T2DM患者血清miR-199a-3p水平与DR的相关性研究

目的探讨2型糖尿病(T2DM)患者血清miR-199a-3p水平与糖尿病视网膜病变(DR)的相关性。方法纳入2021年9月—2022年8月在中国中医科学院眼科医院诊断为T2DM的患者81例(162只眼),根据是否发生DR分为DR组51例(102只眼)和非DR组30例(60只眼),选择同期来院体检的健康者30例(60只眼)作为对照组。分别采集对照组体检时,DR组、非DR组患者入院后的静脉血5 mL。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法检测3组血清miR-199a-3p相对表达量,并检测血清生化指标。分析血清miR-199a-3p水平与DR发生的相关性,并评估对DR发生的影响价值。结果(1)生化指标:3组空腹血浆葡萄糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)水平比较,差异均有统计学意义(F_(FPG)=88.218、F_(HbA1c)=92.815、F_(ALT)=28.522、F_(AST)=19.647、F_(TG)=27.680,均P=0.000)。非DR组FPG、HbAlc、ALT水平均高于对照组,差异均有统计学意义(t_(FPG)=10.302、t_(HbA1c)=9.977,均P=0.000;tALT=2.924,P=0.015);AST、TG水平与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。DR组所有生化指标水平均高于对照组和非DR组,差异均有统计学意义(对照组:t_(FPG)=15.123、t_(HbAlc)=15.275、t_(ALT)=7.357、t_(AST)=6.649、t_(TG)=7.898,均P=0.000;非DR组:t_(FPG)=3.929、t_(HbAlc)=3.772,均P=0.001;t_(AST)=3.591,P=0.002;tALT=4.410、t_(TG)=4.210,均P=0.000)。(2)血清miR-199a-3p水平:3组间血清miR-199a-3p水平比较,差异有统计学意义(F=25.100,P=0.000);非DR组、DR组血清miR-199a-3p水平均高于对照组,差异均有统计学意义(t^(T2DM)=2.147,P=0.035;t_(DR)=6.517,P=0.000);DR组血清miR-199a-3p水平高于非DR组,差异有统计学意义(t=4.606,P=0.000)。(3)DR分期对指标的影响:PDR期与NPDR期患者血清miR-199a-3p水平比较,PDR期低于NPDR期,差异有统计学意义(t=7.272,P=0.000)。PDR期与NPDR期患者生化指标比较,PDR期FPG、HbAlc、ALT、AST、TG水平均高于NPDR期,差异均有统计学意义(t_(FPG)=4.444、t_(HbAlc)=4.074、t_(ALT)=3.818,均P=0.000;t_(AST)=2.172,P=0.035;t_(TG)=3.587,P=0.001)。(4)相关性分析:DR患者血清miR-199a-3p水平与T2DM病程、FPG、HbAlc、ALT、AST、TG均呈负相关(r_(T2DM)病程=-0.368,P=0.008;r_(HbA1c)=-0.456,P=0.001;r_(AST)=-0.416,P=0.002;r_(ALT)=-0.405,P=0.003;r_(FPG)=-0.472、r_(TG)=-0.488,均P=0.000)。T2DM患者血清miR-199a-3p水平预测发生DR时,ROC曲线下面积为0.783,有统计学意义(P=0.000),血清miR-199a-3p水平对诊断DR有一定的预测性能,ROC曲线最佳临界点的约登指数为0.475,灵敏度为0.867,特异度为0.608。结论T2DM患者血清miR-199a-3p的表达与DR的发生密切相关,且与DR的病程、血糖变化和脂质代谢指标相关,可能成为T2DM患者发生DR的潜在生物学标志。

槐角黄酮调控miR-199a-3p/p38MAPK/NF-κB对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和炎症因子分泌的影响

目的 探讨槐角黄酮对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和炎症因子分泌的影响。方法 将乳腺癌细胞BT549分为正常对照(NC)组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、miR-NC组、miR-199a-3p组、高剂量+anti-miR-NC组、高剂量+anti-miR-199a-3p组。采用CCK-8、克隆形成实验评估细胞增殖;采用Transwell法评估细胞迁移和侵袭。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-199a-3p表达。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测细胞培养液上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)以及白细胞介素-1β(IL-1β)水平。采用蛋白免疫印迹(Western blot)检测p-p38MAPK和p-p65蛋白表达。结果 与NC组比较,低、中、高剂量组BT549细胞活力、克隆形成数、迁移数、侵袭数降低,miR-199a-3p表达升高,细胞培养液上清中TNF-α、IL-6以及IL-1β水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-199a-3p组BT549细胞活力、克隆形成数、迁移数、侵袭数降低,细胞培养液上清中TNF-α、IL-6以及IL-1β水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与高剂量+anti-miR-NC组比较,高剂量+anti-miR-199a-3p组BT549细胞活力、克隆形成数、迁移数、侵袭数升高,细胞培养液上清中TNF-α、IL-6以及IL-1β水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较,高剂量组BT549细胞p-p38MAPK和p-p65蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与高剂量+anti-miR-NC组比较,高剂量+anti-miR-199a-3p组BT549细胞p-p38MAPK和p-p65蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 槐角黄酮可抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和炎症反应,其机制可能是通过上调miR-199a-3p表达、抑制p38MAPK/NF-κB通路实现的。

miR-199a-3p在乳腺癌中的表达及其作用

背景与目的:多种微小RNA(micro RNA,mi RNA)在乳腺癌中异常表达,在乳腺癌的发生、发展中起重要作用。mi RNA可能是治疗乳腺癌的新靶点。该研究旨在探讨mi R-199a-3p在乳腺癌中的表达水平,及其对乳腺癌癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:运用实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR)检测乳腺癌患者癌组织、癌旁正常组织、人乳腺癌细胞和人乳腺细胞中mi RNA-199a-3p的表达水平,mi R-199a-3p mimic(或inhibitor)转染乳腺癌细胞MDA-MB-231过表达(或沉默)mi R-199a-3p的表达后,通过MTT法检测细胞增殖能力,Hoechst染色法和caspase-3活力测试检测细胞凋亡情况。结果:相对癌旁正常组织和人正常乳腺细胞,mi R-199a-3p在乳腺癌患者癌组织和人乳腺癌细胞中表达下调。在MDAMB-231中转染mi R-199a-3p mimic过表达mi R-199a-3p可抑制细胞增殖,促进其凋亡;在MDA-MB-231中转染mi R-199a-3p inhibitor沉默mi R-199a-3p可促进细胞增殖,抑制其凋亡。结论:mi R-199a-3p在乳腺癌中表达下调,并通过调节乳腺癌细胞增殖和凋亡发挥抑癌作用。

miR-199a-3p靶基因预测及生物信息学分析

目的为深入研究miR-199a-3p在膀胱癌形成和发展中的作用提供理论依据。方法分析miR-199a-3p序列,预测其靶基因和转录因子,并对靶基因进行GO富集和KEGG Pathway分析;构建TF-miR-199a-3p-靶基因网络调控图。结果 miR-199a-3p序列在多物种间具有高度保守性;GO分析发现miR-199a-3p的靶基因参与细胞调节、代谢调节、细胞大分子生物合成等生物过程(P<0.01);KEGG Pathway分析发现miR-199a-3p的靶基因显著富集在上皮细胞的细菌入侵通路、ECM受体的相互作用通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、小细胞肺癌通路、癌症中的蛋白聚糖通路等;根据构建的TF-miR-199a-3p-靶基因网络调控图,挖掘出可能受miR-199a-3p调控的重要基因有MYC、SP1、mTOR、NFκB、NFκB1等。结论 miR-199a-3p可能通过直接靶向作用mTOR,调节PI3K-Akt-mTOR信号通路,从而参与膀胱癌的形成和发展。

miR-199a-3p对前列腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响

目的从miR-199a-3p在前列腺癌高、低转移潜能细胞中的表达差异出发,研究其在高转移前列腺癌细胞株1E8细胞运动转移中的作用及可能的分子机制。方法运用Realtime PCR法检测miR-199a-3p在前列腺癌高、低转移潜能配对细胞系中的表达差异。通过划痕实验及transwell实验观察1E8细胞及转染miR-199a-3p mimics及mimics NC后该细胞运动迁移能力的变化。结果 (1)RealtimePCR结果显示高转移潜能1E8细胞中miR-199a-3p表达水平明显低于低转移潜能2B4细胞。(2)上调miR-199a-3p会减弱1E8细胞的运动转移能力。结论 miR-199a-3p的上调可以抑制前列腺癌细胞的运动迁移能力。

MiR-199a-3p对大鼠肝细胞增殖的抑制作用

目的探讨miR-199a-3p对体外培养SD大鼠BRL-3A增殖的影响.方法人工合成miR-199a-3p模拟物、miR-199a-3p阻遏物及其各自阴性对照载体,分别转染BRL-3A肝细胞,转染后12 h、24 h、48 h和72h,应用定量PCR分析细胞中Cyclin D1和PCNA mRNA表达水平,免疫组化方法观测Cyclin D1和PCNA阳性细胞比率,流式细胞仪检测细胞各周期比例和CCK 8法检测细胞增殖.实验分4组:mimics组,mi-nc组,inhibitors组和in-nc组.结果转染后24 h、48 h、72 h,inhibitors组肝细胞Cyclin D1和PCNA mRNA表达水平较in-nc组显著增多(P<0.05),而mimics组肝细胞Cyclin D1和PCNA mRNA表达水平较mi-nc组显著降低(P<0.05).inhibitors组肝细胞Cyclin D1和PCNA阳性细胞比率均高于mi-nc组(P<0.05),而mimics组肝细胞Cyclin D1和PCNA阳性细胞比率均低于mi-nc组(P<0.05).inhibitorss组肝细胞G0/G1期细胞比例明显低于in-nc组(P<0.05),而mimics组肝细胞G0/G1期细胞比例明显高于mi-nc组(P<0.05).同时,inhibitors组肝细胞S期细胞比例明显低于mi-nc组(P<0.05)和in-nc组(P<0.05).inhibitors组肝细胞增殖能力明显高于in-nc组(P<0.05),mimics组肝细胞增殖能力明显低于mi-nc组(P<0.05).结论 miR-199a-3p能够延长大鼠BRL-3A肝细胞周期和抑制肝细胞增殖,其作用可能与抑制Cyclin D1和PCNA的表达有关.

LncRNA NORAD通过miR-199a-3p调控ZNF217对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响

背景与目的针对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的治疗和诊断仍然是医学界的难题,而探究NSCLC发生发展的分子机制是当前研究的热点。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)NORAD在多种癌细胞中高表达,可能是促进NSCLC发生的分子靶点。探讨LncRNA NORAD通过miR-199a-3p调控锌指蛋白217(zinc finger protein 217,ZNF217)对NSCLC细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响。方法实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测正常肺上皮细胞BEAS-2B、肺癌H460细胞和顺铂(Cisplatin,DDP)耐药细胞株H460/DDP细胞中NORAD、miR-199a-3p、ZNF217基因表达;将H460/DDP细胞分为control组、si-NC组、si-NORAD组、miR-NC组、miR-199a-3p mimic组、si-NORAD+inhibitor NC组、si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor组。检测细胞增殖、细胞凋亡情况,各组细胞NORAD、miR-199a-3p、ZNF217基因表达,Ki-67、caspase-9、ZNF217蛋白表达量;验证miR-199a-3p与NORAD和ZNF217的关系。结果与BEAS-2B细胞相比,H460和H460/DDP细胞中NORAD、ZNF217 mRNA表达显著升高(P<0.05),miR-199a-3p表达显著降低(P<0.05)。与H460细胞相比,H460/DDP细胞中NORAD、ZNF217 mRNA表达显著升高(P<0.05),miR-199a-3p表达显著降低(P<0.05)。与control组和si-NC组相比,si-NORAD组H460/DDP细胞增殖率、NORAD、ZNF217 mRNA表达、Ki-67、ZNF217蛋白表达显著降低(P<0.05),凋亡率、miR-199a-3p表达、caspase-9表达显著升高(P<0.05)。与miR-NC组相比,miR-199a-3p mimic组H460/DDP细胞增殖率、NORAD、ZNF217 mRNA表达、Ki-67、ZNF217蛋白表达显著降低(P<0.05),凋亡率、miR-199a-3p、caspase-9表达显著升高(P<0.05)。与si-NORAD+inhibitor NC组相比,si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor组H460/DDP细胞增殖率、ZNF217 mRNA表达、Ki-67、ZNF217蛋白表达显著升高,凋亡率、miR-199a-3p表达、caspase-9表达显著降低(P<0.05)。结论下调NORAD表达可增强miR-199a-3p表达并抑制ZNF217表达,进而抑制H460/DDP细胞增殖,促进其凋亡,增强其DDP化疗敏感性。

白杨素通过调控miR-199a-3p/ZHX1抑制食管鳞癌细胞增殖和侵袭

目的:探究白杨素(Chrysin,CR)对食管鳞癌细胞增殖和侵袭的影响及其潜在的分子机制。方法:将食管鳞癌细胞分为对照组(未转染、未CR处理细胞常规培养)、miR-NC组(稳定转染的miR-199a-3p-NC用等量DSMO培养)、miR mimic组(稳定转染的miR-199a-3p mimic用等量DSMO培养)、CR-miR-NC组(稳定转染的miR-199a-3p-NC用终浓度100μmol·L-1CR培养)、CR-miR mimic组(稳定转染的miR-199a-3p mimic用终浓度100μmol·L-1CR培养),48 h后,采用流式细胞仪检测转染效率,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EC9706细胞中miR-199a-3p和锌指和同源框蛋白1(Zinc-fingers and homeoboxes protein 1,ZHX1)表达情况,采用荧光素活性和蛋白免疫印迹(Western blot)检测miR-199a-3p对ZHX1的调控作用,分别采用MTT和transwell小室实验检测EC9706细胞增殖和侵袭能力。结果:流式细胞仪检测结果显示转染效率达到80%以上;CR-miR-NC组miR-199a-3p的表达水平显著低于miR-NC组(P<0.05);CR-miR mimic组miR-199a-3p的表达水平显著低于miR mimic组(P<0.05),CR-miR-NC组ZHX1的表达水平显著高于miR-NC组(P<0.05);CR-miR mimic组ZHX1的表达水平显著高于miR mimic组(P<0.05)。荧光素酶活性测定显示,在转染ZHX1 3’UTR的细胞中,与miR-199a-3p-NC组相比,miR-199a-3p mimic组荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而在转染ZHX13’UTR-Mut的细胞中,miR-199a-3p mimic组与miR-199a-3p-NC组的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05),CR-miR-NC组EC9706细胞增殖和侵袭能力显著低于miRNC组(P<0.05),CR-miR mimic组EC9706细胞增殖和侵袭能力显著低于miR mimic组(P<0.05)。结论:CR通过调控miR-199a-3p/ZHX1抑制食管鳞癌细胞增殖和侵袭,为食管鳞癌的靶向治疗提供一定的理论依据。

miR-199a-3p/Nme2在TGF-β1信号通路中的作用分析

通过microRNA芯片技术在小鼠GC-1 spg细胞中筛选发现microRNA-199a-3p(miR-199a-3p)受转化生长因子TGF-β1调节。为了进一步探讨二者的关系,通过基因克隆与载体构建技术、双荧光素酶报告基因检测及定量PCR实验,发现miR-199a-3p靶向识别肿瘤转移抑制基因2(Nme2)的3'非编码区(UTR)序列,且正向调控Nme2的表达。利用TGF-β1处理GC-1 spg细胞后,结果显示Nme2和miR-199a-3p在mRNA水平的表达均显著上调;进一步将miR-199a-3p和TGF-β1双重作用于GC-1 spg细胞后,结果表明Nme2的表达会明显增强,而且在TGF-β1通路中,miR-199a-3p被抑制的部分功能可能会被Nme2补偿。综上,miR-199a-3p对Nme2基因具有直接靶向识别和调控作用,且在参与TGF-β1信号通路的生物学效应中,二者在功能上相互关联。

LncRNA SNHG1通过吸附miR-199a-3p促进肾透明细胞癌细胞迁移和侵袭

目的探讨LncRNA SNHG1对肾透明细胞癌细胞侵袭及转移能力的影响,并探索潜在机制。方法利用划痕实验和Transwell实验检测SNHG1对肾透明细胞癌细胞迁移和侵袭能力的影响,利用双荧光素酶报告基因实验检测SNHG1是否可结合miR-199a-3p,利用实时荧光定量PCR检测SNHG1与miR-199a-3p表达的关系。结果抑制SNHG1的表达后,细胞迁移和侵袭能力均升高(P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验结果显示SNHG1能够吸附miR-199a-3p(P<0.01)。实时荧光定量PCR实验结果显示抑制SNHG1的表达可促进miR-199a-3p的表达(P<0.01)。结论 SNHG1可通过吸附miR-199a-3p促进肾透明细胞癌细胞迁移和侵袭。

miR-199a-3p在卵巢癌组织中的表达及其对癌细胞增殖转移的影响

目的探讨miR-199a-3p在卵巢癌组织中表达情况及其对癌细胞增殖转移能力的影响机制。方法培养四株卵巢癌细胞系SK-OV-3、OV-90、CAOV3、HO-8910S,采用RT-qPCR法检测四株卵巢癌细胞中miR-199a-3p的表达情况。选择miR-199a-3p表达较低的卵巢癌细胞,分为对照组、NC mimic转染组、miR-199a-3p mimic组。对照组不加任何试剂,miR-199a-3p mimic组、NC mimic转染组分别加入miR-199a-3p mimic和NC mimic转染试剂。采用MTT法、Transwell小室试验检测卵巢癌细胞的增殖及迁移能力。RT-qPCR检测过表达miR-199a-3p后卵巢癌细胞中smad1的表达情况,双荧光素酶试验观察miR-199a-3p对smad1的调控作用。结果miR-199a-3p在卵巢癌细胞株CaOV3及OV-90中的表达水平低于其他细胞(P均<0.05)。CaOV3及OV-90细胞过表达miR-199a-3p后,miR-199a-3p mimic组细胞增殖及迁移能力低于NC mimic组(P均<0.05)。miR-199a-3p mimic组细胞中smad1的表达低于NC mimic组(P<0.05)。miR-199a-3p互补结合smad1mRNA的3′UTR区;与wt-smad13′UTR+NC mimic组相比,wt-smad13′UTR+miR-199a-3p mimic组细胞的相对荧光素酶活性降低(P均<0.05)。结论过表达miR-199a-3p能够抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移能力,其机制可能与调节smad1的基因表达有关。

miR-199a-3p对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病模型小鼠肝脏脂肪变性的影响

目的研究miR-199a-3p对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型小鼠肝脏脂肪变性的影响。方法 40只雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养7 d,然后随机分成4组,正常对照组10只饲喂标准饲料(SCD),模型组10只饲喂高脂饮食(HFD),喂养8周后收集肝组织。另外,在2组饲喂HFD的小鼠(每组10只)通过尾静脉静脉注射腺病毒,使用腺病毒载体作为对照(Ad-Ctrl组)与表达miR-199a-3p(Ad-199a组)的腺病毒载体进行比较。2周后收集肝脏。进行油红O染色观察肝脏组织学病理改变;测量肝脏TG含量; PCR测量肝脏miRNA、FASN、SREBP1 mRNA的表达。结果在SCD组和HFD组小鼠肝脏中检测到6种下调miRNA。与SCD组小鼠相比,除miR-145-5p外,HFD组小鼠中检测到的miRNA均显著下调。同时,miR-199a-3p具有显著倍数变化(P <0. 001)。与Ad-Ctrl组相比,Ad-199a组肝脏质量显著减轻(P <0. 05); Ad-199a组肝脏质量/体质量值显著下降(P <0. 01); Ad-199a组肝脏TG含量明显降低(P <0. 01);油红O染色结果显示,SCD组、Ad-199a组未见明显的脂滴沉积;而HFD组及Ad-Ctrl组则见到大量大小不一的红色脂滴沉积。与Ad-Ctrl组相比,Ad-199a组肝脏内miR-199a-3p的表达量显著提高(P <0. 01);脂肪合成酶基因(FASN)显著减少(P <0. 001);固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)显著降低(P <0. 01)。结论 miRNA-199a-3p在肝脏中表达下调,在肝脏脂肪形成过程中有明显抑制作用,可以作为治疗NAFLD潜在治疗靶点,但其具体机制需进一步研究。

miR-199a-3p通过DDR调控Wnt/β-catenin通路抑制卵巢癌细胞侵袭转移

目的:探讨miR-199a-3p调控卵巢癌细胞侵袭转移及机制。方法:QPCR技术检测22例卵巢癌组织及20例卵巢正常组织中DDR2 mRNA表达水平。采用miR-199a-3p mimics转染人卵巢癌SKOV3细胞,QPCR技术检测DDR2 mRNA表达,Western blot法检测DDR2、Wnt/β-catenin相关通路信号分子表达。结果:DDR2在卵巢癌组织中表达明显升高。较SKOV3细胞组,miR-199a-3p mimics组中DDR2 mRNA表达水平降低,DDR2、β-catenin、c-myc、c-JUN表达水平明显下调。结论:miR-199a-3p可能通过下调DDR和Wnt/β-catenin通路抑制卵巢癌细胞体外侵袭转移。

IL-8通过下调miR-199a-3p对肾癌细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化的影响

目的研究IL-8、miR-199a-3p对肾癌细胞迁移、侵袭及上皮间质化的影响并探讨其作用机制。方法运用ELISA检测肾癌组织及癌旁正常组织中IL-8的表达;qRT-PCR检测肾癌组织及癌旁正常组织中miR-199a-3p的表达;将IL-8+miR-199a-3p组(转染miR-199a-3p mimics并与IL-8共处理)、IL-8+miR-con组(转染Negative control mimics并与IL-8共处理)均用脂质体法转染至786-0细胞,再用IL-8(100μg/L)处理;Transwell检测各组细胞的迁移、侵袭;Western blot检测各组细胞中Ecadherin、N-cadherin、p-Smad1的蛋白表达。结果与癌旁正常组织相比,肾癌组织中IL-8表达显著升高,miR-199a-3p表达显著降低(P<0.05),且IL-8可呈浓度依赖性抑制miR-199a-3p表达;过表达miR-199a-3p可明显抑制IL-8对786-0细胞迁移、侵袭的促进作用,且可抑制IL-8对786-0细胞中E-cadherin、N-cadherin、p-Smad1蛋白的表达。结论 IL-8可促进肾癌细胞的迁移侵袭及上皮-间质转化,其机制可能与下调miR-199a-3p有关,这将可为肾癌的高效治疗提供依据。

miR-199a-3p靶向CD151对甲状腺癌B-CPAP细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化的影响

目的探究miR-199a-3p过表达靶向CD151对甲状腺癌B-CPAP细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化的影响。方法通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-199a-3p和CD151的靶向关系。构建CD151pcDNA载体过表达CD151,将miR-199a-3p mimic与pcDNA-CD151单独或联合转染至B-CPAP细胞,将细胞随机分为4组:Control组、miR-199a-3p mimic组、pcDNA-CD151组和miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151组。BrdU染色检测细胞增殖水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;流式分选检测细胞周期分布;Transwell检测细胞侵袭能力;Western blot检测MMP-2、Ki-67、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达。结果CD151与miR-199a-3p存在靶向作用关系。与Control组比较,miR-199a-3p mimic组BrdU阳性细胞数降低,细胞凋亡率升高,G2/M、G1期比例降低,S期比例升高,侵袭细胞数降低,MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低;pcDNA-CD151组BrdU阳性细胞数升高,细胞凋亡率降低,G2/M、G1期比例升高,S期比例降低,侵袭细胞数升高,MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高。与pcDNACD151组比较,miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151组BrdU阳性细胞数降低,细胞凋亡率升高,G2/M、G1期比例降低,S期比例升高,侵袭细胞数降低,MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低(均P<0.01)。结论miR-199a-3p过表达靶向CD151抑制甲状腺癌B-CPAP细胞增殖、侵袭和上皮间质转化,并诱导细胞凋亡。

外泌体介导miR-199a-3p靶向ARPC2基因对肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨外泌体介导miR-199a-3p对肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法提取HK-2、786-O细胞培养液中的外泌体,电镜下观察外泌体形态;将miR-NC、miR-199a-3p转染至786-O细胞后用去除外泌体的DMEM培养液培养48 h,实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测外泌体中miR-199a-3p表达水平,Western印迹检测外泌体表面标志物CD63、CD81。将miR-NC、miR-199a-3p转染至786-O细胞中后加入外泌体进行培养,记为EXO-miR-NC组、EXO-miR-199a-3p组;将miR-199a-3p分别与pcDNA-NC、pcDNA-ARPC2共转染至786-O细胞中后加入外泌体进行培养,记为EXO-miR-199a-3p+pcDNA-NC组、EXO-miR-199a-3p+pcDNA-ARPC2组;将miR-NC、anti-miR-NC、miR-199a-3p、anti-miR-199a-3p、si-ARPC2、si-NC、分别转染至786-O细胞中,分别记为miR-NC组、anti-miR-NC组、miR-199a-3p组、anti-miR-199a-3p组、si-ARPC2组、si-NC组。qRT-PCR检测786-O细胞中miR-199a-3p表达水平;Western印迹检测786-O细胞中肌动蛋白相关蛋白2/3复合亚基(ARPC)2蛋白表达水平;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率;Transwell检测细胞迁移和侵袭;荧光素酶报告实验检测miR-199a-3p和ARPC2的靶向关系。结果HK-2和786-O细胞均有外泌体,miR-199a-3p在786-O细胞外泌体中低表达;过表达miR-199a-3p后786-O细胞外泌体中miR-199a-3p表达水平显著升高(P<0.05)。外泌体介导miR-199a-3p的肾癌细胞786-O细胞迁移数、存活率、侵袭数显著降低(P<0.05);敲减ARPC2肾癌细胞786-O细胞迁移数、存活率、侵袭数显著降低(P<0.05)。miR-199a-3p靶向调控ARPC2,高表达ARPC2部分逆转了外泌体介导的miR-199a-3p对786-O增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论外泌体介导的miR-199a-3p可抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与ARPC2有关。

食管鳞状细胞癌组织miR-199a-3p、AK4表达水平及临床意义

目的探讨食管鳞状细胞癌(ESCC)组织miR-199a-3p、腺苷酸激酶(AK4)的表达水平及临床意义。方法收集2016年1月至2018年6月本院“内镜粘膜下剥离术(ESD)”留存的ESCC组织标本72例及对应癌旁组织标本(距离ESCC组织5cm以上)72例,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测ESCC组织和癌旁组织中miR-199a-3p、AK4 mRNA的表达;免疫组织化学法检测ESCC组织中蛋白AK4的表达;对患者术后进行随访,随访时间为3年,记录患者总生存时间(OS);χ^(2)检验分析ESCC组织中miR-199a-3p、AK4的表达与患者临床病理特征间的关系;Spearman法分析ESCC组织中miR-199a-3p、AK4的相关性;Kaplan-Meier生存曲线分析miR-199a-3p、AK4与ESCC患者预后之间的关系。COX回归分析影响ESCC患者预后的危险因素。结果与癌旁组织比较,ESCC组织中miR-199a-3p表达显著降低,AK4 mRNA表达和蛋白表达阳性率显著升高(P<0.05);不同浸润深度ESCC组织miR-199a-3p、AK4表达差异具有统计学意义(P<0.05);ESCC组织中,miR-199a-3p与AK4表达呈负相关(r=-0.442,P<0.05);miR-199a-3p低表达组、AK4阳性表达组3年OS分别低于高表达组和阴性表达组;多因素COX回归分析结果表明miR-199a-3p低表达和AK4阳性表达是ESCC患者的独立预后因素(P<0.05)。结论miR-199a-3p、AK4可能与ESCC的发生发展和预后有关。

miR-199a-3p抑制卵巢癌SK0V3细胞增殖侵袭能力及其机制

目的探讨miR-199a-3p对卵巢癌SK0V3细胞增殖、侵袭能力的影响及其作用机制。方法以卵巢癌SK0V3细胞系为研究对象,将进入对数生长期的细胞按照生长情况分为miR-199a-3p过表达组、miR-199a-3p抑制组和对照组,观察miR-199a-3p过表达和抑制效率及其对卵巢癌SK0V3细胞增殖、侵袭及c-Met、MMP-2和CD44蛋白表达的影响。结果与对照组比较,miR-199a-3p过表达组SK0V3细胞中miR-199a-3p呈高表达状态,且SK0V3细胞与细胞克隆数量、侵袭细胞数量、c-Met及其下游蛋白MMP-2和CD44的表达水平均降低,而miR-199a-3p抑制组SK0V3细胞中miR-199a-3p表达下降,SK0V3细胞与细胞克隆数量、侵袭细胞数量、c-Met及其下游蛋白MMP-2和CD44的表达水平均显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-199a-3p可能通过抑制c-Met、MMP-2和CD44蛋白的表达进而影响卵巢癌SK0V3细胞的侵袭和迁移,可能成为治疗卵巢癌的新方法。

猪miR-199a-3p对mTOR基因表达的调控

通过生物信息学预测miR-199a-3p与mTOR-3′UTR的结合位点,人工合成猪mTOR-3′UTR及突变型片段克隆至双荧光素酶载体上,构建野生型(psiCHECK-2-W-mTOR-3′-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-mTOR-3′-UTR)双荧光素酶报告质粒。给PK-15细胞分别转染miR-199a-3p mimics、negative control和mTOR-3′-UTR野生型/突变型双荧光素酶报告载体,用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,分别采用RT-qPCR和Western blot检测mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含mTOR-3′-UTR的野生型和突变型双荧光素酶报告质粒与miR-199a-3p mimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P<0.05);转染miR-199a-3p mimics能显著下调mTOR基因mRNA和蛋白的表达(P<0.05),而转染miR-199a-3p Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,mTOR基因蛋白表达差异不显著(P>0.05)。成功构建了猪野生型及突变型mTOR-3′-UTR双荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶试验、RT-qPCR及Western blot证实miR-199a-3p与猪mTOR-3′-UTR存在靶向调控关系。

miR-199a-3p通过靶向CABLES-1调控流体剪切力介导的成骨细胞增殖

目的探讨miR-199a-3p在流体剪切力(fluid shear stress,FSS)诱导成骨细胞增殖中的作用及其可能的分子机制。方法对成骨细胞MC3T3-E1加载1.2 Pa FSS,时间分别为0、15、30、45、60、75、90 min。使用miR-199a-3p模拟物或miR-199a-3p抑制物转染MC3T3-E1细胞。使用将过表达的miR-199a-3p以及其阴性对照分别转染MC3T3-E1细胞,并以1.2 Pa FSS处理45 min。将pcDNA NC、pcDNA-CABLES-1、si RNA NC、si RNA CABLES-1转染至MC3T3-E1细胞中。分别共转染pc DNA-CABLES-1与miR-199a-3p mimic以及si RNA-CABLES-1与miR-199a-3p inhibitor。CCK-8实验检测细胞活性;RT-qPCR检测CABLES-1、miR-199a-3p、CDK 6、Cyclin D1、PCNA表达水平;荧光素酶报告实验检测CABLES-1和miR-199a-3p的靶向关系。免疫荧光检测CABLES-1蛋白表达。Western blot检测CABLES-1、CDK 6、PCNA、Cyclin D1的蛋白表达。结果FSS作用下MC3T3-E1细胞中的miR-199a-3p出现显著下调。过表达的miR-199a-3p抑制成骨细胞增殖,下调miR-199a-3p表达促进成骨细胞增殖。miR-199a-3p可以逆转FSS诱导的成骨细胞增殖。双荧光素酶实验表明,miR-199a-3p靶向作用于CABLES-1,过表达的miR-199a-3p可抑制CBALES-1蛋白表达。CABLES-1能够促进成骨细胞增殖。miR-199a-3p通过CABLES-1抑制FSS诱导的成骨细胞增殖。结论FSS诱导的成骨细胞增殖通过下调miR-199a-3p并通过靶向作用于CABLES-1实现。研究结果为FSS诱导成骨细胞增殖机制的研究提供新方向,也为未来机械刺激在骨关节疾病治疗中的临床应用研究提供新思路。