miR-216b通过靶向调控Beclin-1的表达抑制宫颈癌细胞自噬

目的研究miR-216b影响宫颈癌He La细胞自噬的作用机制。方法转染miR-216b及应用其抑制剂后,利用GFP-LC3 sh RNA转染等方法检测He La细胞的自噬水平,Western blot检测自噬相关基因Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达变化。结果 He La细胞转染miR-216b后,He La细胞中自噬相关基因Beclin-1受到抑制,LC3-Ⅱ的表达增加,细胞自噬受抑,而抑制mi R-216b的表达,自噬水平升高。进一步研究发现,miR-216b能够通过靶结合Beclin-1 3’UTR抑制Beclin-1表达从而抑制细胞自噬的发生。结论 miR-216b能够抑制宫颈癌He La细胞发生自噬,为宫颈癌的临床治疗提供了的理论基础。

miR-216b在体外培养细胞中加速长非编码RNA UCA1的降解

目的:探讨长非编码RNA(lncRNA)UCA1作为miR216b的"分子海绵"结合miR-216b后的命运变化。方法:提取人HEK293T细胞基因组,以特异性引物PCR扩增UCA1基因并克隆至pcDNA6.0b载体,用氨苄西林抗性筛选阳性克隆,重组质粒pcDNA6-UCA1转染HEK293T和HeLa细胞并鉴定其表达水平。向HEK293T和HeLa细胞转染miR-216b类似物,同时用放线菌素D抑制细胞转录,收取3个时间点的细胞总RNA并鉴定其完整性,反转录获得cDNA后,采用实时荧光定量PCR技术检测各时间点UCA1的水平,测定其半衰期。pcDNA6-UCA1转染细胞24h后,转染miR-216b类似物或miR-216b抑制剂,并使用放线菌素D抑制转录,收取3个时间点的细胞总RNA,qRTPCR检测UCA1半衰期。结果:构建的pcDNA6-UCA1过表达质粒转入HEK293T细胞后,qRT-PCR检测UCA1表达水平显著提高;miR-216b能够降低细胞内源或外源过表达的UCA1稳定性,加速UCA1的降解,显著缩短其半衰期;使用miR-216b的抑制剂,UCA1的半衰期延长。结论:miR-216b能够加速lncRNA-UCA1的降解,为研究miRNA与lncRNA的相互作用提供了新的思路。

miR-216b在急性髓系白血病中的表达及意义

目的探讨微小RNA-216b(microRNA-216b,miR-216b)在急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia,AML)中的表达及意义。方法急性髓细胞白血病患者53例作为AML组,同期31例原发性免疫性血小板减少症(Primary immune thrombocytopenia,ITP)患者作为对照组。提取骨髓单个核细胞,检测miR-216b的表达水平,分析其与临床特征的关系。结果 AML组miR-216b相对中位表达水平高于对照组,差异有统计学意义( P <0.05);SML患者不同FAB分型、染色体核型和基因突变类型miR-216b表达水平比较差异无统计学意义( P >0.05);根据miR-216b相对中位表达水平,以0.345作为分界,将53例 AML患者分为高表达和低表达组;高表达组和低表达组在性别、年龄、血红蛋白、血小板计数和完全缓解率差异无统计学意义( P >0.05);高表达组WBC计数、白细胞计数和骨髓原始细胞比例低于低表达组,1年内完全缓解后复发率和1年死亡率均高于低表达组,差异均有统计学意义( P <0.05)。结论miR-216b在AML患者中表达水平高于对照组,与疾病复发和生存有一定的关联。

miR-216b-5p靶向调控BTN3A2促进胶质瘤细胞LN-229的迁移及侵袭能力

大量证据表明microRNA(miRNA)通过靶向调控靶基因的表达从而在肿瘤侵袭与转移中发挥重要作用。然而关于microRNA-216b-5p (miR-216b-5p)通过靶向嗜乳脂蛋白第3亚家族膜蛋白A2(butyrophilin subfamily 3 member A2,BTN3A2)促进胶质瘤侵袭与转移的机制尚不明确。本研究通过GSE15824与GSE4290差异表达分析筛选出同时在2个芯片中表达上调的BTN3A2(P<0.05)。生存曲线结果显示,高表达BTN3A2病人总生存期明显下降(P<0.001)。表达量分析结果显示,BTN3A2表达随WHO分级升高而升高(P<0.05),同时1p/19q未联合缺失与IDH突变型病人BTN3A2表达升高(P<0.001)。基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)结果显示,BTN3A2与众多癌症相关通路有关(P<0.05);Western印迹结果显示,BTN3A2在7例胶质瘤组织和胶质瘤细胞系U87、U251和LN-229中表达上调,过表达miR-216b-5p(miR-216b-5p mimics)后BTN3A2蛋白表达水平降低;Transwell结果显示,转染BTN3A2干扰质粒(si-BTN3A2)和miR-216b-5p mimics后可以抑制LN-229细胞体外迁移与侵袭能力(P<0.05);在线预测网站证实,miR-216b-5p为BTN3A2潜在靶基因;生存曲线结果显示,与低表达miR-216b-5p病人相比,高表达病人生存率明显上调(P=0.025);荧光定量RT-PCR结果显示,miR-216b-5p在胶质瘤U87、U251和LN-229细胞中表达下降(P<0.05);双荧光素酶结果显示,BTN3A2存在与miR-216b-5p的结合靶点(P<0.05);综上所述,BTN3A2可能通过结合miR-216b-5p促进胶质瘤细胞LN-229的迁移以及侵袭。

MiR-181a和MiR-216b在冠心病患者外周血单个核细胞中表达及意义

目的探究miR-181a和miR-216b在冠心病(CHD)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及意义。方法实时定量PCR检测125例CHD患者(观察组)和50例体检健康者(对照组)PBMC中miR-181a和miR-216b的表达水平。向CHD患者PBMC中分别转染miR-181a(miR-181a组)、miR-216b(miR-216b组)和对照质粒(NC组)。利用实时定量PCR检测各组细胞miR-181a和miR-216b的表达水平,采用MTT法检测各组细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡、划痕实验检测细胞迁移。结果观察组患者PBMC中miR-181a和miR-216b的表达水平均明显低于对照组(P<0.05)。转染后,miR-181a组PBMC中miR-181a表达水平和miR-216b组miR-216b表达水平均分别高于NC组(P<0.05)。随着孵育时间延长,miR-181a组和miR-216b组细胞增殖率无明显变化,凋亡率明显增加(P<0.05);NC组细胞增殖率明显增加(P<0.05),凋亡率无明显变化。孵育相同时间时,miR-181a组和miR-216b组细胞增殖率和划痕愈合率明显低于NC组(P<0.05),细胞凋亡率明显高于NC组(P<0.05)。结论miR-181a和miR-216b在CHD患者PBMC中低表达,提升miR-181a和miR-216b的表达量可明显抑制PBMC增殖和迁移,诱导其发生凋亡。

miR-216b-5p在卵巢癌细胞系A2780中的表达及对增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨miR-216b-5p在卵巢癌细胞系A2780中的表达情况,及其对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR),检测miR-216b-5p在正常卵巢上皮细胞系IOSE-80和卵巢癌细胞系A2780中的表达情况。在A2780中过表达及抑制miR-216b-5p后,采用CCK-8实验、划痕实验及Transwell侵袭实验检测卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化。结果miR-216b-5p在卵巢癌细胞系A2780中的表达低于正常卵巢细胞系IOSE-80(P<0.01)。CCK-8实验证实,过表达miR-216b-5p能抑制A2780细胞的增殖活性(P<0.001),抑制miR-216b-5p则能有效促进A2780细胞的增殖活性(P<0.01);划痕实验及Transwell侵袭实验证实过表达miR-216b-5p后,A2780细胞的迁移、侵袭能力受到明显抑制(P<0.01,P<0.001),而抑制miR-216b-5p促进A2780细胞迁移侵袭能力(P<0.05)。结论miR-216b-5p能抑制卵巢癌细胞系A2780的增殖、迁移及侵袭能力,miR-216b-5p可能在卵巢癌中发挥着潜在的抑癌作用。

miR-216b-5p靶向ATG5介导自噬逆转食管癌Eca109细胞的顺铂耐药性

目的:探讨miR-216b-5p对食管癌Eca109细胞顺铂(DDP)耐药性的影响及其作用机制。方法:采用qPCR法检测miR-216b-5p在食管癌细胞TE-1、KYSE-150、Eca109和耐药细胞Eca109/DDP中的表达水平。利用脂质体转染技术分别将miR-216b-5p mimic及mimic NC、自噬相关蛋白5(ATG5)过表达质粒转染到Eca109/DDP细胞中,用CCK-8、EdU法和FCM分别检测转染后细胞的增殖和凋亡;mRFP-eGFP-LC3双荧光标记实验检测mRFP-eGFP-LC3慢病毒感染后各组细胞自噬发生情况,WB法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1和P62表达。用荧光素酶报告基因实验验证miR-216b-5p与ATG5的靶向关系,WB法检测ATG5的表达。建立裸鼠Eca109/DDP细胞移植瘤模型,观察miR-216b-5p过表达对移植瘤生长的影响。结果:miR-216b-5p在TE-1、KYSE-150、Eca109和Eca109/DDP细胞中均呈低表达(均P<0.05)。过表达miR-216b-5p可显著抑制Eca109/DDP细胞的增殖并诱导凋亡(均P<0.05),减少细胞中自噬小体数量(P<0.05),下调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin 1蛋白水平、上调P62蛋白水平(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实miR-216b-5p靶向并负调控ATG5的表达(P<0.05),过表达ATG5可使miR-216b-5p mimic对Eca109/DDP细胞增殖、自噬的抑制作用和凋亡的诱导作用明显减弱(均P<0.05),自噬相关蛋白P62表达降低、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin 1表达升高(均P<0.05)。荷瘤实验结果表明,miR-216b-5p过表达可显著抑制裸鼠移植瘤的生长(P<0.05)。结论:miR-216b-5p过表达可逆转食管癌Eca109/DDP细胞对DDP的耐药性,其机制可能与靶向负调控ATG5表达并影响细胞自噬有关。

miR-216b-5p通过靶向NCOA3促进胶质母细胞瘤细胞铁死亡

目的主要探讨miR-216b-5p通过靶向NCOA3对胶质瘤细胞铁死亡的影响,以期为胶质母细胞瘤的临床治疗提供新的靶点。方法U251细胞分为DMSO处理组,Erastin处理组,Erastin+mimic NC组,Erastin+miR-216b-5p mimic组,Erastin+pcDNA 3.1组,Erastin+pcDNA-NCOA3组,pcDNA+miR-216b-5p mimic+pcDNA-NCOA3组。通过实时荧光定量PCR检测和Western blot检测miR-216b-5p和NCOA3的表达以及铁死亡相关蛋白PTGS2,NOX1,ACSL4,GPX4,FTH1的蛋白表达量,CCK-8和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡,通过试剂盒检测MDA,亚铁(Fe2+),谷氨酰胺,谷氨酸,α-酮戊二酸的含量。结果(1)miR-216b-5p在人胶质母细胞瘤细胞株LN229和U251中均高表达,Erastin刺激下的U25细胞活力回升且细胞凋亡率下降;(2)转染miR-216b-5p mimics后,Erastin刺激下的U251中的MDA,亚铁(Fe2+),谷氨酰胺,谷氨酸,α-酮戊二酸均有明显下降,铁死亡相关蛋白PTGS2,NOX1,ACSL4的蛋白表达量在Erastin的刺激下明显上升,而GPX4,FTH1的蛋白量明显下降;(3)获得9个在胶质母细胞瘤中与铁死亡相关,且与miR-261b-5p有直接靶向关系的基因,即FOXO4,NCOA3,PARP8,PARP11,LIG3,MAPK9,TLR4,RB1,PTEN,miR-216b-5p与NCOA3直接结合向并负向调控NCOA3;4.转染NCOA3使细胞活力下降,MDA,亚铁(Fe2+),谷氨酰胺,谷氨酸,α-酮戊二酸含量上升,铁死亡相关蛋白PTGS2,NOX1,ACSL4的蛋白表达量上升,而GPX4,FTH1的蛋白量下降;但miR-216b-5p mimic的转染可逆转以上结果。结论miR-216b-5p直接靶向NCOA3,且通过NCOA3调控胶质母细胞瘤细胞的铁死亡,以此促进肿瘤的凋亡。对胶质母细胞瘤的新的治疗靶点以及后续研究提出了新的可能性,以期为胶质母细胞瘤的治疗提供新思路。

MiR-216b通过靶向ABCG1促进破骨细胞形成并减少胆固醇流出

目的研究miR-216b在破骨细胞分化中的功能和靶基因,探讨其对破骨细胞胆固醇外流的影响。方法建立RANKL刺激诱导RAW 264.7破骨细胞前体细胞分化的细胞模型。进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色测定以评估破骨细胞分化。通过生物信息学分析和双荧光素酶报告基因预测和分析miR-216b与其靶基因ABCG13’非翻译区(3’UTR)的结合以及自由能。转染miR-216b模拟物或抑制剂以验证miR-216b在破骨细胞分化中的作用。液体闪烁计数用于测量来自RAW264.7巨噬细胞衍生的破骨细胞[;H]标记的胆固醇流出。通过高效液相色谱(HPLC)检测RAW 264.7巨噬细胞中的脂质积累。实时定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹分析用于评估破骨细胞中ABCG1的转录和转录后水平。结果当细胞用miR-216b模拟物转染时,破骨细胞的数量、破骨细胞的平均直径和融合指数显著增加,如抗酒石酸酸性磷酸酶阳性染色和显微镜测定所揭示。MiR-216b抑制剂显示出完全相反的结果,这为我们的发现提供了额外的证据。生物信息学分析和双荧光素酶报告基因检测表明,miR-216b靶向ABCG1的3’UTR。进一步研究表明,miR-216b抑制破骨细胞中ABCG1的mRNA和蛋白质水平。此外,我们还发现ABCG1 siRNA对ABCG1的沉默增加了破骨细胞的数量、破骨细胞的平均直径和融合指数。MiR-216b通过抑制ABCG1表达减少破骨细胞的胆固醇流出。结论总的来说,这些研究表明miR-216b下调ABCG1表达并抑制破骨细胞胆固醇流出,从而扰乱胆固醇稳态并促进破骨细胞生成。

lncRNA RPL22P1-201通过调控miR-216b-5p表达影响前列腺癌细胞增殖、细胞周期和多西紫杉醇的敏感性

目的:探究长链非编码RNA(lncRNA)RPL22P1-201通过介导miR-216b-5p表达对前列腺癌细胞增殖、细胞周期以及多西紫杉醇敏感性的作用机制。方法:基于Cancer LncRNA Census数据库分析前列腺癌组织和正常组织中RPL22P1-201的表达差异。实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测前列腺癌细胞株(DU-145、C4-2B、PC3、22Rv1、LNCaP)和正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)中RPL22P1-201表达水平。将PC3细胞分为si-RPL22P1-201组(转染RPL22P1-201干扰序列)和si-NC组(转染si-NC序列),集落形成实验检测PC3细胞增殖能力,流式细胞术检测PC3细胞周期,CCK-8法检测多西紫杉醇处理后各组PC3细胞的增殖情况,双荧光素酶报告基因实验验证RPL22P1-201与靶基因的结合,qRT-PCR检测miR-216b-5p表达水平,Western印迹检测TrkB、CDK4、cyclin D2、cyclin D3、CDK6蛋白表达水平。结果:前列腺癌组织中RPL22P1-201表达水平高于正常组织(P<0.01),前列腺癌细胞株中RPL22P1-201表达水平高于正常前列腺上皮细胞(P<0.01),si-NC组和si-RPL22P1-201组集落数量分别为(256.1±28.79)个和(78.77±14.52)个,差异有统计学意义(P<0.01)。si-NC组和si-RPL22P1-201组G0/G1细胞率分别为(43.18±4.56)%和(68.85±3.40)%,S细胞率分别为(36.84±2.28)%和(24.27±2.74)%,G2/M细胞率分别为(19.98±2.69)%和(6.88±1.57)%,差异均有统计学意义(均P<0.05)。si-RPL22P1-201组在多西紫杉醇作用下的细胞存活率均低于si-NC组(均P<0.05),RPL22P1-201能够与miR-216b-5p配对结合(P<0.01)。相比si-NC组,si-RPL22P1-201组PC3细胞中miR-216b-5p表达降低(P<0.01),TrkB、CDK4、cyclin D2、cyclin D3、CDK6蛋白表达均降低。结论:RPL22P1-201在前列腺癌中高表达,沉默RPL22P1-201通过升高miR-216b-5p表达抑制前列腺癌PC3细胞增殖和细胞周期,并增强PC3细胞对多西紫杉醇的敏感性。

miR-216b-5p对喉癌TU686细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制

目的:探讨miR-216b-5p对喉鳞状细胞癌(LSCC)TU686细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,分析其在喉癌细胞中的靶基因及其可能的作用机制。方法:TU686细胞分为对照组和miR-216b-5p组,对照组细胞通过慢病毒感染无义序列,miR-216b-5p组细胞通过慢病毒感染过表达miR-216b-5p。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组细胞中miR-216b-5p表达水平,克隆形成实验检测2组细胞克隆形成率,细胞划痕实验检测2组细胞划痕愈合率,Transwell实验检测2组细胞中侵袭细胞数,流式细胞术检测2组细胞凋亡率。通过TargetScan网站预测miR-216b-5p的潜在靶基因,采用RT-qPCR法检测靶基因mRNA表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测miR-216b-5p与靶基因间的靶向关系。结果:慢病毒感染后,与对照组比较,miR-216b-5p组细胞中miR-216b-5p表达水平明显升高(P<0.01)。与对照组比较,miR-216b-5p组细胞克隆形成率和划痕愈合率明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。TargetScan网站预测,自噬相关基因5(ATG5)为miR-216b-5p潜在的靶基因,与对照组比较,miR-216b-5p组细胞中ATG5 mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验证实ATG5与miR-216b-5p之间存在靶向关系。结论:miR-216b-5p通过抑制喉癌细胞的增殖、迁移、侵袭和诱导细胞凋亡进而发挥抑癌作用,其机制可能与靶向调节ATG5的表达水平有关。

FOXD1、miR-216b-5p在子宫内膜异位症患者子宫内膜组织中的表达及其临床意义

目的探讨叉头框D1(FOXD1)、miR-216b-5p在子宫内膜异位症(EMs)患者子宫内膜组织中的表达及其临床意义。方法选取2018年1月至2021年6月在我院就诊的188例EMs患者作为研究组,分别取EMs患者异位子宫内膜组织(异位组)以及在位子宫内膜组织(在位组),另选取在我院因子宫肌瘤进行手术的患者185例,取正常子宫内膜组织(对照组)。采用免疫组化法检测组织中FOXD1蛋白的表达情况;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织中FOXD1 mRNA、miR-216b-5p表达水平,并分析FOXD1 mRNA、miR-216b-5p的关系;使用ROC曲线分析FOXD1 mRNA、miR-216b-5p对EMs的诊断价值;多因素Logistic回归分析影响EMs发生的危险因素。结果(1)研究组在位和异位子宫内膜组织中FOXD1蛋白表达阳性率及mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05),miR-216b-5p表达水平显著低于对照组(P<0.05);异位子宫内膜组织中FOXD1蛋白表达阳性率及mRNA表达水平显著高于在位子宫内膜组织(P<0.05),miR-216b-5p表达水平显著低于在位组(P<0.05)。(2)Pearson相关性分析结果显示,EMs患者异位子宫内膜组织中FOXD1 mRNA与miR-216b-5p表达呈负相关(r=-0.369,P<0.05)。(3)ROC曲线分析结果表明,与FOXD1 mRNA单独检测相比,二者联合诊断EMs的AUC更高(Z=3.359,P=0.001);与miR-216b-5p单独检测相比,二者联合诊断EMs的AUC无显著差异(Z=0.597,P=0.551)。(4)多因素Logistic回归分析显示,FOXD1 mRNA高水平、miR-216b-5p低水平是影响EMs发生的危险因素(P<0.05)。结论FOXD1、miR-216b-5p在EMs子宫内膜组织中表达异常,可能作为EMs诊断的辅助指标。

宫颈癌组织中miR-216b与FOXM1表达及与临床病理特征的关系

目的 研究宫颈癌组织中微小RNA(mi R)-216b与叉头框蛋白M1(FoxM1)表达及其与临床病理特征的关系。方法 选取2016年3月~2019年3月华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院诊治的宫颈癌患者84例作为病例组,同期选择宫颈上皮内瘤变(CIN)患者40例作为CIN组,子宫良性病变患者40例作为对照组。采用实时荧光定量PCR检测各组mi R-216b及FoxM1表达水平,比较其与临床病理特征的关系及相关性分析。结果 病例组mi R-126b表达水平显著低于CIN组及对照组,FOXM1表达水平显著高于CIN组及对照组,差异均有统计学意义(均P <0.05)。mi R-126b及FOXM1的表达与FIGO分期、肿瘤分化程度及浸润深度有关,而与年龄、病理类型、有无淋巴结转移及是否存在人乳头状瘤病毒(HPV)16/18感染无关。mi R-126b水平与FOXM1水平呈负相关(r=-0.694,P=0.001)。结论 宫颈癌组织中mi R-126b及FOXM1均异常表达,两者共同参与宫颈癌的发生发展过程,有可能成为宫颈癌诊断、治疗及预后评估的新肿瘤标志物。

血清miR-378和miR-216b对早期非小细胞肺癌的诊断价值

非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的常见类型,每年死亡人数不断增加,晚期生存率较低[1]。尽管在手术、放疗、化疗和特定靶向治疗方面取得了进展,但由于诊断发现晚,导致其预后仍不理想,进而出现癌细胞的转移[2]。大量的基因组学研究将肺癌与抑癌、致癌基因的表达、染色体畸变、氧化应激等因素相联系,这些因素影响了包括细胞生长、分裂、增殖、存活、运动、侵袭和细胞内追踪等多种细胞功能[3]。

miR-216b对顺铂耐药胃癌细胞生物学行为的影响

目的探讨miR-216b对顺铂耐药的胃癌细胞增殖和凋亡的作用及可能机制。方法采用实时荧光定量PCR法检测人胃黏膜细胞系GES-1、人胃癌细胞系SGC7901和胃癌顺铂耐药细胞系SGC7901/DDP的miR-216b相对表达量,采用Western blot法检测3种细胞ATG5蛋白相对表达量。SGC7901/DDP细胞加入不同浓度顺铂,采用CCK-8实验检测顺铂对细胞的半数抑制浓度,确定顺铂在后续实验中浓度。对数生长期SGC7901/DDP细胞随机分为空白对照组(正常培养)、agomir-NC组(转染agomir-NC)、agomir-miR-216b组(转染agomic-miR-216b)、antagomir-NC组(转染antagomir-NC)和antagomir-miR-216b组(转染antagomir-miR-216b),采用实时荧光定量PCR法检测5组细胞miR-216b相对表达量,采用Western blot法检测5组细胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、ATG5、P62蛋白相对表达量,采用CCK-8实验检测5组细胞活力,采用克隆形成实验检测5组细胞克隆细胞数,采用流式细胞术检测5组细胞凋亡率。采用荧光素酶报告实验检测miR-216b与ATG5的靶向结合。对数生长期SGC7901/DDP细胞随机分为agomir-NC+oe-NC组(转染agomir-NC和oe-NC)、agomir-MiR-216b+oe-NC组(转染agomir-miR-216b和oe-NC)和agomir-miR-216b+oe-ATG5组(转染agomir-miR-216b和oe-ATG5),采用实时荧光定量PCR法检测miR-216b相对表达量,采用Western blot法检测细胞ATG5蛋白相对表达量。结果SGC7901/DDP细胞miR-216b相对表达量(0.26±0.04)低于SGC7901细胞(0.49±0.06)和GES-1细胞(1.00±0.05)(P<0.05),SGC7901细胞低于GES-1细胞(P<0.05);SGC7901/DDP细胞ATG5相对表达量(0.76±0.03)高于SGC7901细胞(0.47±0.03)和GES-1细胞(0.18±0.02)(P<0.05),SGC7901细胞高于GES-1细胞(P<0.05);顺铂对SGC7901/DDP细胞的半数抑制浓度为7.998μmol/L,顺铂在后续实验中使用浓度为8μmol/L;agomir-miR-216b组细胞miR-216b相对表达量(2.43±0.14)、细胞凋亡率[(28.37±1.61)%]和P62蛋白相对表达量(0.43±0.02)高于agomir-NC组[1.02±0.05、(14.34±0.97)%、0.23±0.03](P<0.05),细胞活力[(25.20±2.75)%]、克隆细胞数[(49.33±5.51)个]、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(0.22±0.02)和ATG5蛋白相对表达量(0.17±0.01)低于agomir-NC组[(51.39±3.05)%、(119.33±4.51)个、0.38±0.02、0.33±0.02](P<0.05);antagomir-miR-216b组细胞miR-216b相对表达量(0.33±0.02)、细胞凋亡率[(8.77±1.12)%]和P62蛋白相对表达量(0.12±0.02)低于antagomir-NC组[0.99±0.05、(14.40±1.06)%、0.22±0.01](P<0.05),细胞活力[(77.34±3.97)%]、克隆细胞数[(166.67±6.51)个]、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(1.84±0.07)和ATG5蛋白相对表达量(0.83±0.04)高于antagomir-NC组[(49.25±4.00)%、(116.00±4.58)个、0.36±0.02、0.34±0.02](P<0.05);空白对照组、agomir-NC组、antagomir-NC组组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。miR-216b靶向调控ATG5。agomir-miR-216b+oe-NC组和agomir-miR-216b+oe-ATG5组细胞miR-216b相对表达量高于agomir-NC+oe-NC组(P<0.05),agomir-miR-216b+oe-NC组与agomir-miR-216b+oe-ATG5组比较差异无统计学意义(P>0.05);agomir-miR-216b+oe-NC组细胞ATG5蛋白相对表达量低于agomir-NC+oe-NC组和agomir-miR-216b+oe-ATG5组(P<0.05),agomir-miR-216b+oe-ATG5组低于agomir-NC+oe-NC组(P<0.05)。结论miR-216b可能通过靶向ATG5抑制自噬,促进细胞凋亡并抑制增殖,增加胃癌细胞对顺铂的敏感性。

miR-216b通过FGFR1调节肾透明细胞癌细胞增殖和侵袭研究

目的探讨miR-216b在肾透明细胞癌细胞增殖和侵袭中的作用及机制。方法培养肾透明细胞癌细胞株(769-P、Caki-1和786-O)和正常人胚肾细胞(293T)。qRT-PCR检测miR-216b在肾透明细胞癌细胞中的表达;对769-P和786-O进行mimic NC和miR-216bmimic转染,CCK-8和Transwell小室实验检测miR-216b上调对Caki-1细胞增殖和侵袭的影响;Western blot检测肾透明细胞癌细胞中FGFR1蛋白的表达;双荧光素酶报告实验和Western blot验证miR-216b对FGFR1的调控关系;在miR-216b上调的Caki-1细胞中过表达FGFR1,CCK-8和Transwell小室实验检测miR-216b是否通过FGFR1调节Caki-1细胞增殖和侵袭。结果与293T相比,miR-216b在肾透明细胞癌细胞中的表达明显下调(P<0.01);miR-216b上调明显抑制肾透明细胞癌细胞增殖和侵袭(P<0.01);与293T相比,FGFR1在肾透明细胞癌细胞中的蛋白表达明显上调;荧光素酶报告实验和Western blot结果表明miR-216b直接靶向FGFR1 3′UTR并抑制其表达;上调FGFR1的表达可以逆转miR-216b对Caki-1细胞增殖和侵袭的抑制作用。结论 miR-216b可以通过FGFR1抑制肾透明细胞癌细胞的增殖和侵袭,在肾透明细胞癌中发挥抑癌基因功能。

circEPSTI1通过靶向调控miR-216b-5p调节胃癌细胞顺铂耐药性

该研究的目的是为了观察circEPSTI1是否通过靶向调控miR-216b-5p对胃癌细胞顺铂耐药性产生影响,并探讨其可能的作用机制。采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测胃癌组织、癌旁组织、人胃黏膜细胞GES-1、人胃癌细胞HGC27与胃癌耐药性细胞HGC27/DDP中circEPSTI1与miR-216b-5p的表达情况;使用双荧光素酶报告实验验证circEPSTI1与miR-216b-5p的靶向调控关系;以HGC27/DDP细胞为研究对象,实验分组:si-NC组、si-circEPSTI1组、si-circEPSTI1+anti-miR-NC组、si-circEPSTI1+anti-miR-216b-5p组;采用CCK-8法、平板克隆形成实验、流式细胞术与Transwell实验分别检测细胞增殖、克隆形成、凋亡、迁移及侵袭;Western blot检测Cleavea-caspase 3、Cleavea-caspase 9、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达情况。结果显示,与癌旁组织相比,胃癌组织中的circEPSTI1表达上调(P<0.05), miR-216b-5p表达下调(P<0.05);与GES-1细胞相比,HGC27细胞、HGC27/DDP细胞的circEPSTI1表达上调(P<0.05), miR-216b-5p表达下调(P<0.05);与HGC27细胞相比, HGC27/DDP细胞的circEPSTI1表达上调(P<0.05), miR-216b-5p表达下调(P<0.05);miR-216b-5p过表达可降低wt-circEPSTI1的荧光素酶活性(P<0.05),未影响mut-circEPSTI1的荧光素酶活性;与si-NC组相比, si-circEPSTI1组细胞增殖抑制率、凋亡率和Cleavea-caspase 3、Cleavea-caspase 9、E-cadherin蛋白表达上调(P<0.05),克隆形成数、迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05), N-cadherin蛋白表达下调(P<0.05);与si-circEPSTI1+antimiR-NC组相比, si-circEPSTI1+anti-miR-216b-5p组细胞增殖抑制率、凋亡率和Cleavea-caspase 3、Cleavea-caspase 9、E-cadherin蛋白表达下调(P<0.05),克隆形成数、迁移及侵袭细胞数增加(P<0.05),N-cadherin蛋白表达上调(P<0.05)。结果表明, circEPSTI1通过靶向抑制miR-216b-5p表达促进胃癌耐药性细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭,抑制胃癌耐药性细胞凋亡,从而增强胃癌细胞对DDP的耐药性,该机制可能与改变凋亡相关蛋白表达情况和逆转上皮–间质转化过程有关。

MicroRNA-216b靶向DCLK1调控卵巢癌HO-8910细胞的增殖迁移和侵袭

目的:探讨MicroRNA-216b(miR-216b)对卵巢癌HO-8910细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:收集30例卵巢癌患者癌组织和癌旁组织,采用qPCR检测癌组织和癌旁组织miR-216b的表达。采用HO-8910细胞为对照组,转染空载质粒HO-8910细胞为阴性对照组,转染miR-216b mimic的HO-8910细胞为过表达组,转染miR-216b inhibitor HO-8910细胞为低表达组。采用CCK8法、划痕实验、平板克隆、Transwell检测各组细胞增殖、迁移和侵袭能力,采用Western blot和qPCR检测各组细胞双皮质素样激酶1(Doublecortinlike kinase 1,DCLK1)蛋白和mRNA的表达情况。结果:卵巢癌患者癌组织中miR-216b的表达量明显低于癌旁组织(P<0.05);CCK8法、划痕实验、Transwell结果显示,相对于对照组和阴性对照组,miR-216b mimic组细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低(P<0.05),miR-216b inhibitor组显著增加(P<0.05);Western和qPCR结果显示,与对照组和阴性对照组,miR-216b mimic组细胞DCLK1蛋白和mRNA表达水平显著降低(P<0.05),miR-216b inhibitor组显著增加(P<0.05)。结论:miR-216b具有靶向DCLK1,进而抑制卵巢癌HO-8910细胞增殖、迁移和侵袭的作用。miR-216b可能卵巢癌诊断治疗的新靶点。

微小RNA-216b-5p对骨肉瘤MG63细胞功能的影响及其与高迁移率族蛋白B1的靶向关系

目的探讨微小RNA-216b-5p(miR-216b-5p)对骨肉瘤MG63细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的靶向关系。方法将体外培养的MG63细胞分为mimics-NC组、miR-216b-5p mimics组、inhibitor-NC组和miR-216b-5p inhibitor组,采用实时荧光定量PCR检测miR-216b-5p的表达,MTT法、Transwell小室和流式细胞仪分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡能力。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-216b-5p和HMGB1的靶向关系,蛋白质印迹法(Western blotting)检测HMGB1蛋白的表达。结果与mimics-NC组相比,miR-216b-5p mimics组细胞中miR-216b-5p的表达水平[(5.36±0.54)比(1.00±0.11)]和细胞凋亡率[(20.36±3.15)%比(8.58±1.22)%]明显升高,而细胞增殖活力、侵袭能力和细胞中HMGB1蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05);miR-216b-5p inhibitor组细胞中miR-216b-5p的表达水平[(0.24±0.03)比(0.96±0.08)]和细胞凋亡率[(2.05±0.38)比(9.27±1.16)]较inhibitor-NC组明显降低,而细胞增殖活力、侵袭能力和HMGB1蛋白的表达水平较inhibitor-NC组均明显升高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实HMGB1是miR-216b-5p的靶基因。结论miR-216b-5p可能通过靶向调控HMGB1表达,抑制骨肉瘤MG63细胞增殖、侵袭并诱导细胞凋亡。

miR一216b通过靶向调控蛋白激酶Cα基因的表达抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭

目的明确miR-216b是否通过靶向调控蛋白激酶Cα（PKCα）基因的表达来抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭。方法构建PKCα3’非编码区（UTR）-荧光素酶报告载体，通过荧光素酶报告系统检测miR-216b对PKCα3’UTR-荧光素酶活性的影响。将miR-216b模拟物转染鼻咽癌细胞CNE2，采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测PKCα mRNA和蛋白的表达水平。将PKCα siRNA转染CNE2细胞，通过MTS细胞增殖实验和Transwell侵袭实验观察PKCα基因表达下调对CNE2细胞增殖和侵袭的影响。将PKCα重组质粒与miR-216b模拟物共转染CNE2细胞，通过MTS细胞增殖实验检测CNE2细胞的增殖能力。结果双荧光素酶报告检测结果显示，miR-216b能特异性地与PKCα mRNA的3’UTR结合，下调荧光素酶活性，其活性约为转染对照模拟物细胞的62．4％。过表达miR-216b的CNE2细胞中PKCα mRNA和蛋白的表达水平均降低，与对照细胞比较，分别降低49．1％和55．7％。siRNA干扰PKCα表达能抑制CNE2细胞的增殖和侵袭能力，能部分模拟miR-216b的抑瘤功能。过表达PKCα能部分逆转miR-216b对CNE2细胞的增殖抑制作用。结论miR-216b通过靶向调控PKCα基因的表达来抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭。