MAPK和MPF对小鼠受精卵有丝分裂期作用

目的探讨有丝分裂促进因子(MPF)和丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)在小鼠受精卵第一有丝分裂期(M期)中的作用及相互关系。方法分别用MAPK激酶特异性抑制剂(U0126)和MPF特异性抑制剂(roscovitine)抑制受精卵细胞MAPK和MPF的活性,通过同位素测定MAPK和MPF的活性变化,利用显微镜进行形态观察来判定MAPK活性变化对受精卵发育的影响。结果在受精卵第一次有丝分裂期,正常组小鼠受精卵MAPK和MPF的活性均有短暂升高。在U0126处理组,MAPK的活性受抑制会导致受精卵处于M期而不发生分裂,但MPF的活性未受到影响。在roscovitine处理组,MPF的活性受到抑制导致受精卵处于M期不发生分裂,此时MAPK不发生活化。结论MAPK和MPF的活化对于小鼠受精卵完成有丝分裂是不可缺少的,在有丝分裂期MPF参与MAPK的活化。

卵母细胞成熟过程MPF的调控和MPF的作用底物

系统综述卵母细胞成熟过程中成熟促进因子的调控及其作用底物。研究表明,卵母细胞成熟过程中,成熟促进因子的活性受Cdc25、Myt1和Wee1蛋白以及泛素信号途径的调控,而成熟促进因子本身又可作用于下游的信号分子,如Aurora A蛋白、核纤层蛋白和组蛋白等,来发挥其在成熟过程中的中心调控作用。

Hela细胞MPF对未成熟卵母细胞的体外促成熟作用分析

【目的】研究Hela细胞M期促进因子MPF对未成熟卵母细胞的体外促成熟作用的生物活性,并观察单个成熟卵母细胞的中期染色体。【方法】应用秋水仙胺将Hela细胞阻滞在有丝分裂的中期(meta-phase),从中提取MPF蛋白;体外培养基分为无激素组、有激素素组、注射组,将MPF提取物通过显微注射,分别导入3组培养基中的昆明小白鼠未成熟卵母细胞中,观察未成熟卵母细胞发生GVBD(生发泡破裂)、或者排出极体的数量,并对3组两两之间发生GVBD或者排出极体的情况,作统计分析;以及制备并观察成熟卵母细胞的中期相染色体。【结果】经过统计分析说明,发生GVBDD的情况,在注射组与无激素组之间差异有显著性(P<0.05);排出极体的情况,在注射组与无激素组之间,以及注射组与激素组之间差异有显著(P<0.005,P<0.05)。已经观察到了部分成熟卵母细胞的中期染色体。【结论】MPF提取物具有诱导小白鼠未成熟卵母细胞在体外提前恢复减数分裂的生物活性。

原癌基因c-erbB2和c-myb经丝裂原活化蛋白激酶和成熟促进因子途径调节卵母细胞的成熟

本研究探讨了原癌基因c-erbB2和c-myb对小鼠卵母细胞成熟的影响及其在调控卵母细胞成熟中与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)的上下游关系。c-erbB2反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)和c-mybASODN均呈剂量依赖方式抑制卵母细胞的生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)率和第一极体(first polar body,PB1)排放率,并显著延迟其成熟时间。小鼠卵母细胞显微注射重组人c-erbB2蛋白和c-myb蛋白后,培养6h其GVBD率分别比对照组上升了23.1%(P<0.05)和32.2%(P<0.05),培养12h其PB1排放率分别比对照组上升了17.3%(P<0.05)和23.5%(P<0.05)。RT-PCR结果显示,小鼠卵母细胞中存在c-erbB2mRNA和c-mybmRNA表达;c-erbB2ASODN能明显抑制卵母细胞中c-erbB2mRNA和c-mybmRNA的表达,c-mybASODN能明显抑制卵母细胞中c-mybmRNA的表达,对c-erbB2mRNA无明显影响;MAPK抑制剂PD98059以及MPF抑制剂roscovitine在抑制卵母细胞成熟的同时,均能阻断显微注射重组人c-erbB2蛋白和重组人c-myb蛋白对卵母细胞成熟的促进作用,但对卵母细胞中c-erbB2mRNA和c-mybmRNA表达无明显影响。Westernblot结果显示,c-erbB2ASODN、c-mybASODN、PD98059、roscovitine均使卵母细胞中MAPK磷酸化水平和cyclinB1含量下降。结果提示,原癌基因c-erbB2、c-myb在卵母细胞成熟中起重要作用,可能是调控卵母细胞成熟中关键蛋白激酶如MAPK、MPF的上游激活物。

卵巢运输温度及卵母细胞促成熟因子对山羊卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

探讨山羊卵母细胞体外成熟培养的影响因素,为优化山羊体外受精程序奠定基础。比较从屠宰场采摘的山羊卵巢运输温度和体外培养促成熟因子对卵母细胞体外成熟培养和体外受精效果的影响。结果表明,在运输温度接近室温(25±2)℃时的卵母细胞成熟率显著高于接近体温(36±2)℃时的运输温度(成熟率分别为53.8%,35.0%,P<0.01),两种运输温度的卵巢卵母细胞成熟培养后体外受精率无显著差异(分别为37.9%,36.6%,P>0.05)。与在体外成熟基础培养液(M1:M199 media+1μg/mL E2+10μg/mL FSH+10μg/mL LH+20%EGS)中进行成熟培养相比,在基础培养液中仅添加20 ng/mL EGF(M2)和另外添加10%GFF(M3)进行体外成熟培养的卵母细胞成熟率均有明显提高,其中成熟率在M1为53.8%,极显著低于M2的69.5%和M3的72.6%,P<0.01;M2和M3间差异不显著;卵母细胞成熟培养后体外受精率在三者间无明显差异分别为37.9%,39.5%和40.6%,P>0.05。山羊体外受精时从屠宰场采摘的卵巢宜在室温条件下进行运输,在体外成熟培养体系中加入EGF和GFF均可有效促进山羊卵母细胞的体外成熟,但EGF起关键作用。

Wee1B蛋白S15位点突变抑制小鼠1-细胞期受精卵的发育

为研究小鼠Wee1B蛋白S15位点磷酸化状态对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响,构建pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-S15A(Ser突变成Ala)/D(Ser突变成Asp)突变体,体外转录成mRNAs.对小鼠进行超排卵后当晚与雄鼠1∶1合笼,第2 d早取受精卵后培养至S期,显微注射Wee1B-WT(野生型)/KD(激酶失活型)-mRNAs和突变体Wee1B-S15A/D-mRNAs,观察其对受精卵发育、有丝分裂促进因子(MPF)活性及CDC2-pTyr15磷酸化状态的影响.结果表明,过表达Wee1B-WT和Wee1B-S15A/D可有效抑制受精卵有丝分裂进程,明显降低卵裂率.过表达模拟磷酸化的突变明显抑制MPF的活性,CDC2-pTyr15磷酸化状态和MPF活性变化相一致.因此,在小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程中,PKA对小鼠Wee1B蛋白S15位点的磷酸化修饰是控制受精卵G2/M转换的重要方式.

动物克隆核再程序化有关机理的研究进展

近年来 ,动物克隆技术发展迅速 ,不断有新的克隆动物面世。面对克隆效率、克隆动物存活率低的客观事实 ,人们对克隆有关机制做了很多探讨。在移植核的再程序化过程中 ,某些胞浆因子如核质原等在解除已分化细胞核染色质的抑制中发挥了关键的作用 ,同时移植核发生印记基因及非印记基因的去甲基化和重新甲基化的现象 ,这种染色质抑制作用的解除及基因的甲基化现象与移植核的去分化有着密切的联系 ,但其具体机制还不清楚。核移植技术中 ,供核与受体胞质的协调和核再程序化的关系得到大量研究 ,目前普遍认为为了使核再程序化进行得更完全 ,MⅡ期卵母细胞质是适宜的受体 ,而处于G0期或G1期的体细胞核是合适的核供体。

哺乳动物细胞核移植有关机理研究进展

综述了哺乳动物细胞核移植的有关机理 ,包括哺乳动物早期胚胎基因组的转录激活与分化 ,体细胞核全能性的恢复 ,核受体卵母细胞的激活和MPF在细胞周期中的变化及其调节细胞周期的机理。

蛋白激酶在NIH3T3细胞中对促成熟因子的作用

目的:研究蛋白激酶C(PKC)在NIH3T3细胞中,对G2/M期的关键调节因子促成熟因子(MPF)的调控作用,检测MPF两种亚基p34cdc2和cyclinB在翻译水平的改变。方法:用aphidicolin,流式细胞仪检测细胞周期同步化。Westernblot做蛋白表达水平的检测。结果:50μmol/L的OAG使3T3细胞周期阻断在G2/M期。OAG对p34cdc2的表达没有影响,但可以使cyclinB的表达减少,对照组与处理组差异显著。结论:PKC激活剂OAG通过降低cyclinB的表达引起p34cdc2的活性改变而调节细胞周期。

成熟促进因子及其对卵母细胞成熟分裂的调控

卵母细胞的成熟分裂调控机理的研究一直是发育生物学领域的一项重要课题 ,因为卵母细胞是动物体内一种高度特化的细胞 ,在其生长发育过程中有许多独特的现象和规律。卵母细胞的成熟分裂有别于一般细胞的有丝分裂 ,究竟是什么机制调控着卵母细胞的成熟分裂过程呢 ?在现代分子生的学基础理论的帮助下 ,科学家们对真核细胞有丝分裂和卵母细胞成熟分裂的分子生物学调控机理进行了大量研究 ,发现成熟促进因子( maturation promoting factor,MPF)是所有真核细胞有丝分裂和卵母细胞成熟分裂的核心调控物质 ,但 MPF的活性又受到其他很多因素的调节 ,致使

青少年发病的成年型糖尿病的基因与临床研究进展

青少年发病的成年型 糖尿病(MODY)是一组高度异质性的单基因遗传病,其临床特征为发病年龄小于25岁,有3代以上家族遗传史,符合常染色体显性遗传规律。迄今已发现至少5种MODY亚型,它们分别是MODY1 肝细胞核因子4αMODY2 葡萄糖激酶,MODY3-肝细胞核因子1α,MODY4 胰岛素启动子CDY肝细胞核因子1β。本文就MJODY有关的这些基因的结构及功能特点。从基因与临床表现的角度,综述目前国外关于MODY的研究进展。

葡萄转录因子数据库中17个MADS-box成员在果实发育成熟过程中的表达特征分析

【目的】了解17个MADS-box转录因子成员在葡萄果实发育成熟过程中的调控作用。【方法】利用Plantcare软件分析了葡萄类型转录因子的启动子元件,预测其与果实发育、成熟过程相关的潜在作用;以二倍体欧亚种葡萄品种‘魏可’为试材,采用qRT-PCR技术分析了17个MADS-box成员在葡萄果实发育成熟过程中8个重要时期的时空表达模式,初步鉴定参与葡萄果实发育成熟调控的重要成员;果实转色前7 d通过ABA、NAA处理进一步验证其在葡萄果实发育与成熟中的作用。【结果】MADS-box成员的启动子均含有与果实发育、成熟相关的motif作用元件,且其含有的元件个数存在差异,表明其可能在调控葡萄果实发育与成熟过程中功能存在冗余,同时各自的作用可能存在一定的差异;qRT-PCR分析显示,所有成员均在葡萄果实发育成熟过程中表达,且在不同时期呈现差异表达;其中,VvAG和Vv FBP24在果实硬核期高表达,而在果实转色和成熟中几乎不表达,表明其可能参与果实生长发育的正调控;而VvMADS1、VvMADS9、VvSVP-like1和Vv AP3只在果实转色与成熟过程中高表达,说明它们可能促进了果实的转色与成熟;ABA在果实转色特定时期上调了MADS-box家族6个成员的表达,而NAA下调其表达;另一方面,NAA上调了MADS-box家族8个成员的表达,相反ABA下调其表达,表明这些成员可能响应ABA/NAA调控葡萄果实发育与成熟过程。【结论】葡萄转录因子MADS-box的17个成员均参与了果实发育过程的调控。其中,6个成员可能参与了葡萄果实的成熟过程的正调控,而另外8个成员可能促进了葡萄果实的生长发育从而抑制了果实的转色与成熟过程。

中国人早发及多发糖尿病家系中筛查胰岛素启动因子1基因突变

目的 观察中国人早发及多发糖尿病家系胰岛素启动因子 1(IPF1)基因的变异情况。方法 采用PCR SSCP方法筛查 15 4例早发及多发糖尿病家系先证者IPF1基因突变。采用PCR RFLP方法检测突变家系其他成员及两组正常对照的该突变位点。结果 在多发糖尿病家系先证者中发现 1例P2 39Q错义突变 ,该家系另有 6人携带此突变 ,且口服葡萄糖耐量试验均在正常范围。P2 39Q突变未与糖尿病表型共分离。非糖尿病突变携带者餐后 2h血糖水平明显高于非突变携带者 (P =0 .0 2 4 9)。在“超正常”对照中亦检出 1例P2 39Q突变 ,中国人糖尿病家系组和正常对照组突变频率分别为 0 .6 %及 0 .5 %。此频率与斯堪的纳维亚人群相似。结论 尽管IPF1基因突变不是中国人早发及多发糖尿病的主要致病基因 ,但IPF1基因P2 39Q突变可致轻度糖代谢紊乱 。

替米沙坦对2型糖尿病大鼠肾脏内氧化应激及NIH3T3细胞中促成熟因子活性的影响

目的探讨替米沙坦对2型糖尿病大鼠肾脏氧化应激和NIH3T3细胞中促成熟因子(MPF)活性的影响。方法将动物分为正常对照组、糖尿病组及替米沙坦治疗组,检测各组给药4,5,11,17周后的血糖、血胰岛素、血脂(TG,TC),11,17周的血肌酐(Scr)、血尿素(?) (BUN)、尿微白蛋白排泄率(UAE)、肾组织中丙二醛(MDA)含量、铜,锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)及MPF活性。结果与糖尿病组相比,替米沙坦治疗组血糖、血胰岛素及血脂无明显变化,而Scr,BUN,UAE、肾脏MDA含量、肾细胞膜MPF均明显下降,肾脏抗氧化酶活性(Cu,Zn-SOD,CAT,GSH-Px)则明显上升。肾脏内MDA含量的变化及抗氧化酶活性的变化与细胞膜、细胞浆MPF活性的变化相关。结论替米沙坦可以抑制2型糖尿病大鼠肾脏内的氧化应激,并且可能与其下调NIH3T3细胞中MPF活性有关。

双丁酰环腺苷酸通过蛋白激酶Wee1B调控小鼠1-细胞期受精卵的发育研究

目的 探讨蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)激活剂双丁酰环腺苷酸(dual dibutyryl cyclic AMP,dbc AMP)调控蛋白激酶Wee1B蛋白对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响,为进一步研究母源性因子Wee1B在早期胚胎发育过程中的作用提供理论基础。方法将2 mmol/L dbc AMP作用于小鼠1-细胞期受精卵1 h,并显微注射Wee1Bm RNAs,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、Wee1B-WT/KD注射组、Wee1B-S15A/D注射组,继续在M16培养基中培养。相差显微镜下观察小鼠受精卵的形态变化和卵裂情况,放射自显影测定各期细胞有丝分裂促进因子(MPF)活性,Western blotting方法检测Wee1B蛋白的表达、CDC2-p Tyr15和Wee1B-p Ser15的磷酸化水平。结果小鼠受精卵在有dbc AMP存在时,G_1、S、G_2和M各细胞周期均检测到磷酸化的Wee1B表达,非磷酸化条带在G_2期和M期才能检测到;各组受精卵卵裂出现时间延迟,卵裂率显著降低;h CG注射后35 h内,MPF活性一直处于低水平,CDC2-p Tyr15磷酸化状态和MPF活性变化趋势相一致。结论dbc AMP激活PKA后,PKA磷酸化Wee1B蛋白的S15位点,Wee1B活性增加,阻滞受精卵分裂,本研究提示Wee1B蛋白的S15位点可能是PKA作用的生理靶点,可以更好地认识早期胚胎发育的分子事件。

小鼠卵母细胞体内成熟过程中CDK1蛋白及其mRNA的动态变化

目的 探讨小鼠卵母细胞体内成熟过程中细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1)蛋白和CDK1 mRNA表达的动态变化。方法 将6~8周龄SPF级ICR雌性小鼠68只随机分为4组,根据获取卵母细胞的时期分为GV组、GVBD组、MⅠ组和MⅡ组,每组17只。腹腔注射10 U孕马血清促性腺激素(PMSG)48 h后,颈椎脱臼处死法处死小鼠,获取GV期卵母细胞;注射PMSG 48 h后注射10 U人绒毛膜促性腺激素(HCG),分别于注射HCG后4 h、8 h和12 h后获取GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母细胞。Western blot检测各阶段卵母细胞CDK1蛋白的表达,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各阶段卵母细胞中CDK1 mRNA的表达,并采用Spearman相关分析检验CDK1 mRNA和蛋白表达的相关性。结果 Western blot结果显示,CDK1蛋白在GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母细胞均有表达,且随着卵母细胞的体内成熟,CDK1蛋白表达量持续增加(P<0.05)。qRT-PCR结果显示,CDK1 mRNA在GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母细胞均有表达;与GV期比较,GVBD期和MⅠ期CDK1 mRNA表达水平均显著下调(P<0.05),而MⅡ期CDK1 mRNA表达水平显著上调(P<0.05)。Spearman相关分析显示,卵母细胞体内成熟过程中CDK1蛋白与CDK1 mRNA表达的相关性较差(R=0.200)。结论 卵母细胞体内成熟过程中CDK1蛋白的增加并不完全是由转录水平的变化引起的,其他一些机制可能在转录后水平上影响CDK1蛋白的翻译。本研究为进一步深入探讨卵母细胞成熟的分子机制奠定了一定基础。

口腔肿瘤及正常组织中M期促进因子的活性

目的 通过对口腔正常组织与混合瘤、高分化粘液表皮样癌及颊癌中的M期促进因子(M phasepromotingfactor,MPF)的存在状态及活性的比较 ,探讨MPF与口腔肿瘤的发展及恶性度间的关系。方法 利用免疫印迹法及Gollicano法测定MPF的量并进行活性测定分析。结果 MPF的 2个亚基cdc2及CyclinB都存在于口腔正常组织、混合瘤、高分化粘液表皮样癌及颊癌中 ,且肿瘤组织中的MPF量高于正常组织 ;肿瘤组织中的MPF的活性量高于正常组织。颊癌较正常组织高 6 4% ,提示很可能MPF的活性变化与肿瘤的恶性度有关。结论 MPF存在于正常组织、混合瘤、高分化粘液表皮样癌及颊癌中 ,肿瘤组织中的量及活性均高于正常组织。蛋白激酶C可激活MPF ,在肿瘤组织中蛋白激酶C可能通过激活MPF来促进肿瘤的增殖。MPF的活性可能与肿瘤的发展及恶性度相关。

CDC25B蛋白S149/S321位点突变对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响

目的:研究小鼠CDC25B蛋白S149位点对小鼠1-细胞期受精卵发育的影响及S149位点与S321位点的关系。方法:构建pBSK-CDC25B-S149A和pBSK-CDC25B-S149A/S321A突变体,体外转录成mRNA;采用小鼠超排卵技术取G1期受精卵,显微注射CDC25B-WT-mRNA和突变CDC25B-S149A-mRNA、CDC25B-S149A/S321A-mRNA,观察其对受精卵发育、M期促进因子(MPF)活性及CDC2-pTyr15磷酸化状态的影响。结果:CDC25B-S149A-mRNA注射组受精卵卵裂率明显高于CDC25B-WT-mRNA注射组,MPF活性提前1 h达到高峰;而联合突变体CDC25B-S149A/S321A-mRNA注射组卵裂率又显著高于CDC25B-S149A-mRNA注射组。结论:在小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程中,蛋白激酶A(PKA)对小鼠CDC25B蛋白S149位点的磷酸化修饰是控制受精卵G2/M转换的重要方式,并且S149位点与S321位点可能具有协同作用。

蛋白激酶A对CDC25B蛋白S149与S321位点磷酸化的修饰抑制小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂

在小鼠1-细胞期受精卵,蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）可通过磷酸化细胞分裂周期25B（cell division cycle25B,CDC25B）的321位Ser引起受精卵分裂阻滞。本文旨在研究PKA对CDC25B149位点Ser的磷酸化对小鼠受精卵发育的影响,及其与321位点的关系。质粒pBSK-CDC25B-WT（野生型）、pBSK-CDC25B-S149A（149位Ser突变成Ala）、pBSK-CDC25B-S321A（321位Ser突变成Ala）、pBSK-CDC25B-S149A/S321A（149位和321位Ser联合突变成Ala）体外转录成mRNAs;显微注射入小鼠S期受精卵中,在PKA抑制剂H-89预处理的M16培养基中培养,观察其对受精卵发育、有丝分裂成熟促进因子（matu-ration promoting factor,MPF）活性及CDC2-Tyr15磷酸化状态的影响。结果显示,H-89呈剂量（0~50μmol/L）依赖性的方式加速小鼠受精卵卵裂。然后选择卵裂率接近100%、H-89（40μmol/L）培养的小鼠受精卵,与对照组相比,CDC25B各种mRNAs注射组受精卵卵裂率明显增高,MPF活性提前达到高峰;CDC2-Tyr15磷酸化状态和MPF活性变化相一致,以上结果说明,CDC25B蛋白的149位Ser也是PKA在体内调控CDC25B的重要靶点。因此在小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂过程中,PKA对小鼠CDC25B蛋白S149位点与S321位点的磷酸化修饰可能是控制受精卵G2/M转换的重要方式。

叶酸对非洲爪蟾卵母细胞体外成熟的影响及作用机制

目的探讨叶酸(folic acid,FA)对非洲爪蟾卵母细胞体外成熟的影响及作用机制。方法将健康卵母细胞移入含不同浓度FA(分别为125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L和1 000μmol/L)的ND96培养液中体外培养,同时设立阴性对照组和孕酮阳性对照组。加FA后每隔1 h观察1次细胞生发泡破裂(germinal vesicle break-down,GVBD),记录发生GVBD的卵母细胞数量,计算GVBD率,同时用10%三氯乙酸溶液固定后,切开进行确认。观察6 h后收集各组卵母细胞,采用蛋白免疫印迹实验(Western Blotting)检测CyclinB2,Mos,p-ERK1/ERK1蛋白的表达。结果除FA 125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1 000μmol/L组2 h时与空白对照组GVBD率之间差异无统计学意义,其余各记录点的GVBD率与空白对照组间差异均有统计学意义(均有P<0.05);Western Blotting分析显示,FA和孕酮处理后卵母细胞的p-ERK1,CyclinB2,Mos蛋白表达水平明显升高。结论 FA可促进爪蟾卵母细胞体外成熟过程中GVBD发生,提示FA对爪蟾卵母细胞的成熟具有促进作用,其作用机制可能与干扰成熟促进因子和丝裂原活化蛋白激酶有关。