骨髓间充质干细胞来源的miR-199a-5p通过抑制ZIK1/MAP3K11调节肾细胞癌细胞的增殖和侵袭

目的:研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)来源的外泌体(exsome)中miR-199a-5p对肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)细胞增殖和侵袭的影响。方法:分离骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BM-MSCs-Exo),电子显微镜观察外泌体形态,Western blot方法检测外泌体标志蛋白CD9和CD63。CCK-8法检测RCC细胞在不同条件下的增殖速度,Transwell法检测RCC细胞的侵袭能力,q-PCR法检测miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,双荧光素酶实验验证miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11基因的3’UTR区域靶向结合。结果:BM-MSCs-Exo电镜下呈圆形囊泡状,直径约100 nm,且高表达CD9和CD63,RCC细胞摄取BM-MSCs-Exo后增殖和侵袭能力均被抑制,过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著抑制RCC细胞的增殖和侵袭能力,抑制BM-MSCs-Exo中的miR-199a-5p后能缓解BM-MSCs-Exo对RCC的抑制作用,且发现过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著降低ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,而在BM-MSCs-Exo中抑制miR-199a-5p有相反作用。结论:BM-MSCs-Exo通过向RCC细胞转运miR-199a-5p抑制ZIK1和MAP3K11的表达,进而抑制RCC细胞的增殖和侵袭。

T2DM患者血清miR-199a-3p水平与DR的相关性研究

目的探讨2型糖尿病(T2DM)患者血清miR-199a-3p水平与糖尿病视网膜病变(DR)的相关性。方法纳入2021年9月—2022年8月在中国中医科学院眼科医院诊断为T2DM的患者81例(162只眼),根据是否发生DR分为DR组51例(102只眼)和非DR组30例(60只眼),选择同期来院体检的健康者30例(60只眼)作为对照组。分别采集对照组体检时,DR组、非DR组患者入院后的静脉血5 mL。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法检测3组血清miR-199a-3p相对表达量,并检测血清生化指标。分析血清miR-199a-3p水平与DR发生的相关性,并评估对DR发生的影响价值。结果(1)生化指标:3组空腹血浆葡萄糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)水平比较,差异均有统计学意义(F_(FPG)=88.218、F_(HbA1c)=92.815、F_(ALT)=28.522、F_(AST)=19.647、F_(TG)=27.680,均P=0.000)。非DR组FPG、HbAlc、ALT水平均高于对照组,差异均有统计学意义(t_(FPG)=10.302、t_(HbA1c)=9.977,均P=0.000;tALT=2.924,P=0.015);AST、TG水平与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。DR组所有生化指标水平均高于对照组和非DR组,差异均有统计学意义(对照组:t_(FPG)=15.123、t_(HbAlc)=15.275、t_(ALT)=7.357、t_(AST)=6.649、t_(TG)=7.898,均P=0.000;非DR组:t_(FPG)=3.929、t_(HbAlc)=3.772,均P=0.001;t_(AST)=3.591,P=0.002;tALT=4.410、t_(TG)=4.210,均P=0.000)。(2)血清miR-199a-3p水平:3组间血清miR-199a-3p水平比较,差异有统计学意义(F=25.100,P=0.000);非DR组、DR组血清miR-199a-3p水平均高于对照组,差异均有统计学意义(t^(T2DM)=2.147,P=0.035;t_(DR)=6.517,P=0.000);DR组血清miR-199a-3p水平高于非DR组,差异有统计学意义(t=4.606,P=0.000)。(3)DR分期对指标的影响:PDR期与NPDR期患者血清miR-199a-3p水平比较,PDR期低于NPDR期,差异有统计学意义(t=7.272,P=0.000)。PDR期与NPDR期患者生化指标比较,PDR期FPG、HbAlc、ALT、AST、TG水平均高于NPDR期,差异均有统计学意义(t_(FPG)=4.444、t_(HbAlc)=4.074、t_(ALT)=3.818,均P=0.000;t_(AST)=2.172,P=0.035;t_(TG)=3.587,P=0.001)。(4)相关性分析:DR患者血清miR-199a-3p水平与T2DM病程、FPG、HbAlc、ALT、AST、TG均呈负相关(r_(T2DM)病程=-0.368,P=0.008;r_(HbA1c)=-0.456,P=0.001;r_(AST)=-0.416,P=0.002;r_(ALT)=-0.405,P=0.003;r_(FPG)=-0.472、r_(TG)=-0.488,均P=0.000)。T2DM患者血清miR-199a-3p水平预测发生DR时,ROC曲线下面积为0.783,有统计学意义(P=0.000),血清miR-199a-3p水平对诊断DR有一定的预测性能,ROC曲线最佳临界点的约登指数为0.475,灵敏度为0.867,特异度为0.608。结论T2DM患者血清miR-199a-3p的表达与DR的发生密切相关,且与DR的病程、血糖变化和脂质代谢指标相关,可能成为T2DM患者发生DR的潜在生物学标志。

miR-199a-5p在肝脏组织中的表达及其作用的初步研究

目的:探究不同营养状态下miR-199a-5p在肝脏中的表达水平,以及其对肝细胞甘油三酯(triglyceride,TAG)含量的影响及其潜在机制。方法:RT-qPCR检测高脂饮食小鼠肝脏组织中miR-199a-5p的表达;分别使用miR-199a-5p模拟物、抑制剂、阴性对照和pcDH-CD36-flag质粒转染Hepa1-6和AML12细胞,通过RT-qPCR和Western blot检测脂代谢相关标志物表达变化,采用试剂盒检测TAG含量;通过miRDB(microRNA Target Prediction Database)预测miR-199a-5p的靶基因并通过双荧光素酶报告实验进行验证。结果:高脂饮食和饥饿状态下C57BL/6J小鼠肝脏中miR-199a-5p的表达水平升高;过表达miR-199a-5p能够降低肝细胞内TAG,而miR-199a-5p抑制剂会增加细胞内TAG含量;miR-199a-5p通过作用于脂肪酸转位酶CD36基因的3′非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)降低其蛋白表达。结论:在肝脏脂质积累过程中,miR-199a-5p的表达水平增加,并且miR-199a-5p可能通过靶向CD36降低肝细胞内TAG含量。

miR-199a-5p通过靶向TGF-β2参与调节肝纤维化进程

目的:探讨miR-199a-5p在肝硬化发生中的作用机制。方法:通过设计合成miR-199a-5p mimics和miR-199a-5p inhibitor序列,对miR-199a-5p进行过表达和抑制研究,利用CCK8、5EdU、Western blotting等方法检测过表达miR-199a-5p对Lx-2细胞增殖活性的影响。以Lx-2细胞cDNA为模板,分别利用TGF-β23′UTR的野生型引物序列与miR-199a-5p潜在结合位点突变引物序列进行PCR扩增,获得野生型TGF-β23′UTR序列和突变型TGF-β23′UTR序列,并通过双荧光报告基因实验揭示TGF-β表达的调控过程。结果:体外实验结果显示,Lx-2细胞转染miR-199a-5p mimics后8、12、24 h,细胞活性均较对照组增加(P<0.05~P<0.01),α-SMA蛋白表达水平较对照组提高(P<0.05);Lx-2细胞转染miR-199a-5p inhibitor后8、12、24 h,细胞活性均较对照组降低(P<0.05~P<0.01),α-SMA表达水平亦较对照组下降(P<0.05)。双荧光素酶试验显示,与对照组相比,转染miR-199a-5p mimics后,包含野生型TGF-β23′UTR序列(WT)的荧光素酶质粒表达明显降低(P<0.01),而包含miR-199a-5p结合位点突变序列(MUT)的荧光素酶质粒表达无明显变化(P>0.05)。结论:上调miR-199a-5p表达可促进Lx-2细胞系增殖,同时,miR-199a过表达可促进细胞基质蛋白α-SMA表达,激活Lx-2向纤维化方向发展。miR-199a-5p在肝硬化进程中起促进肝纤维化和肝硬化作用,TGF-β2作为肝纤维化的主要调控因子之一,miR-199a-5p通过调控下游TGF-β2的表达,实现对肝纤维化和肝硬化的促进作用。

银杏酮酯滴丸联合尤瑞克林治疗急性脑梗死的效果及对神经因子、PTX3和miR-199a的影响

目的探讨银杏酮酯滴丸联合尤瑞克林治疗急性脑梗死的效果及对神经因子、PTX3和miR-199a的影响。方法选择2019年8月至2022年7月收治的78例急性脑梗死患者为研究对象,根据入院时间不同将其分为对照组与观察组,各39例。两组患者入院后均给予对症治疗,对照组在此基础上给予常规溶栓加尤瑞克林治疗,观察组在对照组基础上加银杏酮酯滴丸治疗。比较两组的治疗效果。结果观察组的治疗总有效率高于对照组(P<0.05)。治疗后,观察组的髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经生长因子(GFAP)水平低于对照组,胶质纤维酸性蛋白(NGF)水平高于对照组(P<0.05)。治疗后,观察组的正五聚蛋白3(PTX3)水平低于对照组,miR-199a相对表达量高于对照组(P<0.05)。结论银杏酮酯滴丸联合尤瑞克林治疗急性脑梗死的效果满意,可有效改善患者的神经因子水平,调节PTX3水平及miR-199a相对表达量。

LncRNA NORAD通过miR-199a-3p调控ZNF217对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响

背景与目的针对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的治疗和诊断仍然是医学界的难题,而探究NSCLC发生发展的分子机制是当前研究的热点。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)NORAD在多种癌细胞中高表达,可能是促进NSCLC发生的分子靶点。探讨LncRNA NORAD通过miR-199a-3p调控锌指蛋白217(zinc finger protein 217,ZNF217)对NSCLC细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响。方法实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测正常肺上皮细胞BEAS-2B、肺癌H460细胞和顺铂(Cisplatin,DDP)耐药细胞株H460/DDP细胞中NORAD、miR-199a-3p、ZNF217基因表达;将H460/DDP细胞分为control组、si-NC组、si-NORAD组、miR-NC组、miR-199a-3p mimic组、si-NORAD+inhibitor NC组、si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor组。检测细胞增殖、细胞凋亡情况,各组细胞NORAD、miR-199a-3p、ZNF217基因表达,Ki-67、caspase-9、ZNF217蛋白表达量;验证miR-199a-3p与NORAD和ZNF217的关系。结果与BEAS-2B细胞相比,H460和H460/DDP细胞中NORAD、ZNF217 mRNA表达显著升高(P<0.05),miR-199a-3p表达显著降低(P<0.05)。与H460细胞相比,H460/DDP细胞中NORAD、ZNF217 mRNA表达显著升高(P<0.05),miR-199a-3p表达显著降低(P<0.05)。与control组和si-NC组相比,si-NORAD组H460/DDP细胞增殖率、NORAD、ZNF217 mRNA表达、Ki-67、ZNF217蛋白表达显著降低(P<0.05),凋亡率、miR-199a-3p表达、caspase-9表达显著升高(P<0.05)。与miR-NC组相比,miR-199a-3p mimic组H460/DDP细胞增殖率、NORAD、ZNF217 mRNA表达、Ki-67、ZNF217蛋白表达显著降低(P<0.05),凋亡率、miR-199a-3p、caspase-9表达显著升高(P<0.05)。与si-NORAD+inhibitor NC组相比,si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor组H460/DDP细胞增殖率、ZNF217 mRNA表达、Ki-67、ZNF217蛋白表达显著升高,凋亡率、miR-199a-3p表达、caspase-9表达显著降低(P<0.05)。结论下调NORAD表达可增强miR-199a-3p表达并抑制ZNF217表达,进而抑制H460/DDP细胞增殖,促进其凋亡,增强其DDP化疗敏感性。

阿替普酶联合抗血小板聚集治疗可影响急性缺血性脑卒中患者miR-150-5p及miR-199a表达水平

目的:观察阿替普酶联合抗血小板聚集治疗对急性缺血性脑卒中(AIS)患者miR-150-5p及miR-199a表达的影响。方法:选取150例AIS患者,随机分为对照组和观察组,每组75例。对照组予阿替普酶溶栓治疗,观察组在对照组的基础上联合抗血小板聚集治疗。比较2组美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)、改良Rankin评分量表(mRS)、Barthel指数、miR-150-5p及miR-199a表达变化情况。比较2组患者早期神经功能恶化的发生率。结果:2组患者治疗14 d后Barthel指数较治疗前升高,NIHSS、mRS评分较治疗前降低(P均<0.05)。与对照组比较,观察组治疗14 d后的临床总有效率、Barthel指数、血清miR-150-5p及miR-199a表达更高,而NIHSS、mRS评分更低(P均<0.05)。2组患者早期(1周内)神经功能恶化总发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:阿替普酶联合抗血小板聚集治疗AIS患者,可减轻神经功能损害,提高患者生活自理能力,还可上调miR-150-5p及miR-199a表达。

LINC00662通过调控miR-199a-5p/MAP3K1通路对胃癌侵袭、转移的影响

目的探讨LINC00662通过调控miR-199a-5p/丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶1(MAP3K1)通路对胃癌侵袭、转移的影响。方法收集2018年6月至2020年6月期间我院胃癌患者癌组织及癌旁组织,实时定量PCR检测胃癌组织及癌旁组织中LINC00662、miR-199a-5p、MAP3K1 mRNA表达。取对数生长期的SGC-7901细胞,利用LipofectamineTM2000转染试剂盒进行转染,并分为si-NC组、si-LINC00662组、si-LINC00662+anti-miR-NC组、si-LINC00662+anti-miR-199a-5p组、si-LINC00662+miR-NC组、si-LINC00662+miR-199a-5p组、miR-NC组、miR-199a-5p组、空载体组、LINC00662过表达组、anti-miR-NC组、anti-miR-199a-5p组,另取未转染的SGC-7901细胞作为空白组。Transwell实验检测各组细胞的侵袭与迁移;划痕实验检测各组细胞迁移能力;Western blotting检测各组细胞中MAP3K1、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)表达;双荧光素酶报告基因实验验证LINC00662与miR-199a-5p、miR-199a-5p与MAP3K1的靶向关系。结果与癌旁组织比较,胃癌组织中LINC00662、MAP3K1 mRNA表达水平显著升高,miR-199a-5p表达水平显著降低(均P<0.05)。与空白组和si-NC组比较,si-LINC00662组SGC-7901细胞中LINC00662表达水平显著降低,侵袭、迁移细胞数目显著减少,划痕愈合率显著降低,MAP3K1、MMP-2、MMP-9、N-cadherin相对表达量显著降低,miR-199a-5p表达水平显著升高(均P<0.05)。与si-LINC00662组和si-LINC00662+anti-miR-NC组比较,si-LINC00662+anti-miR-199a-5p组SGC-7901细胞中miR-199a-5p表达水平显著降低,侵袭、迁移细胞数目显著升高,划痕愈合率显著升高,MAP3K1、MMP-2、MMP-9、N-cadherin相对表达量显著升高(均P<0.05)。与si-LINC00662组和si-LINC00662+miR-NC组比较,si-LINC00662+miR-199a-5p组SGC-7901细胞中miR-199a-5p表达水平显著升高,侵袭、迁移细胞数目显著降低,划痕愈合率显著降低,MAP3K1、MMP-2、MMP-9、N-cadherin相对表达量显著降低(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实LINC00662靶向负调控miR-199a-5p表达,miR-199a-5p靶向负调控MAP3K1表达。结论胃癌组织中LINC00662高表达,si-LINC00662通过调控miR-199a-5p/MAP3K1通路抑制胃癌细胞侵袭、转移。

miR-199a-3p通过靶向CABLES-1调控流体剪切力介导的成骨细胞增殖

目的探讨miR-199a-3p在流体剪切力(fluid shear stress,FSS)诱导成骨细胞增殖中的作用及其可能的分子机制。方法对成骨细胞MC3T3-E1加载1.2 Pa FSS,时间分别为0、15、30、45、60、75、90 min。使用miR-199a-3p模拟物或miR-199a-3p抑制物转染MC3T3-E1细胞。使用将过表达的miR-199a-3p以及其阴性对照分别转染MC3T3-E1细胞,并以1.2 Pa FSS处理45 min。将pcDNA NC、pcDNA-CABLES-1、si RNA NC、si RNA CABLES-1转染至MC3T3-E1细胞中。分别共转染pc DNA-CABLES-1与miR-199a-3p mimic以及si RNA-CABLES-1与miR-199a-3p inhibitor。CCK-8实验检测细胞活性;RT-qPCR检测CABLES-1、miR-199a-3p、CDK 6、Cyclin D1、PCNA表达水平;荧光素酶报告实验检测CABLES-1和miR-199a-3p的靶向关系。免疫荧光检测CABLES-1蛋白表达。Western blot检测CABLES-1、CDK 6、PCNA、Cyclin D1的蛋白表达。结果FSS作用下MC3T3-E1细胞中的miR-199a-3p出现显著下调。过表达的miR-199a-3p抑制成骨细胞增殖,下调miR-199a-3p表达促进成骨细胞增殖。miR-199a-3p可以逆转FSS诱导的成骨细胞增殖。双荧光素酶实验表明,miR-199a-3p靶向作用于CABLES-1,过表达的miR-199a-3p可抑制CBALES-1蛋白表达。CABLES-1能够促进成骨细胞增殖。miR-199a-3p通过CABLES-1抑制FSS诱导的成骨细胞增殖。结论FSS诱导的成骨细胞增殖通过下调miR-199a-3p并通过靶向作用于CABLES-1实现。研究结果为FSS诱导成骨细胞增殖机制的研究提供新方向,也为未来机械刺激在骨关节疾病治疗中的临床应用研究提供新思路。

miR-199a-3p靶向CD151对甲状腺癌B-CPAP细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化的影响

目的探究miR-199a-3p过表达靶向CD151对甲状腺癌B-CPAP细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化的影响。方法通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-199a-3p和CD151的靶向关系。构建CD151pcDNA载体过表达CD151,将miR-199a-3p mimic与pcDNA-CD151单独或联合转染至B-CPAP细胞,将细胞随机分为4组:Control组、miR-199a-3p mimic组、pcDNA-CD151组和miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151组。BrdU染色检测细胞增殖水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;流式分选检测细胞周期分布;Transwell检测细胞侵袭能力;Western blot检测MMP-2、Ki-67、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达。结果CD151与miR-199a-3p存在靶向作用关系。与Control组比较,miR-199a-3p mimic组BrdU阳性细胞数降低,细胞凋亡率升高,G2/M、G1期比例降低,S期比例升高,侵袭细胞数降低,MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低;pcDNA-CD151组BrdU阳性细胞数升高,细胞凋亡率降低,G2/M、G1期比例升高,S期比例降低,侵袭细胞数升高,MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高。与pcDNACD151组比较,miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151组BrdU阳性细胞数降低,细胞凋亡率升高,G2/M、G1期比例降低,S期比例升高,侵袭细胞数降低,MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低(均P<0.01)。结论miR-199a-3p过表达靶向CD151抑制甲状腺癌B-CPAP细胞增殖、侵袭和上皮间质转化,并诱导细胞凋亡。

马齿苋提取物调控miR-199a-5p对人瘢痕疙瘩成纤维细胞生长和胶原合成的影响

目的探讨马齿苋提取物调控miR-199a-5p对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(HKF)生长和胶原合成的影响。方法将HKF细胞分为对照组、马齿苋提取物(50、100、200μg/mL)组、miR-NC组、miR-199a-5p组、anti-miR-NC+200μg/mL马齿苋提取物组、anti-miR-199a-5p+200μg/mL马齿苋提取物组。CCK-8法检测HKF细胞活力,流式细胞术检测细胞周期分布,RT-qPCR法检测细胞miR-199a-5p表达,Western blot法检测细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达。结果与对照组比较,马齿苋提取物组细胞活力、S期细胞比例、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达降低(P<0.05),miR-199a-5p表达、G_(0)/G_(1)期细胞比例升高(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-199a-5p组细胞活力、S期细胞比例、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达降低(P<0.05),G_(0)/G_(1)期细胞比例升高(P<0.05)。与anti-miR-NC+200μg/mL马齿苋提取物组比较,anti-miR-199a-5p+200μg/mL马齿苋提取物组细胞活力、S期细胞比例、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达升高(P<0.05),G_(0)/G_(1)期细胞比例降低(P<0.05)。结论马齿苋提取物可能通过上调miR-199a-5p表达抑制HKF细胞生长和胶原合成。

miR-199a-3p通过靶向VEGFA缓解H_(2)O_(2)诱导泪腺上皮细胞损伤

目的观察miR-199a-3p、血管内皮生长因子(VEGF)A对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导泪腺上皮细胞氧化应激、凋亡的作用并探究二者之间的关系。方法通过H_(2)O_(2)诱导泪腺上皮细胞损伤模型。将泪腺上皮细胞随机分为对照组(不做任何处理)、H_(2)O_(2)组(200μmol/L)H_(2)O_(2)+anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、H_(2)O_(2)+anti-miR-199a-3p组(转染anti-miR-199a-3p)、H_(2)O_(2)+pcDNA组(转染pcDNA)、H_(2)O_(2)+pcDNA-VEGFA组(转染pcDNA-VEGFA)、H_(2)O_(2)+anti-miR-199a-3p+si-con组(共转染anti-miR-199a-3p和si-con)、H_(2)O_(2)+anti-miR-199a-3p+si-VEGFA组(共转染anti-miR-199a-3p和si-VEGFA),除对照组及H_(2)O_(2)组外,剩余组转染泪腺上皮细胞,再用H_(2)O_(2)处理2 h。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞miR-199a-3p、VEGFA表达;Western印迹法检测细胞VEGFA、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达;免疫荧光法检测细胞活性氧(ROS)含量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果在H_(2)O_(2)的诱导下,泪腺上皮细胞中miR-199a-3p表达显著升高,而VEGFA表达显著下降(均P<0.05)。敲除miR-199a-3p表达可以降低H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞中ROS、MDA、Bax表达,促进GSH、Bcl-2表达,降低细胞的凋亡水平,差异显著(均P<0.05)。Starbase预测miR-199a-3p与VEGFA的3′非翻译区(UTR)端存在6个连续的结合位点,且miR-199a-3p明显抑制野生型VEGFA的荧光活性,并负向调控VEGFA蛋白表达(均P<0.05)。过表达VEGFA蛋白可降低H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞中ROS、MDA、Bax表达,促进GSH、Bcl-2表达,降低细胞的凋亡水平,差异显著(均P<0.05)。同时敲低miR-199a-3p和VEGFA,H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞中ROS、MDA、Bax表达显著增加,GSH、Bcl-2表达显著降低,且凋亡水平显著增加(均P<0.05)结论miR-199a-3p促进H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞氧化应激和凋亡,其机制与靶向调控VEGFA有关。

miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12在老年慢性HBV感染患者不同免疫状态下的评估价值

目的分析老年慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者不同免疫状态下血清miR-199a-5p、干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-12表达及其对不同免疫状态下老年慢性HBV感染的评估价值。方法106例老年慢性HBV感染患者依据免疫状态的不同分为再活动期49例,免疫控制期57例。另选取同期接受检查的健康志愿者55例为对照组。以实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)测定所有研究对象血清中miR-199a-5p水平,采用酶联免疫吸附试验测定血清IFN-γ、IL-12水平。以Spearman相关性分析血清miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平与老年慢性HBV感染患者免疫状态的相关性,以受试者工作特征(ROC)曲线分析患者血清miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平对老年慢性HBV感染患者不同免疫状态的评估价值。结果研究组血清miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平显著高于对照组(P<0.05);再活动期患者血清miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平显著高于免疫控制期患者(P<0.05)。Spearman相关性分析显示,血清miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平与老年慢性HBV感染患者免疫状态呈正相关(r=0.468、0.496、0.435,均P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平单独及联合评估老年慢性HBV感染患者免疫状态的曲线下面积(AUC)分别为0.669、0.802、0.646、0.841,检测灵敏度分别为50.00%、90.48%、38.10%、69.05%,特异性分别为77.55%、59.18%、91.84%、87.76%,联合评估效能显著优于各指标单独评估。结论老年慢性HBV感染患者不同免疫状态下血清中miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平表达不同,检测其水平可评估患者免疫状态,且三者联合评估的效能更佳,可为临床治疗提供一定的参考依据。

罗汉果皂苷提取物通过调控miR-199a-3p对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的探究罗汉果皂苷提取物对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响及潜在分子机制。方法体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,采用高糖和罗汉果皂苷提取物干预HK-2细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力,流式细胞术分析细胞凋亡率,Western印迹分析B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测miR-199a-3p的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-8的表达。结果高糖能够抑制HK-2细胞活力,促进细胞凋亡和Bax的表达,抑制Bcl-2的表达,提高TNF-α、IL-6和IL-8的含量;罗汉果皂苷提取物能够抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡,提高细胞活力,促进miR-199a-3p的表达,降低TNF-α、IL-6和IL-8的含量;过表达miR-199a-3p能够抑制高糖诱导的HK-2细胞损伤,下调miR-199a-3p能够逆转罗汉果皂苷提取物对高糖诱导的HK-2细胞损伤保护作用。结论罗汉果皂苷提取物能够通过上调miR-199a-3p的表达对高糖诱导的HK-2细胞损伤起保护作用。

舒芬太尼通过miR-199a-5p减轻缺氧复氧H9C2细胞凋亡自噬的机制研究

目的:观察舒芬太尼对缺氧复氧(H/R)心肌细胞H9C2凋亡、自噬的影响,并探究其作用机制。方法:建立H/R H9C2细胞损伤模型,用10μmol/L舒芬太尼处理H9C2细胞再行H/R。采用脂质体法将H/R+SUF+antagomiRNA组(转染antagomiRNA,用10μmol/L舒芬太尼处理)、H/R+SUF+antagomiR-199a-5p组(转染antagomiR-199a-5p,用10μmol/L舒芬太尼处理)转染H9C2细胞并行H/R处理。采用细胞计数试剂盒(CCK8)检测培养12、24和48 h的细胞活力。采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭双染法、蛋白质印迹法检测细胞凋亡率、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、波形蛋白(survivin)、线粒体自噬相关蛋白(PINK1)、自噬标记物(LC3-Ⅱ/Ⅰ)和细胞色素C(Cyt C)的蛋白表达。结果:与H9C2组相比,H/R组细胞在48、72 h的活力均显著降低;与H/R+ddH_(2)O组相比,H/R+SUF组细胞在48、72 h的细胞活力显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05),因此选用培养48 h的细胞用于后续研究。与H9C2组相比,H/R组H9C2细胞凋亡率显著升高,Caspase-3、PINK1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和细胞质Cyt C蛋白表达水平显著升高,survivin、线粒体Cyt C蛋白表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与H/R+ddH_(2)O组相比,H/R+SUF组H9C2细胞凋亡率显著降低,Caspase-3、PINK1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和细胞质Cyt C蛋白表达水平显著降低,survivin、线粒体Cyt C蛋白表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。H/R组miR-199a-5p的表达水平显著高于H9C2组,H/R+SUF组miR-199a-5p的表达水平则显著低于H/R+ddH_(2)O组,差异均有统计学意义(P<0.05);特异性抑制miR-199a-5p的表达明显增强了舒芬太尼对H/R H9C2细胞的凋亡自噬抑制作用。结论:舒芬太尼可抑制H/R心肌细胞的凋亡和自噬,其作用机制与调控miR-199a-5p的表达水平有关。

鸡gga-miR-199a慢病毒表达系统的构建

为建立一种稳定持续表达鸡gga-miR-199a的系统,将从鸡DF-1细胞扩增到的gga-miR-199a前体序列克隆入pLL3.7慢病毒载体质粒中用以包装慢病毒。同时构建了更换pLL3.7质粒中鼠源U6启动子更换为鸡源及人源U6启动子的pLL3.7慢病毒载体质粒;将其与慢病毒包装辅助质粒共转至HEK293T细胞中,收集浓缩病毒颗粒并侵染细胞并获得过表达gga-miR-199a的单细胞克隆。提取单细胞克隆总RNA进行gga-miR-199a-5P的定量检测。结果表明,经慢病毒侵染后的细胞中鸡gga-miR-199a表达量显著提高,且人源U6启动子的转录效率最高,该研究成功建立了一种稳定持续表达鸡gga-miR-199a的慢病毒系统,说明该系统有利于在鸡活体或原代细胞中开展miRNA功能的研究。

环状RNA FAT1(hsa_circ_0001461)通过调控miR-181d-5p/miR-199a-5p促进口腔鳞状细胞癌进展

目的:探讨环状RNA FAT1(hsa_circ_0001461)-miR-181d-5p/miR-199a-5p轴在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞生物学功能中的作用及机制。方法:收集30例OSCC患者的临床组织,采用实时定量PCR检测circFAT1、miR-181d-5p及miR-199a-5p在OSCC组织和细胞中的表达。通过StarBase和双荧光素酶报告基因实验验证miR-181d-5p/miR-199a-5p与circFAT1的靶向关系。利用CCK-8、Transwell、流式细胞术检测circFAT1-miR-181d-5p/miR-199a-5p轴对于OSCC细胞活力、迁移、侵袭、凋亡和周期的影响。采用免疫印迹法结合LY294002处理检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达。结果:在OSCC中circFAT1表达升高,miR-181d-5p、miR-199a-5p表达下降(P<0.001)。circFAT1可以同时靶向miR-181d-5p和miR-199a-5p(P<0.01)。沉默circFAT1、过表达miR-181d及miR-199a-5p抑制了OSCC细胞活力、迁移、侵袭和周期进展、诱导凋亡,同时抑制PI3K/Akt/mTOR通路的激活;过表达circFAT1、抑制miR-181d-5p及miR-199a-5p则发挥相反作用(P<0.05)。miR-181d-5p、miR-199a-5p可部分逆转circFAT1对OSCC细胞生物学功能的影响(P<0.05)。LY294002预处理逆转了过表达circFAT1对PI3K/Akt/mTOR通路和细胞活力的影响(P<0.05)。结论:circFAT1通过调控miR-181d-5p和miR-199a-5p促进OSCC细胞恶性进展。

miR-199a-5p通过靶向JunB介导心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的作用机制

目的:观察miR-199a-5p对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:将120只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、Antagomir对照组、Antagomir组、Agomir对照组及Agomir组。除假手术组(18只)外,其余组大鼠采用持续14 d结扎左冠状动脉前降支诱导构建心肌梗死后心力衰竭大鼠模型,成功诱导94只心力衰竭大鼠,剔除4只,随机分组,每组大鼠18只。分别给予Antagomir对照组、Antagomir组、Agomir对照组及Agomir组大鼠心肌内注射2×1010PFU/mL miR-199a-5p Antagomir对照液、Antagomir液、Agomir对照液及Agomir稀释液各100μL,假手术组与模型组大鼠均等量注射生理盐水。2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法检测心肌梗死面积;苏木精-伊红(HE)染色法检测心肌组织病理损伤情况;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)染色法检测心脏缺血部位细胞凋亡水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测各组大鼠心肌组织中miR-199a-5p、转录因子活化蛋白激酶B(JunB)基因相对表达水平;双荧光素酶试验验证miR-199a-5p与JunB的靶向关系;免疫印迹法(Western Blot)检测各组大鼠心肌组织内活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-Caspase 3)、JunB、淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达情况。结果:与假手术组比较,模型组大鼠心肌梗死面积增加,组织结构不完整,心肌细胞排列错乱不规则,炎性细胞浸润,细胞间有明显凋亡,miR-199a-5p基因及Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表达水平升高,JunB mRNA及JunB、Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05);与模型组比较,Antagomir对照组及Agomir对照组大鼠心肌病理组织学变化、相关基因和蛋白相对表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Antagomir组大鼠心肌组织病理情况显著改善,miR-199a-5p基因及Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表达水平降低,JunB mRNA及JunB、Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05);Agomir组大鼠心肌组织病理损伤加重,miR-199a-5p基因及Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表达水平升高,JunB mRNA及JunB、Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。JunB为miR-199a-5p的靶基因。结论:miR-199a-5p可诱导心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡,可能与靶向抑制JunB表达有关。

miR-199a-3p在乳腺癌中的表达及其作用

背景与目的:多种微小RNA(micro RNA,mi RNA)在乳腺癌中异常表达,在乳腺癌的发生、发展中起重要作用。mi RNA可能是治疗乳腺癌的新靶点。该研究旨在探讨mi R-199a-3p在乳腺癌中的表达水平,及其对乳腺癌癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:运用实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR)检测乳腺癌患者癌组织、癌旁正常组织、人乳腺癌细胞和人乳腺细胞中mi RNA-199a-3p的表达水平,mi R-199a-3p mimic(或inhibitor)转染乳腺癌细胞MDA-MB-231过表达(或沉默)mi R-199a-3p的表达后,通过MTT法检测细胞增殖能力,Hoechst染色法和caspase-3活力测试检测细胞凋亡情况。结果:相对癌旁正常组织和人正常乳腺细胞,mi R-199a-3p在乳腺癌患者癌组织和人乳腺癌细胞中表达下调。在MDAMB-231中转染mi R-199a-3p mimic过表达mi R-199a-3p可抑制细胞增殖,促进其凋亡;在MDA-MB-231中转染mi R-199a-3p inhibitor沉默mi R-199a-3p可促进细胞增殖,抑制其凋亡。结论:mi R-199a-3p在乳腺癌中表达下调,并通过调节乳腺癌细胞增殖和凋亡发挥抑癌作用。

LncRNA LUCAT1通过靶向miR-199a-5p调控宫颈癌细胞活性、侵袭迁移及其分子机制

目的研究长链非编码RNA肺癌相关转录产物(LUCAT)1对宫颈癌细胞的活性、迁移和侵袭的影响,并探讨其机制。方法运用qRT-PCR法检测宫颈癌细胞Hela、正常宫颈细胞Ect1/E6E7中LUCAT1、miR-199a-5p的表达;将si-con组(转染si-con)、si-LUCAT1组(转染si-LUCAT1)、miR-199a-5p组(转染miR-199a-5p模拟物)、miR-NC组(转染miR-NC)、si-con+anti-miR-199a-5p组(共转染si-con和anti-miR-199a-5p)、si-LUCAT1+anti-miR-199a-5p组(共转染si-LUCAT1和anti-miR-199a-5p),均用脂质体法转染至Hela细胞;噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞的活性;Transwell法检测各组细胞的迁移和侵袭;双荧光素酶报告基因检测实验检测各组细胞的荧光活性。结果与正常宫颈细胞Ect1/E6E7相比,宫颈癌细胞Hela中LUCAT1表达显著升高,miR-199a-5p表达显著降低;敲减LUCAT1、过表达miR-199a-5p均可明显抑制Hela细胞的活性、迁移和侵袭;miR-199a-5p可抑制野生型LUCAT1细胞的荧光活性,且LUCAT1可负向调控miR-199a-5p的表达;抑制miR-199a-5p可逆转敲减LUCAT1对Hela细胞的活性、迁移、侵袭的抑制作用。结论LUCAT1可促进宫颈癌细胞的活性、迁移、侵袭,其机制可能与靶向miR-199a-5p有关,将可为宫颈癌的治疗提供靶点。