方法CCK-8法检测人宫颈癌鳞癌细胞系SiHa和CaSKi的增殖,计算二甲双胍半抑制浓度(IC_(50))。流式细胞仪检测细胞周期及凋亡。Western blot检测腺苷酸活化蛋白激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK-mTOR)信号通路相关蛋白表达。结果随着药物浓度增加、作用时间延长,细胞增殖率下降(P<0.05)。SiHa细胞48和72 h IC_(50)浓度分别为(50.95±2.63)和(21.39±5.23)mmol/L,CaSKi细胞48和72 h IC_(50)浓度分别为(9.98±1.63)和(7.47±2.09)mmol/L。Met组G_(2)/M期细胞含量减少,S期细胞含量增加(P<0.05)。Met组细胞凋亡率较对照组增加(P<0.05)。Met组磷酸化-AMPK(p-AMPK)表达量增加,磷酸化-S6K(p-S6K)、磷酸化-4E-BP1(p-4E-BP1)表达量减少(P<0.05)。结论二甲双胍抑制宫颈鳞癌细胞系增殖的作用可能与促进细胞凋亡、阻滞细胞周期于S期、激活AMPK-mTOR信号通路有关。

乙型肝炎病毒核心抗原与e抗原在转化的哺乳动物细胞中的高效稳定表达

将乙型肝炎病毒(HBV)ayw亚型Bam HI 1.5kb片段插入到载体pSV 2-dhfr Bgl Ⅱ位点,构建重组质粒。其正向插入的重组质粒pSV 2-DHBc-54转化L细胞之后,在细胞内测得乙型肝炎核心抗原(HBcAg)与e抗原(HBeAg),在含10％小牛血清的细胞培养液上清中仅测到HBeAg。此转化细胞用氨甲喋呤处理后,转化细胞表达HBcAg与HBeAg的量增加10倍以上。转化细胞系C-54-24传20代仍能稳定分泌HBeAg。转化细胞分泌的HBeAg,在含10％小牛血清的培养液中可在4℃稳定保存一年7个月以上。

1-甲基-4-苯基吡啶离子对人神经母细胞瘤细胞株哺乳动物雷帕霉素靶位信号通路的影响

目的研究1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)对人骨髓神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞哺乳动物雷帕霉素靶位(mTOR)信号通路相关蛋白表达的影响。方法体外培养的SH-SY5Y细胞分为正常对照组、MPP+0.25 mmol/L组、0.5 mmol/L组及1 mmol/L组,各MPP+组细胞与含相应浓度的MPP+培养24 h。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞相对存活率;应用免疫印迹法检测各组细胞中mTOR蛋白、核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)、mTOR调控相关蛋白(Raptor)、雷帕霉素不敏感的mTOR伴侣蛋白(Rictor)以及与自噬相关的微管相关蛋白1轻链3(LC3Ⅱ)、Beclin1蛋白表达水平。结果与正常对照组比较,各MPP+组细胞相对存活率显著降低(P<0.05～0.001);mTOR、p70S6K、Raptor、Rictor表达明显降低(P<0.05～0.001);LC3Ⅱ和Beclin1表达显著升高(P<0.05～0.001),均呈现出明显的量效关系。结论 MPP+通过抑制细胞中mTOR信号通路,诱导SH-SY5Y细胞自噬性死亡,并且与MPP+的浓度相关;这可能是MPP+导致PD动物模型发病的机制。

转化细胞分泌的乙型肝炎病毒e抗原的理化和免疫学性质

研究了由含乙型肝炎病毒C基因与前-C基因的重组质粒,转化小鼠L细胞所分泌的乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的性质。此种HBeAg有与牛血清蛋白非特异性结合的性质,在牛血清培养基中可能是与α和β球蛋白结合。结合的HBeAg,分子量约60～80KD,在50硫酸铵中可完全析出.经SDS-PAGE解离后,Western blot证明,牛血清培养基中的HBeAg的分子量为28KD、24KD、22KD和19KD4种。无血清培养基中的HBeAg以聚合体形式存在,在66.6％硫酸铵中方可完全析出。经SDS-PAGE解离后,Western blot证明,HBeAg的分子量为56KD和28KD。28KD分子量与由DNA序列推算的前-C和C基因编码的理论值一致。单克隆抗体检测证明,转化细胞分泌的HBeAg具有HBeAg/a和HBeAg/b抗原决定簇。在免疫扩散试验中,转化细胞分泌的HBeAg与人血清抗-HBe形成一条沉淀线,与人血清HBeAg近抗体侧的沉淀线端端相连,但与标准血清EK-3(抗-HBel和抗-HBe2)和EK-1(抗-HBe2和R-HBe3)在EIA试验中均呈阳性反应。

miR-508-5p介导mTOR对骨肉瘤细胞自噬的影响

目的:探讨miR-508-5p对骨肉瘤细胞自噬及雷帕霉素靶向基因(mTOR)信号通路的影响。方法:收集近五年收治的59例骨肉瘤患者的癌组织与癌旁正常组织,另购买人骨肉瘤细胞株MG-63与人成骨细胞hFOB,采用RT-PCR法检测各组织与细胞中miR-508-5p与mTOR mRNA的相对表达量;将MG-63细胞分成三组:空白组不进行转染,NC组转染空载质粒,过表达组转染miR-508-5p重组质粒,采用CCK-8法检测转染培养后的三组细胞增殖情况,流式细胞仪检测三组细胞凋亡率,采用RT-PCR法检测各组miR-508-5p与mTOR mRNA的相对表达量;采用Western blot法检测细胞中mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ蛋白的相对表达量。结果:相比癌旁正常组织与hFOB细胞,癌组织与MG-63细胞中miR-508-5p相对表达量均明显降低,而mTOR mRNA的相对表达量均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);相比空白组与NC组,过表达组miR-508-5p相对表达量明显上升,mTOR mRNA的相对表达量明显降低,细胞OD值明显降低,凋亡率明显增加,Bax与LC3-Ⅱ蛋白表达量均升高,而mTOR、Bcl-2与LC3-Ⅰ蛋白相对表达量均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-508-5p在骨肉瘤细胞中呈现低表达趋势,过表达miR-508-5p后可通过抑制mTOR通路,引发细胞自噬,从而抑制细胞增殖与促进细胞凋亡。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2/Akt信号通路对6-羟基多巴胺处理的SH-SY5Y细胞模型的作用及分子机制

目的探讨调控哺乳动物雷帕霉素蛋白复合物2(mTORC2)/Akt信号通路对6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤的SH-SY5Y细胞系是否具有保护作用,并阐明其分子作用机制。方法经维甲酸(RA)处理的SH-SY5Y细胞分别给予6-OHDA、mTORC2信号通路抑制剂PP242和激动剂A-443654,通过免疫荧光染色观察各组细胞数目的变化;提取细胞总蛋白进行Western blotting和免疫共沉淀(CoIP)实验,明确mTORC2信号通路关键蛋白的表达水平及其相互作用;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。同时制备SH-SY5Y与Bv-2细胞系共培养的帕金森病(PD)模型,运用MTT及ELISA方法检测各组细胞活力及培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素β(IL-1β)的含量。结果6-OHDA损伤的PD细胞模型组酪氨酸羟化酶(TH)/增殖细胞核抗原(PCNA)/Hochest-、TH/5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)-单标或双标阳性细胞数较正常组明显减少,凋亡率升高;Rictor、p-Akt、发育及DNA损伤反应调节蛋白1(REDD1)的表达均上升,且Rictor与p-Akt或REDD1存在相互作用;共培养模型中细胞活力明显降低且上清液中TNF-α和IL-β含量上升。A-443654组随着上述蛋白表达的进一步上调,细胞存活和凋亡以及炎性因子水平均有明显改善,而PP242组则呈现相反的变化。结论A-443654通过使Akt磷酸化而激活mTORC2信号通路,引起Rictor和REDD1蛋白的表达增加,继而提高细胞存活率并降低凋亡率,促进SH-SY5Y细胞的增殖分化,改善了6-OHDA引起的细胞损伤以及抑制了炎症因子的释放。

可调控表达甲型流感病毒M2蛋白的哺乳动物细胞系的建立与鉴定

甲型流感病毒M2蛋白是一种具有离子通道功能的跨膜蛋白,其氨基酸序列非常保守,可用于流感通用疫苗的研究。为了构建可调控的稳定表达甲型流感病毒M2蛋白的哺乳动物细胞系,首先应用PCR方法从含有流感病毒PR8株第七节段全长基因的质粒中扩增得到M2基因。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA5/FRT/TO上,用BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确后将重组质粒与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In T-REx-293细胞,使目的基因整合到宿主细胞染色体。筛选具有Hygromycin B抗性的细胞株。在该细胞的培养基中加入四环素以诱导目的基因表达,48 h后通过间接免疫荧光方法检测到M2蛋白的表达。共得到16株高表达M2蛋白的重组细胞株,这些细胞株在传10代后仍能稳定表达目的蛋白。未加四环素诱导的细胞没有检测到M2蛋白,说明四环素调控系统严格控制着目的基因的表达。今后,该细胞系可用于流感病毒M2蛋白的功能研究、流感候选疫苗的免疫学评价以及流感病毒减毒活疫苗的研制。

稳定表达流感病毒基质蛋白2的哺乳动物细胞系的建立

本研究构建了稳定表达甲型流感病毒基质蛋白2(M2)的哺乳动物细胞系。应用PCR方法扩增A/PR/8/34(H1N1)株流感病毒M2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)上,构建出pDF-M2重组质粒。将鉴定正确的pDF-M2与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合到宿主细胞染色体上。筛选具有Hygromycin B抗性的重组细胞株命名为CHO-M2。以间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测M2的表达,共获得15株高表达M2蛋白的重组细胞株。这些重组细胞株在连续培养10代后,PCR方法仍可检测到M2基因的存在,IFA也检测到蛋白的稳定表达。本研究成功获得了稳定表达甲型流感病毒M2的哺乳动物细胞系,为M2蛋白的功能研究和非复制型流感病毒疫苗的研制提供了新的工具。

人凝血因子Ⅶ重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导哺乳动物细胞表达重组人凝血因子Ⅶ(rh FⅦ)。方法利用Bam HⅠ和EcoRⅤ双酶切pc DNA 3.1-FⅦ载体得到FⅦ基因片段,补平后,插入经SalⅠ单酶切、补平并去磷酸化处理的加强型绿色荧光蛋白(GFP)表达盒的p Ad Track-CMV腺病毒穿梭载体,构建p Ad Track-CMV-FⅦ,继而进行酶切和测序鉴定;经PmeⅠ单酶切线性化后,p Ad Track-CMV-FⅦ在BJ5183感受态菌内与p Ad Easy-1腺病毒骨架发生同源重组,构建重组表达FⅦ的腺病毒质粒p Ad-FⅦ;经PacⅠ酶切后的p AdFⅦ,使用PEI试剂转染293A细胞,包装表达FⅦ的重组腺病毒Ad-FⅦ;利用Western印迹检测重组腺病毒Ad-FⅦ介导293A细胞表达FⅦ的蛋白水平;通过观察EGFP的表达来判断质粒转染及病毒感染细胞的效率。结果经酶切和测序鉴定,FⅦ克隆到p Ad Track-CMV腺病毒穿梭载体中,获得重组质粒p Ad Track-CMV-FⅦ;将其与p Ad Easy-1在细菌内发生同源重组,成功获得FⅦ重组腺病毒质粒p Ad-FⅦ;在293A细胞内包装重组腺病毒,Western印迹检测到FⅦ蛋白的表达。结论成功构建重组腺病毒Ad-FⅦ,并实现了rh FⅦ在哺乳动物细胞中的表达,为利用哺乳动物细胞表达rh FⅦ的研究奠定了基础。

剪切力敏感哺乳动物细胞灌流培养工艺开发与实践

目的对剪切力敏感哺乳动物细胞株进行灌流培养工艺开发与优化,以获得高蛋白产量。方法利用N-1种子阶段灌流工艺获得高密度种子用于N阶段强化批次补料工艺开发;使用TPP摇管筛选灌流培养基及初步开发灌流工艺,再进行台式生物反应器工艺放大与优化。结果"种子灌流+强化批次补料"混合工艺的单位体积产能相较于原始批次补料工艺提升46%;建立培养基筛选评分机制并筛选出1种混合培养基(基础+补料培养基)和1种通用灌流培养基,并用于2 L反应器规模灌流工艺放大,采用混合培养基和通用灌流培养基的灌流工艺单位体积产能分别提升335%和460%。结论在N-1阶段和N阶段各自建立了剪切力敏感哺乳动物细胞株灌流工艺,并在N阶段获得高产量。