MiR-10b-5p通过靶向NCOR2调控乳腺浸润性导管癌细胞的迁移和侵袭

目的探讨miR-10b-5p通过靶向人源重组蛋白(NCOR2)调控乳腺浸润性导管癌细胞的迁移和侵袭。方法利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析了1109例乳腺浸润性导管癌和113例相邻正常组织中miR-10b-5p和NCOR2的mRNA水平,根据miR-10b-5p表达中位数分为高表达组和低表达组,分析两组的总生存率(OS)、无进展生存期(PFI),同时采用实时荧光定量PCR法检测20例患者乳腺癌组织及对应的相邻正常组织miR-10b-5p和NCOR2的mRNA水平。在细胞水平应用乳腺癌细胞系MCF-7构建miR-10b-5p对照组(转染miR-NC),miR-10b-5p过表达组(转染miR-10b-5p mimics),运用qRT-PCR法和Western blot法检测NCOR2 mRNA水平和蛋白水平表达量,采用MTT法检测细胞增殖情况,采用划痕法检测细胞水平迁移情况,采用transwell法检测细胞垂直迁移情况。结果miR-10b-5p在乳腺癌组织中的表达明显低于相邻正常组织(P<0.05),而NCOR2在乳腺癌组织中的表达明显高于相邻正常组织(P<0.05)。与低表达组相比,高表达组miR-10b-5p影响着乳腺浸润性导管癌患者的OS(P>0.05,HR=0.94)、PFI(P<0.05,HR=0.69)。与miR-10b-5p对照组相比,miR-10b-5p过表达组的乳腺癌细胞系MCF-7中NCOR2 mRNA表达水平和蛋白水平均下调(P<0.05),MCF-7细胞过表达组后水平和垂直迁移能力下降。结论过表达的miR-10b-5p可能通过调节NCOR2分子抑制乳腺浸润性导管癌细胞的迁移和侵袭。

miR-10b-5p靶向JARID2及PTEN/Akt/PI3K信号通路调控人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和迁移能力

目的探讨miR-10b-5p靶向Jumonji富含AT结合结构域2(JARID2)及磷脂酶和张力蛋白同源物(PTEN)/蛋白激酶B(Akt)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路调控人乳腺癌M.D.Anderson和MB代表转移性乳腺癌-231(MDA-MB-231)细胞增殖和迁移的影响。方法培养人正常乳腺细胞密歇根癌症基金会-10A(MCF-10A)及人乳腺癌MDA-MB-231细胞,采用Real-time聚合酶链式反应(PCR)法检测两种细胞中miR-10b-5p表达。将MDA-MB-231细胞分为对照组(Lip2000处理后正常培养细胞)、上调拟似物组(Lip2000+miR-10b-5p拟似物mimic转染)、上调转染组(Lip2000+mimic-miR-10b-5p共转染)、下调拟似物组(Lip2000+miR-10b-5p拟似物inhibitor转染)、下调转染组(Lip2000+inhibitor-miR-10b-5p共转染)。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测各组细胞增殖情况,Transwell检测各组细胞迁移能力,Western blot法检测各组中JARID2及PTEN/Akt/PI3K信号通路蛋白表达。结果MDA-MB-231细胞中miR-10b-5p表达量高于MCF-10A细胞(P<0.05)。上调转染组增殖抑制率低于对照组,下调转染组增殖抑制率高于对照组(P<0.05);上调拟似物组和下调拟似物组增殖抑制率与对照组比较差异无统计学意义。上调转染组细胞数量少于对照组,下调转染组细胞数量多于对照组(P<0.05);上调拟似物组和下调拟似物组与对照组细胞数量比较差异无统计学意义。上调转染组JARID2、PTEN蛋白表达量均高于对照组,PI3K、Akt蛋白表达均低于对照组(P<0.05);下调转染组JARID2、PTEN蛋白表达量均低于对照组,PI3K、Akt蛋白表达均高于对照组(P<0.05)。结论miR-10b-5p可靶向JARID2及PTEN/Akt/PI3K信号通路表达,影响人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和迁移能力。

miR-10b-5p通过靶向SUFU介导乳腺癌细胞对放疗的敏感性

目的探讨miR-10b-5p在乳腺癌细胞放疗敏感性中的作用及相关机制。方法采用qPCR和West‐ern blotting检测正常乳腺细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231中miR-10b-5p mRNA、SUFU mRNA和蛋白的表达。在MDA-MB-231细胞中转染miR-10b-5p inhibitor对miR-10b-5p进行敲减,6 Gy^(60)Coγ-射线照射2 h,分别采用克隆形成实验和流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡水平;双荧光素酶报告实验验证靶基因SUFU,回补实验验证miR-10b-5p是否通过靶向SUFU介导乳腺癌细胞对放疗的敏感性。结果3种乳腺癌细胞系中miR-10b-5p的表达均显著高于正常乳腺细胞MCF-10A(P<0.05)。与miR-NC组相比,miR-10b-5p inhibitor组细胞增殖水平明显下降(P<0.05),凋亡水平显著上升(P<0.05)。敲减miR-10b-5p可增加野生型SUFU 3'UTR的荧光强度(P<0.05),而对突变型SUFU 3'UTR的荧光强度无明显影响(P>0.05)。此外,miR-10b-5p inhibitor组SUFU蛋白表达水平显著高于miR-NC组(P<0.05)。与miR-NC+si-NC组相比,miR-10b-5p inhibitor+si-NC组细胞增殖水平显著降低(P<0.05),miR-10b-5p inhibitor+si-SUFU#2组细胞增殖水平明显回升,且高于miR-10b-5p inhibitor+si-NC组(P<0.05)。结论乳腺癌细胞中miR-10b-5p呈高表达,敲减miR-10b-5p可增强乳腺癌细胞对放疗的敏感性,其机制可能与靶向抑制SUFU相关。

鸡miR-10b-5p生物信息学及组织表达分析

【目的】通过对苏禽3号肉鸡的miR-10b-5p进行靶基因预测、生物信息学分析及其在鸡不同生长时期组织表达变化规律研究,探索其在鸡肌肉生长发育中作用。【方法】通过文献和miRBase检索脊椎动物的miR-10b-5p序列,利用Ensembl数据库查询并确定miR-10b-5p在基因组中的位置,根据前体序列构建系统进化树;使用miRDB、microT和TargetScan网站预测miR-10b-5p靶基因,并对靶基因进行GO功能和KEGG通路分析,进而揭示miR-10b-5p的基因功能。采用实时荧光定量PCR技术检测不同生长时期鸡miR-10b-5p组织表达量,探索其在大脑、小脑、垂体、下丘脑、胸肌、腿肌、卵巢、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中表达变化。【结果】miRBase检索共获得59种动物59条miR-10b-5p序列,即每一种动物都只有一种miR-10b-5p形式。基因定位分析发现,鸡miR-10b-5p位于2号染色体上的HOX基因家族中。常见物种miR-10b-5p成熟序列比对分析结果表明,miR-10b-5p的成熟序列相似性较高,物种间较为保守。系统进化树分析发现,miR-10b在哺乳类中的灵长目、啮齿目、鸟类、鱼类中各自先聚为一支,然后再共同聚为一类,这表明miR-10b在进化过程中是保守的。靶基因预测发现,miR-10b-5p共有300个靶基因。GO功能分析发现,靶基因主要富集到染色质组装和基因表达的转录后调控、组蛋白甲基转移酶复合物、转录因子复合物等功能。KEGG通路分析表明,靶基因主要富集到Wnt和p53信号通路上。组织表达分析显示,miR-10b-5p在检测的各个组织中均有表达;3日龄时大脑、小脑、垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量显著高于心脏、下丘脑、肾脏和肺脏等组织(P<0.05);90日龄时,垂体、胸肌、腿肌和大脑中miR-10b-5p表达量显著高于其他组织(P<0.05)。与3日龄雏鸡相比,90日龄时垂体、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表达量均显著上升(P<0.05)。【结论】鸡miR-10b-5p是组织广泛表达的miRNA,miR-10b在进化过程中是保守的,其可能通过Wnt及p53信号通路调控肌肉细胞增殖分化,进而调控鸡肌肉生长发育。

黄芪多糖通过miR-10b-5p/AGPAT3分子轴调控结直肠癌细胞顺铂耐药性

目的探讨黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)通过miR-10b-5p/(1-acylglycerol-3-phosphate-O-acyltransferase 3;AGPAT3)分子轴调控结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞顺铂(cisdiammine dichloroplatinum;CDDP)耐药性的分子机制。方法采用RT-qPCR检测SW620及SW620/CDDP细胞miR-10b-5p表达水平;使用MTT法或Transwell法检测不同浓度的APS或不同浓度的顺铂处理SW620及SW620/CDDP细胞后的细胞活力;通过双荧光素酶报告基因系统检测miR-10b-5p与AGPAT3的靶向结合关系;使用Western blotting检测AGPAT3、E-cadherin、Vimentin、Ki-67及zinc finger E-box binding homeobox 1(Zeb1)的表达情况。结果miR-10b-5p在SW620/CDDP细胞中表达水平显著上调(P<0.01);经不同浓度的APS处理后,SW620/CDDP细胞增殖(P<0.05)及迁移(P<0.05)水平受到显著抑制,APS与顺铂联合使用,显著增加了SW620/CDDP细胞对顺铂的敏感性(P<0.05);双荧光素酶报告基因验证AGPAT3是miR-10b-5p的靶基因;Western blotting检测结果显示,过表达miR-10b-5p或敲降AGPAT3可显著抑制E-cadherin的表达(P<0.01),并上调Vimentin、Ki-67及Zeb1的表达水平(P<0.01)。结论APS通过miR-10b-5p/AGPAT3分子轴调控CRC细胞顺铂耐药性,APS可作为CRC的化疗辅助药物,调节细胞对化疗药物的敏感性。

miR-10b-5p作用于胰腺癌潜在靶基因及分子机制的探讨

目的探讨miR-10b-5p在胰腺癌发生发展中潜在的靶基因和分子机制。方法通过高通量基因表达(gene expression omnibus,GEO)数据库和在线预测数据库对潜在靶基因进行初步探讨,再利用生物信息学计算,对miR-10b-5p与靶基因间的相互作用关系进行分析。结果本研究共得到586个miR-10b-5p潜在靶基因。基因富集分析(gene ontology,GO)表明,靶基因主要在蛋白转运途径中富集。京都基因与基因组百科全书通路分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)显示miR-10b-5p靶基因主要存在于两个重要途径:癌症相关通路和胰腺癌相关通路。蛋白-蛋白网络互作分析(protein-protein interaction,PPI)重点展示了胰腺癌相关通路上7个突变基因(EGFR、RAC3、SMAD4、PIK3CA、CDK6、Bcl2L1和STAT3)之间的相互作用关系。结论 miR-10b-5p可能通过靶向潜在的基因和途径在胰腺癌的发生发展中发挥作用。

Lnc-MEG3调控miR-10b-5p/CD82轴对垂体瘤细胞增殖、侵袭的影响

目的探究lnc-MEG3对垂体瘤细胞增殖、侵袭的调控机制。方法取垂体瘤HP75细胞分为对照组、si-NC组、si-MEG3组、pcDNA3.1-NC组、oe-MEG3组、oe-MEG3+mimic-NC组、oe-MEG3+miR-10b-5p mimic组。转染后,检测细胞中lnc-MEG3、miR-10b-5p和CD82 mRNA的表达水平、细胞增殖、迁移、侵袭能力和细胞中CD82、PCNA、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表达。结果Lnc-MEG3过表达可降低miR-10b-5p,上调CD82和E-cadherin水平,降低PCNA、N-cadherin、MMP-9水平,抑制垂体瘤细胞增殖、迁移和侵袭(P<0.05);上调miR-10b-5p可抑制CD82,减弱lnc-MEG3过表达对垂体瘤细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染miR-10b-5p mimic后,细胞中MEG3-WT和CD82-WT的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。结论Lnc-MEG3过表达可能通过靶向下调miR-10b-5p,进而上调CD82的表达,抑制垂体瘤细胞增殖、迁移和侵袭。

食管鳞状细胞癌外泌体miR-181b-5p通过靶向抑制PTEN促进肿瘤相关巨噬细胞极化

目的:探究食管鳞状细胞癌外泌体miR-181b-5p对M2型巨噬细胞极化的影响及机制。方法:提取并鉴定食管鳞状细胞癌外泌体,qRT-PCR检测miR-181b-5p在食管鳞状癌细胞及其外泌体中的表达。M0型巨噬细胞分为PBS组、HEEC exo组、Eca-109 exo组、miR-NC exo组、miR-181b-5p exo组、miR-NC组、miR-181b-5p mimic组、si-NC组、si-PTEN组、miR-181b-5p exo+PTEN组,qRT-PCR检测各组细胞中CD163、CD206、iNOS、TNF-α表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-181b-5p和PTEN的靶向关系。结果:miR-181b-5p在食管鳞状癌细胞TE-13、TE-12、TE-10、Eca-109、KYSE30及其外泌体中显著高表达(P<0.001)。相比于miR-NC组,miR-181b-5p mimic组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。双荧光素酶报告基因结果显示PTEN为miR-181b-5p的靶基因。相比于si-NC组,si-PTEN组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于PBS组,Eca-109 exo组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于miR-NC exo组,miR-181b-5p exo组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于miR-181b-5p exo组,miR-181b-5p exo+PTEN组CD163和CD206表达显著下调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著上调(P<0.001)。结论:外泌体miR-181b-5p抑制PTEN表达而促进M2型巨噬细胞极化。

滋金补水膏对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的治疗作用及对lncRNAPVT1、miR-30b-5p表达的影响

【目的】探讨滋金补水膏对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠的治疗作用及机制。【方法】将96只大鼠随机分为正常组,模型组,滋金补水膏低、中、高剂量组,盐酸氨溴索组、滋金补水膏高剂量+pcDNA组,滋金补水膏高剂量+pcDNA-人浆细胞瘤转化迁移基因1(PVT1)组,每组12只。除正常组外,其他各组大鼠采用气道滴注脂多糖(LPS)联合烟雾暴露法构建COPD模型。建模成功后,进行给药干预。给药结束后,采用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测大鼠血清中白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;流式细胞术检测大鼠外周血中辅助性T细胞17/调节性T细胞(Th17/Treg)水平,苏木素-伊红(HE)染色法观察肺组织病理变化,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测血清和肺组织中长链非编码RNA(lncRNA)PVT1、miR-30b-5p表达,Western Blot法检测肺组织中维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)、叉头框蛋白P3(Foxp3)蛋白表达,双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA PVT1与miR-30b-5p的关系。【结果】与正常组比较,模型组肺泡间隔变大,支气管周围有大量炎症细胞浸润,Treg细胞比例、miR-30b-5p表达水平、Foxp3蛋白表达水平降低,IL-6、TNF-α水平,Th17细胞比例、Th17/Treg比值,lncRNA PVT1表达水平,RORγt蛋白表达水平升高(均P<0.05);与模型组比较,滋金补水膏低、中、高剂量组及盐酸氨溴索组大鼠肺组织病理损伤减轻、Treg细胞比例、miR-30b-5p表达水平、Foxp3蛋白表达水平升高,IL-6、TNF-α水平,Th17细胞比例,Th17/Treg比值,lncRNA PVT1表达水平,RORγt蛋白表达水平降低(均P<0.05)。lncRNA PVT1靶向调控miR-30b-5p表达。【结论】滋金补水膏可能通过调节lncRNA PVT1/miR-30b-5p轴促进Th17/Treg细胞平衡来抑制COPD大鼠炎症反应。

LncRNA NORAD通过miR-513b-5p/GREM1轴调节颅内动脉瘤血管平滑肌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用机制

目的:探讨长链非编码RNA DNA损伤诱导的非编码RNA(LncRNA NORAD)通过miR-513b-5p/GREM1轴调节颅内动脉瘤血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移、侵袭和凋亡的机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测人颅内动脉瘤组织和正常组织中LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1表达。体外分离培养人VSMC,随机分为对照组、LncRNA NORAD siRNA组、miR-513b-5p mimics组、共转染(LncRNA NORAD siRNA+miR-513b-5p inhibitor)组、共转染阴性对照(LncRNA NORAD siRNA阴性对照+miR-513b-5p inhibitor阴性对照)组,分组转染后,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1 mRNA表达;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和免疫荧光染色检测各组细胞增殖情况;采用Hoechst 33342染色和免疫荧光染色检测各组细胞凋亡情况;采用细胞划痕实验和Transwell实验检测各组细胞迁移、侵袭情况;采用免疫印记实验检测各组细胞上皮间充质转化(EMT)标志蛋白神经钙黏素(N-cadherin)、E-钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达;采用双荧光素酶报告实验分析VSMC中LncRNA NORAD对miR-513b-5p、miR-513b-5p对GREM1的靶向调控。结果:与正常组织比较,颅内动脉瘤组织LncRNA NORAD、GREM1 mRNA表达明显升高(P<0.05),miR-513b-5p表达明显降低(P<0.05)。与对照组比较,LncRNA NORAD siRNA组、miR-513b-5p mimics组细胞GREM1 mRNA表达、增殖率、Ki67阳性率、迁移率、侵袭数及N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低(P<0.05),miR-513b-5p表达、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05);共转染阴性对照组各指标差异无统计学意义(P>0.05)。与LncRNA NORAD siRNA组比较,共转染组细胞GREM1 mRNA表达、增殖率、Ki67阳性率、迁移率、侵袭数及N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高(P<0.05),miR-513b-5p表达、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。结论:敲低LncRNA NORAD可通过上调miR-513b-5p表达而降低GREM1表达,从而抑制VSMC增殖与侵袭迁移,并促使其凋亡。

miR-135b-5p在乳腺癌组织中的表达及意义

目的探讨miR-135b-5p在乳腺癌组织中的表达及其与临床病理特征、预后的关系。方法选取2018年1月至2021年12月于中国人民解放军联勤保障部队第九一〇医院行改良根治术的68例乳腺癌患者作为研究对象,收集乳腺癌组织及癌旁正常组织石蜡标本。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测miR-135b-5p的表达水平,以乳腺癌组织miR-135b-5p表达量的平均值作为参考,将患者分为低表达组与高表达组,分析miR-135b-5p表达水平与患者临床病理特征的关系;使用Kaplan-MeierPlotter分析miR-135b-5p表达对不同分子亚型乳腺癌患者预后的影响。结果乳腺癌组织miR-135b-5p的表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。高表达组肿瘤直径>2cm、淋巴结转移阳性、分型为三阴性、ER表达阴性、PR表达阴性的患者占比高于低表达组,差异有统计学意义(P<0.05);两组年龄、发病部位、组织学分级、HER2表达情况比较差异无统计学意义。Kaplan-MeierPlotter在线生存分析结果显示,在ER阳性的管腔型乳腺癌患者中,miR-135b-5p低表达组总生存率低于高表达组,在三阴性乳腺癌患者中,miR-135b-5p高表达组总生存率低于低表达组,差异有统计学意义(P<0.05);在HER2过表达型乳腺癌患者中,低表达组和高表达组总生存率比较差异无统计学意义。结论miR-135b-5p在乳腺癌组织中的表达水平在三阴性和管腔型乳腺癌中存在显著差异,可通过发挥不同的作用参与肿瘤的进展过程,在乳腺癌的预后判断和靶向治疗方面可能具有潜在的应用价值。

miR-26b-5p靶向VEGF抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

目的探讨miR-26b-5p对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法培养人正常肺上皮细胞BEAS-2B和非小细胞肺癌细胞A549,通过qPCR检测BEAS-2B和A549细胞中miR-26b-5p和VEGF mRNA的表达水平。通过Western Blot检测BEAS-2B和A549细胞中E-cadherin、Vimentin和VEGF蛋白的表达水平。生物信息学预测VEGF与miR-26b-5p的靶向关系。使用脂质体法将NC-mimic和miR-26b-5p-mimic转染A549细胞,通过CCK8法、EDU实验检测miR-26b-5p对细胞生长的影响;通过划痕实验和Transwell侵袭实验检测miR-26b-5p对细胞迁移和侵袭的影响;通过Western Blot检测对E-cadherin、Vimentin和VEGF蛋白表达的影响。结果与BEAS-2B细胞相比,在A549细胞中,miR-26b-5p表达水平显著下降(P<0.05),VEGF的mRNA和蛋白表达水平显著上升(P<0.05),E-cadherin蛋白的表达水平显著下降(P<0.05),而Vimentin的蛋白表达水平显著上升(P<0.05)。与NC-mimic组相比,miR-26b-5p-mimic组在24h、48h以及72h时细胞吸光值显著减少(P<0.05),24h划痕距离显著增加(P<0.05),24h侵袭细胞数显著减少(P<0.05),E-cadherin蛋白表达显著上调(P<0.05)、Vimentin和VEGF蛋白表达显著下调(均P<0.05)。结论过表达miR-26b-5p可以通过靶向抑制VEGF的表达,从而抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭。

miR-146b-5p调控CD82介导食管鳞状细胞癌恶性表型

目的探究miR-146b-5p促进食管鳞状细胞癌恶性表型的分子机制。方法选取2020年10月-2021年12月在四川省西南医科大学附属医院行食管癌根治术治疗的38名食管鳞状细胞癌患者的癌组织和癌旁正常组织(NAT)样本,核酸原位杂交法检测miR-146b-5p在食管鳞癌及癌旁正常组织中的表达水平;通过siRNA敲低miR-146b-5p的表达水平,细胞增殖实验、划痕实验检测敲低miR-146b-5p后细胞行为学表型变化;生物信息学分析预测miR-146b-5p的下游靶基因为CD82;免疫印迹法(Western-blot)检测靶基因CD82的表达水平,双荧光素酶报告基因实验确定miR-146b-5p与CD82之间的调控关系。结果核酸原位杂交法检测结果显示,与NAT组织病理评分比较,miR-146b-5p在ESCC组织中的病理评分较高(P<0.05);EdU细胞增殖实验结果显示,与NC组比较,KD组EdU阳性细胞比例显著降低(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,与NC组比较,KD组划痕愈合比例显著下降(P<0.05)。ENCORI数据库预测CD82是miR-146b-5p的下游靶基因;Western-blot实验结果显示,相比NC组,KD组CD82在蛋白水平显著性上调;双荧光素酶报告基因实验结果显示,wt+mimic组荧光强度较mut+mimic组显著性下降(P<0.05)。结论miR-146b-5p通过靶向调控CD82促进食管鳞状细胞癌细胞的迁移,为食管鳞状细胞癌的治疗提供新的靶点。

血清外泌体miR-20b-5p miR-107水平检测在非小细胞肺腺癌诊断及预后评估中的应用

目的探究血清外泌体miR-20b-5p、miR-107水平检测在非小细胞肺腺癌诊断及预后评估中的应用价值。方法选取2015年12月至2018年12月河南科技大学第一附属医院胸外科收治的124例非小细胞肺腺癌患者为观察组,另选取120例同期于本院接受体检的健康体检者为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链法(qRT-PCR)检测血清外泌体miR-20b-5p、miR-107表达水平,受试者工作特征曲线(ROC)评估miR-20b-5p、miR-107水平检测对非小细胞肺腺癌的早期诊断价值,Kaplan-Meier生存分析研究miR-20b-5p、miR-107水平与患者预后的关系。结果观察组的血清外泌体miR-20b-5p、miR-107水平高于对照组(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清外泌体miR-20b-5p、miR-107检测诊断非小细胞肺腺癌的AUC值分别为0.766、0.821,最佳截断值分别为1.81、1.27。观察组患者中,117例完成随访,7例失访。随访3年后,64例患者死亡,53例患者存活。根据患者的生存状态绘制ROC曲线,确定miR-20b-5p、miR-107预测患者预后的最佳截断值分别为1.95、1.60;miR-20b-5p高表达与低表达、miR-107高表达与低表达患者的TNM分期和淋巴结转移比较,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-20b-5p、miR-107高表达患者的中位生存时间均低于低表达患者(P<0.05)。结论外泌体miR-20b-5p、miR-107在非小细胞肺腺癌患者血清中呈高表达状态,其表达水平与患者的预后相关,在疾病诊断与预测患者累计生存率方面具有一定的参考意义。

CREM基因在miR-199b-5p敲除小鼠精液和睾丸中的表达研究

目的:探讨miR-199b-5p基因敲除对雄性小鼠精液和睾丸中CREM表达水平的影响。方法:选miR-199b-5p基因敲除(KO)雄性小鼠和野生型(WT)雄性C57BL/6小鼠。观察2组小鼠体重和睾丸指数。HE染色观察睾丸结构变化。显微镜下观察精子形态及计数精子浓度。数据库预测CREM与miR-199b-5p的靶向关系。RT-qPCR和Western印迹法分别检测2组小鼠睾丸中CREM mRNA和蛋白表达水平变化。结果:两组之间小鼠体重和睾丸指数无明显变化;与WT组比较,KO组小鼠精液精子计数稍下降,但无统计学差异(P>0.05);精液涂片示KO组精子浓度较WT组稀疏,但无统计学差异(P>0.05);睾丸病理示:与WT组比较,KO组睾丸体积较小,睾丸组织正常,生精小管可见各级生精细胞和支持细胞,生精小管界膜、管径无明显异常;数据库预测CREM基因是miR-199b-5p的靶基因;RT-qPCR结果示:与WT组比较,KO组雄鼠精液和睾丸组织中CREM mRNA表达水平均明显下降(P<0.05),差异有统计学意义。Western印迹结果显示:与WT组比较,KO组雄鼠睾丸组织中CREM蛋白表达水平明显下降(P<0.05),差异有统计学意义。随访半年,统计两组雄性小鼠出生数,发现KO组雄鼠的出生数较WT组明显下降(P<0.05)。结论:miR-199b-5p敲除小鼠精液和睾丸中CREM基因表达下调,推测miR-199b-5p可能靶向作用于CREM基因进而影响雄性小鼠的生育功能。

CYP2C19基因多态性、miR-374b-5p与ACI患者神经功能缺损和近期预后的关系

目的探讨细胞色素P4502C19(CYP2C19)基因多态性、血清miR-374b-5p水平与急性脑梗死(ACI)患者神经功能缺损和近期预后的关系。方法选取2019年1月—2022年12月郑州市第七人民医院ACI患者164例,收集所有患者的一般资料,并检测CYP2C19基因型和血清miR-374b-5p相对表达量。采用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评估ACI患者神经功能缺损程度。根据治疗15 d后的NIHSS评分将ACI患者分为预后良好组和预后不良组。采用Spearman相关分析评估miR-374b-5p与入院时NIHSS评分的相关性。采用多因素Logistic回归分析评估ACI患者近期预后不良的危险因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估CYP2C19基因型和血清miR-374b-5p判断ACI患者近期预后的效能。结果164例ACI患者CYP2C19基因型中,GG型(野生纯合子)26例(15.86%)、GA型(突变杂合子)66例(40.24%)、AA型(突变纯合子)72例(43.90%)。A等位基因频率为64.02%,G等位基因频率为35.98%。基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ^(2)=2.620,P=0.106)。GG基因型、GA基因型、AA基因型的ACI患者入院时NIHSS评分依次升高(P<0.001)。血清miR-374b-5p相对表达量与入院时NIHSS评分呈负相关(r_(s)=-0.510,P<0.001)。ACI患者预后不良发生率为19.51%(32/164)。预后不良组与预后良好组之间年龄、梗死体积、发病至就诊时间、白细胞(WBC)计数、CYP2C19基因型为AA型所占比例和血清miR-374b-5p相对表达量差异均有统计学意义(P<0.05)。梗死体积、发病至就诊时间、WBC计数、CYP2C19基因型为AA型均是ACI患者预后不良的危险因素(P<0.05),miR-374b-5p相对表达量为保护因素(P=0.007)。AA基因型和血清miR-374b-5p单项检测和联合检测判断ACI患者预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.631、0.730、0.802。结论CYP2C19基因多态性、血清mi R-374b-5p相对表达量均与ACI患者神经功能缺损有关,或可作为ACI患者近期预后的评估指标。

H12、RS13和RL6在miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的表达研究

目的探讨组蛋白H1变体(H12)、核糖体蛋白S13(RS13)和核糖体蛋白L6(RL6)在miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的表达变化。方法(1)自行繁育miR-199b-5p敲除(Knockout,KO)和野生型(Wild-type,WT)C57BL/6小鼠,分别记录两组雌鼠产仔情况(2)基因型鉴定验证分组,取性成熟期小鼠(鼠周龄为11~13周)卵巢用于验证实验。(3)用实时荧光定量PCR(qPCR)检测每组小鼠(n=10)卵巢组织中H12、RS13和RL6的mRNA表达水平变化。(4)用蛋白免疫印迹法(WB)检测每组小鼠(n=3)卵巢组织中H12、RS13和RL6的蛋白表达水平变化。结果(1)共统计半年内两组雌鼠产仔情况:WT组生产27窝,平均每窝产仔数为(8.15±0.41)只;KO组生产28窝,平均每窝产仔数为6.43±0.32只,与WT组比较,KO组雌鼠产仔数显著下降(P=0.004),差异有统计学意义。(2)qPCR结果示:与WT组比较,KO组卵巢组织中H12(P=0.038)、RS13(P=0.011)和RL6(P=0.009)的mRNA表达水平显著升高,差异均有统计学意义。(3)WB结果示:与WT组比较,KO组小鼠卵巢组织中H12(P=0.014)蛋白表达水平显著升高,而RS13(P=0.005)和RL6(P=0.009)蛋白表达水平显著下降,差异均有统计学意义。结论敲除miR-199b-5p可能影响H12、RL6和RS13基因的表达使小鼠卵巢储备能力下降。

lncRNA LUCAT1通过miR-199b-5p/AKAP1信号轴促进肝癌进展的机制

目的探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)肺癌相关转录物1(lung cancer associated transcript 1,LUCAT1)通过miR-199b-5p/A激酶锚定蛋白1(A-kinase anchoring protein 1,AKAP1)信号轴促进肝癌转移的机制。方法收集2020年1月至2021年10月在成都市新都区人民医院进行手术治疗的80例肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者的肝癌及癌旁组织标本,采用RT-qPCR检测LUCAT1、miR-199b-5p、AKAP1 mRNA水平。将Huh7、HepG2细胞进行不同转染,pHRi-si-NC、pHRi-si-LUCAT1分别转染至Huh7、HepG2细胞,pHRi-si-LUCAT1和pHRi-anti-miR-NC、pHRi-si-LUCAT1和pHRi-anti-miR-199b-5p、pHRi-si-LUCAT1和pHRi-NC、pHRi-si-LUCAT1和pHRi-AKAP1分别共转染至Huh7、HepG2细胞。双荧光素酶报告验证LUCAT1对miR-199b-5p、miR-199b-5p对AKAP1的调控关系;EdU染色、划痕实验和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;RT-qPCR检测细胞LUCAT1、miR-199b-5p和AKAP1 mRNA水平;Western blot检测细胞Ki67、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9水平。向20只裸鼠皮下注射已转染pHRi-si-LUCAT1的Huh7细胞悬液,30 d后测定移植瘤体积、质量、LUCAT1、miR-199b-5p、AKAP1 mRNA、Ki67、MMP-2、MMP-9水平。结果①与癌旁组织相比,HCC组织LUCAT1(1.51±0.53比1.13±0.72;t=3.802,P<0.001)、AKAP1 mRNA(3.73±0.97比1.28±0.76;t=17.783,P<0.001)水平显著升高,miR-199b-5p(1.21±0.53比3.56±1.02;t=18.286,P<0.001)水平显著降低。②转染pHRi-si-LUCAT1后,miR-199b-5p水平显著升高(Huh7:3.71±0.28比1.00±0.10,t=15.787,P=0.004;HepG2:3.49±0.25比1.00±0.11,t=15.790,P=0.004),LUCAT1(Huh7:0.34±0.05比1.00±0.06,t=14.637,P=0.005;HepG2:0.41±0.06比1.00±0.07,t=11.084,P=0.008)和AKAP1 mRNA水平显著降低(Huh7:0.52±0.05比1.00±0.09,t=8.075,P=0.015;HepG2:0.55±0.06比1.00±0.13,t=5.444,P=0.032);细胞EdU阳性率、划痕愈合率和细胞侵袭数均显著降低(P均<0.05);Ki67(Huh7:0.24±0.03比0.92±0.06,t=17.558,P=0.003;HepG2:0.10±0.03比0.51±0.03,t=16.738,P=0.004)、MMP-2(Huh7:0.20±0.03比0.90±0.05,t=20.793,P=0.002;HepG2:0.05±0.02比0.21±0.02,t=9.798,P=0.010)、MMP-9(Huh7:0.25±0.04比0.75±0.05,t=13.525,P=0.005;HepG2:0.15±0.03比0.59±0.04,t=15.242,P=0.004)表达水平显著降低;共转染pHRi-si-LUCAT1和pHRi-anti-miR-199b-5p后,miR-199b-5p水平显著降低(Huh7:1.42±0.11比3.65±0.25,t=14.142,P=0.005;HepG2:1.30±0.05比3.71±0.20,t=20.248,P=0.002),LUCAT1(Huh7:0.85±0.10比0.40±0.06,t=6.683,P=0.022;HepG2:0.90±0.08比0.45±0.04,t=8.714,P=0.013)和AKAP1 mRNA水平显著升高(Huh7:0.80±0.07比0.55±0.04,t=5.371,P=0.033;HepG2:0.85±0.08比0.51±0.04,t=6.584,P=0.022);细胞EdU阳性率、划痕愈合率和细胞侵袭数均显著升高(P均<0.05);Ki67(Huh7:0.91±0.06比0.25±0.04,t=15.853,P=0.004;HepG2:0.92±0.07比0.18±0.03,t=16.830,P=0.004)、MMP-2(Huh7:0.62±0.05比0.22±0.03,t=11.882,P=0.007;HepG2:0.75±0.05比0.39±0.05,t=8.818,P=0.013)、MMP-9(Huh7:0.51±0.05比0.18±0.02,t=10.614,P=0.009;HepG2:0.89±0.06比0.34±0.04,t=13.211,P=0.006)表达水平显著升高;共转染pHRi-si-LUCAT1和pHRi-AKAP1后,miR-199b-5p水平显著降低(Huh7:1.82±0.12比3.55±0.30,t=9.274,P=0.011;HepG2:1.70±0.14比3.62±0.25,t=11.606,P=0.007),LUCAT1(Huh7:0.71±0.03比0.30±0.03,t=16.738,P=0.004;HepG2:0.75±0.05比0.35±0.04,t=10.820,P=0.008)和AKAP1 mRNA水平显著升高(Huh7:0.87±0.05比0.51±0.03,t=10.694,P=0.009;HepG2:0.90±0.09比0.54±0.04,t=6.331,P=0.024);细胞EdU阳性率、划痕愈合率和细胞侵袭数均显著升高(P均<0.05);Ki67(Huh7:0.64±0.06比0.30±0.03,t=8.779,P=0.013;HepG2:0.75±0.06比0.25±0.03,t=12.910,P=0.006)、MMP-2(Huh7:0.80±0.05比0.34±0.04,t=12.443,P=0.002;HepG2:0.84±0.08比0.40±0.03,t=8.920,P=0.012)、MMP-9(Huh7:0.76±0.05比0.23±0.04,t=14.337,P=0.005;HepG2:0.76±0.05比0.31±0.04,t=12.173,P=0.007)表达水平显著升高;③转染pHRi-si-LUCAT1后,肿瘤体积[(523.67±64.33)mm^(3)比(1542.21±201.51)mm^(3),t=8.340,P=0.014)]和质量[(0.67±0.15)g比(1.87±0.22)g,t=7.806,P=0.016)]均显著减小,LUCAT1(0.47±0.10比1.00±0.14,t=5.336,P=0.033)、AKAP1(0.12±0.03比0.51±0.05,t=11.585,P=0.007)、Ki67(2.45±0.28比5.93±0.55,t=9.766,P=0.010)、MMP-2(2.35±0.25比5.74±0.51,t=10.338,P=0.009)、MMP-9(3.55±0.34比6.42±0.84,t=5.486,P=0.032)蛋白水平均显著降低,miR-199b-5p(1.68±0.17比1.00±0.16,t=5.045,P=0.037)水平显著升高。结论LncRNA LUCAT1通过miR-199b-5p/AKAP1信号轴促进HCC细胞增殖、迁移和侵袭。

基于生物信息学分析肝硬化与miR-125a-5p和miR-125b-5p的相关研究

目的:基于生物信息学分析肝硬化与miR-125a-5p和miR-125b-5p的功能富集通路以及关键基因,以期为肝硬化诊断与治疗提供新思路。方法:通过miRDB、miRWalk和TargetScan数据库获得miR-125a-5p和miR-125b-5p的靶基因,从GEO数据库获得肝硬化相关数据集GSE14323和GSE25097,筛选正常组织样本和肝硬化组织样本差异表达基因,将GSE25097和GSE14323所得差异表达基因取交集,获得肝硬化数据集的共表达基因,将miR-125a-5p和miR-125b-5p的靶基因与肝硬化数据集GSE14323和GSE25097的共表达基因取交集得到核心基因,对核心基因进行GO和KEGG富集以及构建PPI网络互作图。结果:GO富集分析中主要在糖氧代谢过程和线粒体外膜的活性中富集,KEGG富集分析中主要在脂肪酸生物合成和类固醇生物代谢等中富集,通过构建PPI网络互作图,得到miR-125a-5p和miR-125b-5p与肝硬化相关的4个关键基因NPL、H6PD、KIAA0319L和RFX5。结论:得到的相关通路以及4个关键基因NPL、H6PD、KIAA0319L和RFX5以期为肝硬化发病机制以及肝硬化发生发展过程中相关分子靶点和早期筛查的手段提供新思路,从而指导疾病诊疗计划和管理。

miR-374b-5p靶向调控PTEN抑制七氟醚诱导的小鼠海马神经元HT22细胞凋亡

目的 探究miR-374b-5p对七氟醚(sevoflurane,Sev)引起的小鼠海马神经元HT22细胞损伤的保护作用。方法 将HT22细胞并分为6组:对照组、Sev组、miR-con+Sev组、miR-374b-5p+Sev组、miR-374b-5p+pcDNA+Sev组、miR-374b-5p+pcDNA-PTEN+Sev组。RT-qPCR检测各组miR-374b-5p和PTEN mRNA的表达水平,蛋白质免疫印迹(Western blot)检测各组PTEN、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3的表达水平,双荧光素酶活性实验验证miR-374b-5p对PTEN的靶向作用,CCK8检测HT22细胞活性;流式细胞术检测HT22细胞凋亡;DCFH-DA探针检测HT22细胞ROS水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HT22细胞中丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量。结果 与对照组比较,在Sev处理组miR-374b-5p的表达水平下降,PTEN mRNA和PTEN蛋白表达水平增加,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-374b-5p通过与HT22细胞中PTEN mRNA的3’UTR结合而抑制PTEN的表达。与对照组比较,Sev组HT22细胞中PTEN mRNA、PTEN、ROS、MDA含量、Cleaved caspase-3、Bax表达量和细胞凋亡率升高,而miR-374b-5p、GSH含量、Bcl-2表达量和细胞存活率降低,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-con+Sev组比较,miR-374b-5p+Sev组的HT22细胞中PTEN mRNA、PTEN、ROS、MDA含量Cleaved caspase-3、Bax表达量和细胞凋亡率降低,而miR-374b-5p、GSH含量、Bcl-2表达量和细胞存活率升高,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-374b-5p+pcDNA+Sev组比较,miR-374b-5p+pcDNA-PTEN+Sev组的HT22细胞中PTEN mRNA、PTEN、ROS、MDA含量、Cleaved caspase-3、Bax表达量和细胞凋亡率升高,而GSH含量、Bcl-2表达量和细胞存活率含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 预处理miR-374b-5p可能通过抑制PTEN抑制Sev处理HT22细胞凋亡,从而发挥对神经细胞的保护作用。