Circular RNA LPAR3通过miR-143-5p/USP14通路调控食管癌细胞糖酵解的研究

目的探究调控食管癌细胞糖酵解的机制。方法逆转录实时定量PCR(quantitative real-time,qRT-PCR)法分别检测环状RNA溶血磷脂酸受体(circular RNA lysophosphatidic acid receptor 3,CircLPAR3),微小RNA-143-5(microRNA-143-5p,miR-143-5p)和泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14,USP14)的表达水平;使用Seahorse XF 24细胞外通量分析仪测量细胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR)和耗氧率(oxygen comsumpition rate,OCR);Western印迹法检测糖酵解途径关键酶HK2的表达水平;使用Starbase数据库预测CircLPAR3与miR-143-5p以及miR-143-5p与USP14的靶向结合位点,双荧光素酶试验验证CircLPAR3和miR-143-5p以及miR-143-5p与USP14的靶向关系。结果与正常人食管上皮细胞(normal human esophageal epithelial cells,Het-1A)组比较,食管癌细胞系中CircLPAR3高表达,且KYSE450细胞系的表达最高,同时miR-143-5p低表达而USP14高表达。与Het-1A组比较,KYSE450组HK2的蛋白表达水平增加,同时细胞ECAR增加,整体糖酵解OCR减少;敲低CircLPAR3的表达导致细胞HK2的蛋白表达水平减少,ECAR减少,整体糖酵解OCR增加;在抑制CircLPAR3的表达情况下,抑制miR-143-5p的表达能够部分逆转细胞的糖酵解途径;双荧光素酶实验验证了CircLPAR3和miR-143-5p的靶向关系,以及miR-143-5p和USP14的靶向关系。结论CircLPAR3能够通过调控miR-143-5p/USP14通路调节食管癌细胞糖酵解途径。

miR-143在肌细胞中的表达及其影响

本试验旨在研究microRNA-143(miR-143)对小鼠肌细胞增殖和分化的影响。利用Real-time PCR方法对细胞不同分化时期进行检测,并且在小鼠肌细胞C2C12中通过转染miR-143mimics和Inhibitor对标志基因myogenin(MyoG)进行检测,然后利用免疫荧光和Western blotting方法对组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因表达水平进行检测。结果表明,miR-143与肌细胞的增殖和分化密切相关,过表达miR-143后,肌细胞标志基因MyoG出现下调,敲低后结果相反,且在分化细胞中过表达miR-143,免疫荧光和Western blotting结果显示,标志基因MHC的表达水平下降。因此,miR-143是一个潜在的影响肌肉生长发育的microRNA,为以后肌肉发育和功能的研究提供了一个新的资料。

p53、14-3-3σ、miR-365在UVB致HaCaT细胞G_2/M期阻滞中的作用

目的:研究30mJ/cm2的UVB照射后,HaCaT细胞周期的改变及其可能机制。方法:以人永生化上皮细胞(HaCaT)为研究对象,波长305nm的UVB为干预因子,首先观察了HaCaT细胞在30mJ/cm2的UVB作用后其细胞周期的变化;其次观察了UVB照后不同时间点p53蛋白、14-3-3σ蛋白表达的改变;最后用miR-365高表达的HaCaT细胞分析了miR-365在UVB所致了的周期阻滞中的可能作用。结果:HaCaT细胞在30mJ/cm2的UVB作用后18h出现较明显的G2/M期阻滞;p53、磷酸化的p53以及14-3-3σ蛋白在UVB照射后均有明显升高;miR-365高表达的HaCaT细胞,14-3-3σ蛋白的mRNA表达下降,且在UVB照射后无明显改变。结论:30mJ/cm2的UVB照射可诱导HaCaT细胞发生G2/M期阻滞,p53、14-3-3σ、miR-365可能在其中发挥了重要作用。

miR-217通过靶向14-3-3ν抑制胃癌转移的作用及机制研究

目的探讨miRNA-217(miR-217)抑制胃癌细胞转移的作用及其机制。方法 qRT-PCR法比较胃癌组织、癌旁组织、胃癌细胞系和正常胃上皮细胞中miR-217的表达差异。转染miR-217mimics或Inhibitors后,通过Transwell侵袭实验观察miR-217的胃癌细胞转移能力的影响;建立裸鼠尾静脉转移模型,观察稳定表达miR-217在体内对胃癌转移能力的影响;生物信息学分析miR-217的候选靶基因为14-3-3ν,荧光素酶报告基因实验检测SGC7901细胞中miR-217过表达对野生型和突变型14-3-3ν荧光素酶活性的影响。Western blot检测miR-217对14-3-3ν野生型和突变体蛋白表达的影响。结果 miR-217在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织(P<0.01);在各胃癌细胞中的表达量较正常胃上皮细胞GES显著降低(P<0.01)。miR-217mimics抑制SGC7901细胞的侵袭能力,与阴性对照的差异有统计学意义(P<0.01)。而miR-217inhibitors明显促进SGC7901细胞的侵袭能力(P<0.01);体内实验发现稳定过表达miR-217的SGC7901细胞转移能力明显降低。荧光素酶报告基因结果证实miR-217能够抑制14-3-3ν的3′-UTR区荧光素酶活性;Western blot结果显示转染miR-217后,SGC7901细胞中的14-3-3ν蛋白水平明显低于对照组;Western blotting结果显示miR-217过表达显著抑制14-3-3ν-wt,而不能抑制14-3-3ν-mut的蛋白表达。结论 miR-217能够通过靶向14-3-3ν抑制胃癌转移,促进miR-217的表达或抑制14-3-3ν的表达可能是抑制胃癌转移的有效手段。

miR-144/451通过干扰14-3-3ζ/AKT/ROS正反馈通路抑制ROS的产生

利用miR-144/451小分子RNA基因敲除小鼠分离骨髓有核红细胞,使用流式细胞术、定量PCR和Western blot等方法证明miR-144/451是否通过干扰14-3-3ζ/AKT/ROS正反馈通路抑制超氧化活性氧簇(ROS)的产生。结果表明:miR-144/451敲除小鼠呈现小细胞性溶血性贫血,可能是miR-144/451敲后除引起14-3-3ζ增高,而14-3-3ζ增高可引起轻度AKT磷酸化,从而引起Foxo3入核障碍;ROS水平增高,进而激活AKT磷酸化,且ROS促AKT磷酸化程度比14-3-3ζ更强,从而加强14-3-3ζ与Foxo3的结合,引起Foxo3进一步出核,形成正反馈调节机制;ROS水平进一步增高,导致红细胞凋亡加速,小鼠呈现贫血症状。

低氧下miR-451a对K562细胞向红系分化过程的影响

目的:探讨低氧下K562细胞向红系分化过程中GATA-1蛋白的表达变化及GATA-1如何通过上调miR-451a表达抑制14-3-3ζ的表达调控红系分化。方法:将K562细胞分为常氧组及低氧组,经氯化血红素(hemin)诱导96 h后,检测联苯胺染色阳性细胞率、γ-globin的mRNA表达以及CD235a的表达等相应红系分化指标,验证模型是否复制成功;采用Western blot及qRT-PCR检测GATA-1蛋白和miR-451a在上述2组中的表达变化及过表达GATA-1后miR-451a的表达变化;将常氧组和低氧组细胞分别分为阴性对照组(NC组)及miR-451a过表达组,结合相应红系分化指标共同判断4组细胞红系分化程度;过表达miR-451a后通过Western blot检测14-3-3ζ的表达变化。结果:低氧下K562细胞诱导96 h后联苯胺染色阳性细胞率、γ-globin的mRNA表达及CD235a的表达均显著高于0 h(P<0.05),这提示,低氧下K562细胞红系分化模型复制成功。低氧组GATA-1蛋白及miR-451a的表达水平均显著高于常氧组(P<0.05)。低氧下过表达GATA-1后,miR-451a的表达水平较NC组明显升高(P<0.05)。低氧下过表达miR-451a后,联苯胺染色阳性细胞率、γ-globin的mRNA表达水平及CD235a的表达均明显高于NC组(P<0.05)。14-3-3ζ的蛋白表达水平检测结果显示,低氧下miR-451a过表达组14-3-3ζ的表达水平低于NC组(P<0.05)。结论:低氧条件可显著提高GATA-1蛋白的表达水平,GATA-1表达的升高可上调miR-451a,进而抑制14-3-3ζ的蛋白表达,阻碍K562细胞红系分化模型中的细胞增殖过程,发挥促红系分化的作用。