重组人Cu,Zn-SOD包含体的复性、纯化及复性蛋白稳定性研究

目的通过体外复性和纯化技术获得具有高纯度、高生物活性的重组人铜锌超氧化物歧化酶（rhCu,Zn-SOD）,并研究复性蛋白的稳定性。方法以透析法对在大肠杆菌中以包含体形式表达的rhCu,Zn-SOD进行复性,采用金属螯合亲和层析对复性样品进行纯化,通过酶活性测定考查复性和纯化的rhCu,Zn-SOD的热稳定性、pH稳定性和对变性剂的稳定性。结果建立了体外透析复性的基本条件,其比活可达2 380 U·mg^-1。该复性样品经金属螯合亲和层析纯化后,结果得到纯度大于95%、比活5 000 U·mg^-1、活性回收率大于100%的目的蛋白。复性和纯化蛋白在温度25-70℃和pH 5.0-10.5内活性稳定,并可耐受2-10 mol·L^-1的尿素和2%-8%的十二烷基硫酸钠（SDS）,对更强烈的变性剂盐酸胍稳定性较弱。结论确定了重组人Cu,Zn-SOD包含体的体外复性条件和复性蛋白纯化方法,且复性蛋白表现出很好的稳定性,为重组人Cu,Zn-SOD的生产奠定了良好基础。

金属螯合亲和层析纯化和复性重组人铜锌超氧化物歧化酶

将重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhCu,ZnSOD)包含体(经纯化后纯度达80%以上)以稀释法或透析法初步复性后,分别再经金属螯合亲和层析(MCAC)纯化。结果透析复性样品和稀释复性样品经MCAC纯化后的rhSOD比活是各自上柱前样品比活的2.2倍和5.3倍,蛋白回收率分别为64%和25%,同时两者活性回收率皆大于130%。表明目标蛋白rhSOD在经过MCAC纯化的同时又获得进一步复性。SDSPAGE显示rhSOD为19kD的单一条带,纯度大于95%,比活达到5000umg左右,同时NBT生物活性染色鉴定显示出很强的超氧化物歧化酶活性。表明MCAC对于复性不完全的rhCu,ZnSOD而言是一种纯化和使其进一步复性的简便省时且有效的方法。该方法为以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化和复性提供了新思路。

以硅胶和Agarose 6B为载体金属螯合亲和层析分离纯化重组人Cu,Zn-SOD

以层析硅胶Agarose 6B ,制备了Cu2 + 螯合亲和载体 ,利用合成的Cu2 + IDA 硅胶亲和柱和Cu2 + IDA Agarose 6B亲和柱分离纯化了重组人Cu ,Zn SOD ,并比较了这两 2亲和载体的纯化效果和性能。硅胶纯化SOD的比活、纯化倍数和回收率分别为 75 86U/mg·protein、6 .5倍和 86 .7% ;而Agarose 6B纯化SOD的比活、纯化倍数和回收率则分别为 6 2 2 3/mg·protein、5 .8倍和 93.0 %。 2种亲和载体 5次使用后 。

金属螯合亲合层析(MCAC)分离血红素肽-铁及功能活性研究

利用聚丙烯酰胺为载体,对猪血红蛋白酶降解产物进行金属螯合亲合层析分离,以获得一种纯度高的血红素肽-铁。采用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALDI-TOF.MS)分析血红素肽-铁的分子结构,做体外清除氧自由基能力试验,结果表明:经SDS-PAGE和高效凝胶色谱法分析,分离出的血红素肽-铁纯度高;经MALDI-TOF.MS测定得血红素肽-铁分子质量约为7 529 Da;结合猪血红蛋白氨基酸顺序以及胰蛋白酶固定酶切位点,推断该血红素肽-铁分子由60氨基酸构成,氨基酸序列为GTFAKFFEKHLQDLKVHLTAAEKLSEL-HCDKSAILDLWGKVLASFSEGLKLHVDPENFR。血红素肽-铁在体外具有较强的抗氧化、清除超氧阴离子和.OH能力以及抑制脂质过氧化作用。