毒素蛋白基因mazF在基因修饰系统中的应用进展

毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA系统)存在于大部分细菌中。mazEF是大肠杆菌中一种毒素-抗毒素系统。毒素基因mazF编码的MazF毒素蛋白可以特异性地剪切自由mRNA的ACA序列,从而抑制蛋白合成、引起细胞生长停滞;近些年,许多学者利用mazF基因作为反向筛选标记对不同种微生物建立了无标记或无痕的基因修饰系统,并实现了不同菌株的基因组修饰。主要综述了大肠杆菌mazF基因作为反向筛选基因的应用原理及其在不同种类微生物的基因修饰系统中的应用进展,然后对mazF基因及其他毒素基因在基因修饰系统中的应用进行了展望。

一种谷氨酸棒杆菌基因无痕敲除载体的构建及应用

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)23604编码赖氨酸胞内转运蛋白基因lys P为敲除对象,利用重叠PCR技术将lys P基因的上下游同源臂融合,并构建了由木糖启动子P_(xyl)和毒素蛋白基因maz F组成的筛选盒,同时无缝克隆连接至带有卡那霉素抗性基因的p TOPO载体中,经电转化及两次同源单交换筛选,实现lys P基因的无痕敲除。结果表明,经过卡那霉素抗性筛选、木糖二次筛选及基因组PCR鉴定后,成功获得lys P基因缺失菌株C.glutamicum 23604Δlys P;发酵后C.glutamicum 23604Δlys P赖氨酸产量较对照菌株产量提高了10.8%。该实验以大肠杆菌毒素蛋白基因maz F作为反向筛选标记的敲除载体,实现谷氨酸棒杆菌lys P的高效敲除;lys P基因的敲除使得赖氨酸不能进入胞内而在胞外积累,从而达到增产赖氨酸的目的。

用于枯草芽孢杆菌的反选改造方法

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是微生物发酵中应用最广泛的一种微生物,其在酶类生产中的应用已经实现工业化,具有重要的工业应用价值。本文简要介绍了三种构建转化质粒反选盒子的方法,其不仅具有简单高效,能够进行连续的基因插入操作,同时还具有定点突变、大片段删除以研究未知基因的功能等特点,因此具有很广泛的研究和应用前景。

依赖HIV-1Tat的毒素蛋白MazF表达系统的建立

目的 建立HIV-1 Tat依赖的MazF表达载体pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR系统.方法 分别扩增HIV-1 U3TAR和MazF基因片段,通过重叠PCR将U3TAR和MazF连接起来,并TA克隆到pMD18T载体中.通过PCR为MazF引入HA标签,获得U3TAR-MazF-HA.经过双酶切和连接反应,将U3TAR-MazF-HA反向插入到pcDNA3.1,获得pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR.将GFP基因正向插入到MazF基因之后,为该载体引入了荧光报道基因,获得pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR.结果 与pcDNA3.1-tat-flag的共转染实验证明,构建的MazF表达载体pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR是Tat依赖的.对比pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR单转染的细胞,共转染的细胞具有更少的绿色荧光信号,表明表达的MazF可以下调报道基因GFP的表达.结论 pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的构建,为探索基于MazF的艾滋病基因治疗方案提供了载体工具.