ISOLATION AND PURIFICATION OF METHANE IVf ONOOXYGENASE FROM METHYLOMONAS SPECIES GYJ3

A three—component enzyme system that catalyzes in vivo the oxidation of CH_4 to CH_3OH has been purified with high specific activity from an unusual type I methanotroph through the use of stabilizing reagents.

好氧甲烷氧化菌生理生态特征及其在自然湿地中的群落多样性研究进展

甲烷氧化菌是一类可以利用甲烷作为唯一碳源和能源的细菌,在全球变化和整个生态系统碳循环过程中起着重要的作用。近年来,对甲烷氧化菌的生理生态特征及其在自然湿地中的群落多样性研究取得了较大进展。在分类方面,疣微菌门、NC10门及两个丝状菌属甲烷氧化菌的发现使其分类体系得到了进一步的完善;在单加氧酶方面,发现甲烷氧化菌可以利用pM MO和sM MO两种酶进行氧化甲烷的第一步反应,Ⅱ型甲烷氧化菌中pM MO2的发现证实甲烷氧化菌可以利用这种酶氧化低浓度的甲烷;在底物利用方面,已经发现了越来越多的兼性营养型甲烷氧化菌,证实它们可以利用的底物比之前认为的更广泛,其中包括乙酸等含有碳碳键的化合物;在生存环境方面,能在不同温度、酸度和盐度的环境中生存的甲烷氧化菌不断被分离出来。全球自然湿地甲烷氧化菌群落多样性的研究目前主要集中在北半球高纬度的酸性泥炭湿地,Ⅱ型甲烷氧化菌Methylocystis、Methylocella和Methylocapsa是这类湿地主要的甲烷氧化菌类群,尤其以Methylocystis类群最为广泛,而Ⅰ型甲烷氧化菌尤其是Methylobacter在北极寒冷湿地中占优势。随着高通量测序时代的到来和新的分离技术的发展,对甲烷氧化菌的现有认识将面临更多的挑战和发展。

甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的研究进展

甲烷氧化菌是以甲烷作为唯一碳源和能源进行同化和异化代谢的微生物,其关键酶之一是甲烷单加氧酶(MMOs),可以在氧气的作用下催化甲烷等低碳烷烃或烯烃羟基化或环氧化,甲烷氧化菌在自然界碳循环和工业生物技术中具有重要的应用价值。因此,近20年来对于甲烷氧化菌和MMOs的研究一直倍受生物学家的关注。以下从现代生物技术的角度,对近年来国内外在甲烷氧化菌的分类与分布,MMOs的结构与功能、甲烷氧化菌与MMOs的基因工程等方面取得的研究成果进行了总结,全面综述了甲烷氧化菌及MMOs的应用基础研究现状,并对其今后的研究和应用方向提出了展望。

甲烷单加氧酶的催化反应机理研究

本文就甲烷单加氧酶近年来在催化反应机理方面的最新研究成果进行了详细阐述。甲烷 C—H键的活化机理主要包括自由基回弹机理和协调的氧插入机理。运用自由基探针底物和量化计算等方法对烷烃羟基化反应机理的直接研究表明 ,目前没有一个统一的机理来解释甲烷单加氧酶的反应过程。反应机理的类型可能取决于 MMO的来源或者其他因素。对甲烷单加氧酶的几种中间化合物的各种光谱学研究有力地推动了机理研究的发展。

甲烷生物催化氧化制甲醇──固定化细胞催化剂的制备及其催化性能的研究

研究了利用无机载体（活性炭、氧化铝、分子筛等）吸附法和天然藻胶（海藻酸钙等）包埋法制备的固定化甲烷氧化细菌的催化性能及其在生物反应器中的反应．结果表明，在进行甲烷制甲醇的反应中，活性炭吸附制备的固定化细胞的操作稳定性最好，但其初始酶活性与休止游离细胞相比损失了６０％～８０％；海藻酸钙包埋的固定化细胞初始酶活性高（与游离细胞相比，可保持５５％～９０％的酶活性），但反应中甲醇累积速率很低；而双重介质（琼脂陶瓷粒）包埋的固定化细胞有利于保持固定化细胞的酶活性，增加操作稳定性。

甲烷氧化细菌Methylosinus trichosporium 3011甲醇累积条件的研究

本文考察了甲烷氧化细菌Methylosi nus trichosporium 3011的生理特性及反应条件对甲烷单加氧酶和甲醇累积的影响。M.3011菌株在4℃保存30～40天内,菌株的细胞生长量和甲烷单加氧酶活性均不受影响。在生长对数期收获细胞,其甲烷单加氧酶活力最高可达125nmol甲醇/mg(细胞干重)·min。在M.3011菌株的生长对数期后期收集细胞,将反应菌悬液浓度控制在0.15—0.3mg(细胞干重/ml,pH为6.7,反应温度为35℃,甲醇累积量可达3.1μmol甲醇/mg(细胞干重)·h。反应液的磷酸缓冲液的最适浓度为60mmol/L。

甲烷单加氧酶的催化机理

研究了来源于Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓｓｐ．ＧＹＪ３菌的甲烷单加氧酶（ＭＭＯ）的催化机理．结果表明，用还原剂处理羟基化酶可得到不同还原态的羟基化酶，其中全还原态的羟基化酶具有ＭＭＯ催化活性，还原酶和调节蛋白单独存在时均没有ＭＭＯ活性，确定了羟基化酶组分是ＭＭＯ的催化活性中心．用紫外光谱法证实了ＮＡＤＨ和还原酶之间的相互作用，即还原酶接受ＮＡＤＨ的电子，使氧化态的ＦＡＤ转化为还原态的ＦＡＤ．ＭＭＯ的电子传递过程为ＮＡＤＨ→还原酶→羟基化酶．调节蛋白作用于还原酶和羟基化酶的电子传递过程能使ＭＭＯ的活性提高４０倍．

一个Ⅱ型甲烷氧化菌中甲烷单加氧酶羟基化酶的分离纯化和理化性质

甲烷氧化细菌能够催化甲烷和一系列小分子烃类化合物的羟基化反应,对控制全球变暖起着重要作用,在工业催化和生物除污中具有非凡的潜能。应用层析方法纯化了Ⅱ型甲烷氧化细菌MethylosinustrichosporiumIMV3011中甲烷单加氧酶的羟基化酶,并对其进行了表征。凝胶过滤法测定了该酶分子量为201.3kD;SDS-PAGE表明羟基化酶含有三个亚基(αβγ),分子量分别为58kD、36kD和23kD,比较两种方法证明该羟基化酶是一个同型二聚体构型(αβγ)2,总分子量为234kD。薄层等电聚焦测定该酶的等电点为5.2。酶的比活力为603.6nmol/(min.mg),活力回收为34.3%。HPLC法测定该酶的纯度在95%以上。原子吸收光谱显示每分子羟基化酶中含有3.02个Fe原子。羟基化酶的稳定性pH值为6.2～7.5,稳定性温度为低于35℃。菌株IMV3011的细胞表观构型呈现了长型、稍微弯曲的杆状形态。

甲基单胞菌整细胞催化环氧丙烷的连续生物合成

利用含有甲烷单加氧酶 (MMO)的甲基单胞菌Methylomonassp .GYJ3整细胞催化丙烯环氧化制取环氧丙烷时 ,辅酶NADH的消耗和产物抑制是反应难以连续进行的主要原因 .为解决这些问题 ,通过批式反应考察了丙烯 甲烷共氧化反应合成环氧丙烷的可能性 ,发现反应气体中甲烷含量为 30 %时环氧丙烷的产量较高 .在搅拌式生物反应器中 ,通过最佳配比的混合反应气体的连续循环将产物环氧丙烷抽提出来 ,从而克服了产物抑制 .该生物反应器最初的环氧丙烷日产量为 2 6 8μmol,连续操作 12d后 ,MMO仍保留 96

甲烷单加氧酶的催化性能

研究了来源于Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓｓｐ．ＧＹＪ３菌的甲烷单加氧酶（ＭＭＯ）的催化性能．结果表明，当组成该酶的三个组分，羟基化酶、调节蛋白Ｂ和还原酶的摩尔比为１∶１．７∶２．０时，重组的ＭＭＯ体系酶的比活最高，为３４２ｎｍｏｌ／（ｍｇ·ｍｉｎ）．当反应体系的ｐＨ在６．５～７．５时，ＭＭＯ酶的活力最大．研究了纯ＭＭＯ催化甲烷羟基化反应和丙烯环氧化反应的特性，以及金属离子和电子给体对ＭＭＯ催化反应的影响．

甲烷单加氧酶的化学模拟——酚氧双羧酸根桥联Fe_2(Ⅲ)和Mn_2(Ⅲ)配合物合成、表征及催化性能

合成表征了酚氧、双羧基桥联双组氨酸的手性双铁核配合物和双锰核配合物,研究了它们催化亚碘酸苯对烯烃的环氧化反应和对环烷烃的羟化反应.结果表明这种Fe_2(Ⅲ)和Mn_2(Ⅲ)配合物均是有效的甲烷单加氧酶(MMO)模型化合物,其中Fe_2配合物能较好地再现MMO的某些性质,如电子光谱等.Fe_2配合物催化苯乙烯环氧化反应生成环氧苯乙烷的产率为840％(以催化剂计),且R-(+)-构型对映体过量(e.e.)达45.4％,相应的Mn_2配合物则以7080％产率给出环氧苯乙烷,R-(+)-构型对映体过量51.6％.Mn_2配合物还能够催化环己烯和环己烷的氧化反应,产物及其分布分别为环氧环己烷3880、环己烯醇603、环己烯酮189和环己醇1053、环己酮639％(以催化剂计).EPR研究表明MM=O是反应的活性中间体.

外源电子给体对甲烷单加氧酶催化丙烯环氧化反应活性的影响

以丙烯氧化反应为指标研究了不同外源电子给体对甲烷细菌(Methylomonas sp.GYJ30)休止细胞催化活性的影响。结果表明甲烷、甲醇、甲醛和甲酸盐作为电子给体加入反应中,将甲烷单加氧酶催化丙烯环氧化反应活性分别提高5.3,12.7,10和12.4倍。以甲烷和甲醛作为外源电子给体时提高初始浓度对甲烷单加氧酶具有抑制作用;而以甲醇和甲酸盐作为电子给体时提高初始浓度对甲烷单加氧酶催化活性无明显抑制作用。研究了甲醇作为电子给体时它的代谢、环氧丙烷的积累以及催化反应活性与反应时间的关系。

甲烷单加氧酶的研究进展

甲烷氧化细菌在转化甲烷制造新型燃料、单细胞蛋白和新功能酶生产、污水处理等方面有着潜在的应用前景,因此,甲烷单加氧酶作为其代谢过程中重要的酶系也受到人们的广泛关注。我们简要综述了近年来对甲烷单加氧酶的性质、结构、催化机理等方面的研究,特别是对颗粒性甲烷单加氧酶的相关性质进行了详细的阐述。

甲烷生物催化氧化制甲醇——几种化学物质对Methylosinus trichosporium 3011甲醇累积的影响

本文报导了在 Methylosinus trichosporium 3011细胞反应液中加入一些化学物质对甲醇累积的影响。结果表明,Na^+抑制甲烷单加氧酶的活性。当 M.trichosporium 3011细胞反应液中含高浓度磷酸根时,只有很少量甲醇累积下来。EDTA 和 Na_2EDTA 甲醇累积的促进作用小于甲酸钠或甲酸的作用。但由于 EDTA 不仅可以抑制甲醇脱氢酶的活性,而且可以螯合 Na^+,而甲酸则可使 NADH 辅酶再生。因此,反应液中含有2mM EDTA 和20mM 甲酸时甲醇累积量最高。

油气田土壤DNA提取方法及油气指示菌基因定量结果的比较

采用4种提取方法对油田上方6个土壤样品微生物总基因组DNA进行提取,并比较了其纯度和浓度。利用定量PCR技术定量分析各土壤中甲烷单加氧酶基因(pmoA)和丁烷单加氧酶基因(6moX)。与DNA试剂盒法相比,玻璃珠击打法、液氮研磨法、反复冻融法得到DNA纯度较低,需纯化才能进行后续的PCR扩增。液氮研磨法得到的DNA完整性、纯度和得率较其他提取方法均较好,尤其对于生物量较少的深层油田土壤DNA提取较为实用,成本较低。甲烷单加氧酶基因(pmoA)和丁烷单加氧酶基因(6moX)的定量PCR结果表明,液氮研磨法提取DNA样品的定量结果在气区和油区均出现一定的高值。液氮研磨法较其他方法更适合于油田土壤DNA的提取。下一步研究可以把丁烷氧化茵作为油气指示茵研究中的重点检测对象。

甲烷单加氧酶的催化性能和活性中心结构

甲烷单加氧酶是甲烷利用细菌代谢甲烷过程中的重要酶系，它能够催化烷烃羟基化和烯烃环氧化反应；还能催化降解氯代烃类，可用于环境中氯代烃类化合物污染的治理，是具有广泛应用前景的生物催化剂．甲烷单加氧酶是含有μ－氧桥双核铁催化活性中心的蛋白，它的研究对分子氧的活化、化学催化剂的设计具有重要意义．文章介绍了甲烷单加氧酶催化性能和机理的最新研究进展．

甲基单胞菌M ethy lomonas sp.GYJ3的生长特性及产甲烷单加氧酶特性

研究了甲基单胞菌 Methylomonas sp.GYJ3发酵培养过程中生长特征和产酶特征 ,结果表明该菌株在生长过程中产酸 ,通过控制发酵过程中 p H可提高细胞的生长密度 ,其生长周期较摇床发酵短 .细胞中甲烷单加氧酶产生于细胞的对数生长期 ,在 70 h以后甲烷单加氧酶活性不再增加 ,最高活性为 3.97nmol环氧丙烷 / min· mg干细胞 .同时研究了细菌生长过程中甲烷的利用 ,结果表明每克甲烷的消耗可产生 0 .69g细胞干重 .考察了 Cu2 +浓度对细胞产生可溶性甲烷单加氧酶和颗粒性甲烷单加氧酶的影响 .并由此建立了 GYJ3菌的连续发酵动力学模型 .

甲烷单加氧酶化学模拟研究进展

本文综述了近年来对甲烷单加氧酶进行结构模拟和催化功能模拟研究工作的进展情况。就结构模拟而言,已合成和表征了很多模型化合物,并与天然酶进行了比较,获得了一些能较好地再现天然酶活性中心结构特征和谱学特征的模型化合物。在催化功能模拟方面,少数体系能将环己烷等烃类转化为醇类或酮类。而真正能把甲烷转化成甲醇的体系仅有一例报道,这方面的工作比较薄弱,尚待加强。

甲基单胞菌Methylomonas sp.GYJ3中甲烷单加氧酶还原酶组分的纯化和性质

Ｍｅｔｙｌｏｍｏｎａｓｓｐ．ＧＹＪ３菌的甲烷单加氧酶（ＭＭＯ）粗酶提取液经ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ阴离子交换层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤层析和ＤＥＡＥ－ＴＳＫｇｅｌＨＰＬＣ分离纯化出ＭＭＯ还原酶组分．经ＨＰＬＣ分析，纯度大于９５％，纯化倍数为４．４，加入至ＭＭＯ羟基化酶和调节蛋白Ｂ的体系中表现比活为２２８ｎｍｏｌ环氧丙烷每分钟毫克蛋白．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳表明还原酶由一种亚基组成，分子量４２ｋＤ．ＩＣＰ－ＡＥＳ测定还原酶的Ｆｅ含量为１．８３ｍｏｌＦｅ每ｍｏｌ蛋白．ＵＶ－Ｖｉｓ光谱表明还原酶除２８０ｎｍ蛋白质特征峰外在４６０ｎｍ有最大吸收峰，且Ａ２８０ｎｍ／Ａ４６０ｎｍ为２．５０，与其它黄素一铁硫蛋白相似，推测还原酶可能含一个ＦＡＤ辅基和Ｆｅ２Ｓ２中心．在厌氧条件下，还原酶能够和ＮＡＤＨ作用，ＵＶ－Ｖｉｓ光谱分析表明还原酶４６０ｎｍ处特征吸收峰消失，说明在ＭＭＯ催化过程中还原酶接受ＮＡＤＨ的电子．ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ阴离子交换层析分离出调节蛋白Ｂ，部分纯化的调节蛋白Ｂ的分子量大约在２０ｋＤ，它能够提高ＭＭＯ比活性４０倍，ＭＭＯ还原酶和调节蛋白Ｂ单独存在时不具有ＭＭＯ?

甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的研究进展

甲烷氧化菌在全球大气甲烷平衡中起着重要的角色,同时甲烷氧化菌中所含特征酶甲烷单加氧酶又具有将由于甲烷氧化菌能氧化一系列的烷烃类、烯烃类以及取代型脂肪族类化合物,因而在生物修复、生物催化和温室气体甲烷的吸收中具有的应用前景和潜力。该文对甲烷氧化菌的分类,甲烷单加氧酶的特性以及在工业应用方面的研究作了简单的概述,分析目前将甲烷氧化菌或甲烷单加氧酶应用于工业化生产存在的问题,并指出今后应加强研究的方面。