猪SsMT-1A和SsMT-2A的原核表达及金属结合特性研究

【目的】通过对猪(Sus Scrofa)金属硫蛋白1A(metallothionein-1A of S.Scrofa,SsMT-1A)和2A(Metallothionein-2A of S.Scrofa,SsMT-2A)的生物信息学分析、原核表达和纯化,研究它们与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性。为饲料中添加Zn和Cu在促进猪生产性能的作用机制研究提供理论基础。【方法】首先,从NCBI中获得SsMT-1A和SsMT-2A的基因序列,利用ClustalX2和ExPASy分析两者的蛋白序列和结构差异,利用MEGA-X构建两者与其他物种MT蛋白分子的进化树。其次,构建pET-28a-SUMO-SsMT-1A/SsMT-2A原核表达载体,转化BL21(DE3)plysS,用IPTG诱导表达。利用Ni-NTA柱亲和层析和葡聚糖凝胶层析纯化重组蛋白。最后,利用大肠杆菌金属耐受性实验、圆二色光谱(circular dichroism,CD)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser analytic ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和等温微量热仪(isothermal micrometer calorimetry,ITC)分析SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性。【结果】生物信息学分析表明:SsMT-1A和SsMT-2A蛋白分子的同源性较高,半胱氨酸(Cysteine,Cys)含量和排列基序完全一致,仅有8个非Cys位点差异。经原核表达、Ni-NTA柱和Superdex-75柱纯化、SUMO酶酶切,成功获得了SsMT-1A和SsMT-2A。金属耐受性试验表明:与SsMT-2A相比,转SsMT-1A大肠杆菌具有较强的Zn和Cu耐受性。CD光谱表明:SsMT-1A和SsMT-2A均可与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合,两者均展示了Zn(Ⅱ)结合偏好性,然而,SsMT-1A较SsMT-2A具有较强的Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合能力。MALDI-TOF-MS表明:apo-SsMT-1A和apo-SsMT-2A的分子量分别为6047.5 Da和6048 Da,SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)的结合稳定,与Cu(Ⅰ)的结合不稳定。ITC表明:SsMT-1A和SsMT-2A与Zn(Ⅱ)的结合不稳定,与Cu(Ⅰ)的结合稳定,两者结合Cu(Ⅰ)的化学计量数均为7,SsMT-1A结合Zn(Ⅱ)的化学计量数为2。【结论】虽然SsMT-1A和SsMT-2A具有较高的同源性,然而,8个非Cys位点的差异决定了两者金属结合特性的差别。尽管SsMT-1A和SsMT-2A共享了高度一致的Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合行为,然而,两者与Zn(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)的结合特性存在细微差别,两者不应被认为是完全生理等价分子。在生理条件下:SsMT-1A可能发挥重金属离子的解毒作用,SsMT-2A可能发挥Zn内稳态的调控作用。本研究为进一步阐明SsMT-1A和SsMT-2A调节金属离子内稳态,发挥促进猪生产性能的作用研究奠定了基础。

Metallothionein 1 Isoform Gene Expression Induced by Cadmium in Human Peripheral Blood Lymphocytes

Objective To study the gene expression of metallothionein 1 （MT-1） isoforms in human peripheral blood lymphocytes （HPBLs）. Methods The expression of mRNA representing the seven active MT-I genes was determined in HPBLs by quantitative RT-PCR before and after exposure to cadmium. Results Basal expressions of MT-IX, and MT-1A in HPBLs were similar to expression of housekeeping gene. In contrast, the basal gene expressions of MT- 1 H, IF, 1E, and 1G were a little transcripts in human HPBLs. No signal was detected for MT-1B. There was a sex difference （P〈0.05）. in basal gene expression of MT-1E. The levels of gene expression of MT-1A, 1E, IF, 1G, 1H, and 1X increased, but the level of MT-1B did not increase after exposure to cadmium. Conclusions Gene expressions of MT-1 G, MT-1 H, MT-1 F, and MT-1X in HPBLs can be used as a potential biomarker of cadmium exposure.

呫吨酮并吡啶衍生物XP-16诱导人肺癌A549细胞凋亡

目的探讨呫吨酮并吡啶衍生物5,9-二(2-吡咯烷基乙酰氨基)-7H-吡啶并[4,3-c]呫吨-7-酮(XP-16)对人肺癌A549细胞的抗肿瘤作用及其可能作用机制。方法通过MTT法、细胞形态学和克隆实验观察XP-16对A549细胞增殖的影响;应用Hoechst 33258和PI双染法观察细胞凋亡;荧光分光光度计检测细胞内钙([Ca2+]i)及线粒体膜电位;qRT-PCR检测Bad和金属硫蛋白1A(metallothionein 1A,MT-1A)mRNA表达。结果 XP-16能抑制A549细胞增殖,呈剂量和时间依赖性。XP-16作用A549细胞24 h后,A549细胞出现染色质聚集、核碎裂等典型的凋亡形态学改变;随XP-16剂量的增加,A549细胞凋亡百分率逐渐增大。XP-16作用后,A549细胞的[Ca2+]i和线粒体膜电位降低、Bad和MT-1A mRNA的表达增加。结论 XP-16具有诱导A549细胞凋亡的作用,可能与其降低[Ca2+]i和线粒体膜电位有关。MT-1A表达的上调可能是[Ca2+]i降低的结果。

呫吨酮并吡啶衍生物XP-16抗人胃癌MGC-803细胞作用

目的探讨呫吨酮并吡啶衍生物5,9-二(2-吡咯烷基乙酰氨基)-7H-吡啶并[4,3-c]呫吨-7-酮(XP-16)抗人胃癌MGC-803细胞作用及其可能作用机制。方法通过MTT法、细胞形态学和克隆实验观察XP-16对MGC-803细胞增殖;应用Hoechest33258和PI双染法观察细胞凋亡;采用荧光分光光度计检测细胞内钙([Ca2+]i)及线粒体膜电位;RT-PCR检测Bad和金属硫蛋白1A(MT-1A)mRNA的表达。结果 XP-16能抑制MGC-803细胞增殖,呈浓度(r=0.88,P<0.01)和时间(r=0.93,P<0.05)依赖性。XP-16作用MGC-803细胞24 h后,MGC-803细胞出现染色质聚集、核碎裂等典型的凋亡形态学改变,且随XP-16浓度的增加,MGC-803细胞凋亡百分率逐渐增大。XP-16作用后,MGC-803细胞的[Ca2+]i和线粒体膜电位降低、Bad和MT-1A mRNA表达增加。结论 XP-16可通过诱导细胞凋亡抑制MGC-803细胞增殖,其机制可能与其降低[Ca2+]i和线粒体膜电位有关,而细胞内MT-1A表达的上调可能是[Ca2+]i下降的结果。

呫吨酮并吡啶衍生物XP-15抗人胃癌MGC-803细胞作用及其机制研究

目的研究呫吨酮并吡啶衍生物9-(2-吗啡啉乙酰胺基)-7H-吡啶并(4,3-c)呫吨-7-酮(XP-15)抗人胃癌MGC-803细胞的作用及其可能的机制。方法实验包括5个组,分别为空白对照组、5-氟尿嘧啶(5-FU)组、10μmol/L XP-15组、50μmol/L XP-15组和100μmol/L XP-15组。通过MTT法、细胞形态学和克隆实验观察XP-15对MGC-803细胞增殖的影响;应用Hoechest33258和PI双染法观察给药前后MGC-803细胞凋亡情况;用荧光分光光度计检测XP-15对细胞内钙Ca2+i及线粒体膜电位的影响;用RT-PCR检测Bad和金属硫蛋白1A(metallothionein 1A,MT-1A)mRNA的表达,比较给药前后的变化。结果 XP-15能明显抑制MGC-803细胞增殖,χ2=19.40,P<0.01;对MGC-803细胞克隆的抑制作用,呈剂量和时间依赖性,χ2=16.58,P<0.01。XP-15作用MGC-803细胞24h后,100μmol/L XP-15引起MGC-803细胞凋亡率为25.1%,明显高于空白对照组的9.4%,χ2=29.76,P<0.01。XP-15作用后,MGC-803细胞的Ca2+i(χ2=165.81,P<0.01)和线粒体膜电位(χ2=830.77,P<0.01)降低,Bad和MT-1A mRNA表达增加明显。结论 XP-15能诱导MGC-803细胞凋亡,其机制可能是通过降低MGC-803细胞Ca2+i和线粒体膜电位以及上调MT-1A表达来实现的。

金属硫蛋白基因多态性与昆明地区汉族2型糖尿病的相关性研究

目的 探讨金属硫蛋白(MT)1A基因rs8052394多态性与昆明地区汉族T2DM的相关性。方法 采用Taqman实时荧光定量PCR技术对257例T2DM患者(T2DM组)和108名健康对照(NC)组MT1A基因型进行检测。结果 T2DM组MT1A基因rs8052394A/A基因型频率及A等位基因频率高于NC组(χ~2=20.519、29.213,P<0.01)。Logistic回归分析显示,MT1A rs8052394A/A基因型携带者相对于A/G和G/G基因型携带者患T2DM的危险性增加。结论 昆明地区汉族人群MT1A基因rs8052394多态性可能与T2DM的发生有关,A等位基因可能增加T2DM的发病风险。