MiR-302/367在体细胞向多能性干细胞重编程中的作用

MicroRNA-302／367（miR-302／367）发现于2003年，是一类长度在21～22nt的miRNA簇，与多能性干细胞自我更新及多向分化有重要关系．在体细胞向多能性干细胞重编程中具有重要作用．miR-302／367簇中各miRNA具有相对保守的种子区及靶基因，主要通过抑制靶基因蛋白质的翻译，从而促进间质．上皮转化（mesenchymal-epithelial transition，MET）、抑制细胞周期、调控细胞分化相关基因及表观遗传水平等方式促进体细胞向多能性细胞重编程．本文对miR-302／367的发现、结构、miR．302／367在多能性细胞中的作用及在体细胞向多能性干细胞重编程中的作用及其机理等做一综述．

pri-mir-302/367重组慢病毒载体的构建及其下游调节基因的鉴定

目的:构建可诱导表达pri-mir-302/367的慢病毒载体,并研究miR-302/367家族基因miR-302a/b/c/d和miR-367及其下游调节基因OCT4、SOX2和NANOG在HeLa细胞中的诱导性表达。方法:以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增pri-mir-302/367基因。经双酶切后连接入pLV-TRE质粒,构建pLV-TRE-302慢病毒重组体,酶切及测序予以鉴定。将重组质粒和辅助质粒共同转染293 FT细胞,并测定病毒滴度。用病毒转染HeLa细胞,强力霉素(doxycline,DOX)诱导后,通过real-time PCR测定miR-302/367家族基因及其下游调节基因的表达。实验分为诱导组(DOX+)、非诱导组(DOX-)和空白组(blank)。结果:酶切及测序证实重组慢病毒载体pri-mir-302/367构建成功,病毒滴度为5×106TU/ml;DOX诱导72 h后,real-time PCR结果显示诱导组高于非诱导组和空白组(P<0.05,其中miR-302a:P DOX+vs.DOX-=0.032,P DOX+vs.blank=0.048;miR-302b:P DOX+vs.DOX-=0.001,P DOX+vs.blank=0.001;miR-302c:P DOX+vs.DOX-=0.000,P DOX+vs.blank=0.000;miR-302d:P DOX+vs.DOX-=0.002,P DOX+vs.blank=0.047;miR-367:P DOX+vs.DOX-=0.001,PDOX+vs.blank=0.001;OCT4:P DOX+vs.DOX-=0.000,P DOX+vs.blank=0.001;SOX2:P DOX+vs.DOX-=0.000,P DOX+vs.blank=0.000;NANOG:P DOX+vs.DOX-=0.000,PDOX+vs.blank=0.000),而非诱导组与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05,其中miR-302a:P blank vs.DOX-=0.057;miR-302b:P blank vs.DOX-=0.832;miR-302c:P blank vs.DOX-=0.445;miR-302d:P blank vs.DOX-=0.979;miR-367:P blank vs.DOX-=0.161;OCT4:P blank vs.DOX-=0.051;SOX2:P blank vs.DOX-=0.060;NANOG:P blank vs.DOX-=0.078)。结论:成功构建了携带人miR-302/367可控性慢病毒载体,为后续的重编程研究奠定了实验基础。

lncRNA MEG8通过调控miR-367-3p/PTEN介导慢性阻塞性肺疾病发展的分子机制研究

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)MEG8通过调控miR-367-3p/磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)介导慢性阻塞性肺疾病(COPD)发展的分子机制。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测16HBE细胞和COPD组织lncRNA MEG8表达水平;在香烟烟雾提取物(CSE)刺激后的16HBE细胞中过表达lncRNA MEG8及加入miR-367-3p inhibitor后同时敲减lncRNA MEG8或PTEN,采用MTT法、流式细胞术、酶联免疫吸附试验和免疫印迹法检测细胞凋亡、细胞增殖和炎症因子水平的变化;利用双荧光素酶报告系统对lncRNA MEG8、miR-367-3p、PTEN的靶向关系进行验证。结果 MEG8在CSE刺激的16HBE细胞和COPD临床组织样本中表达降低(P<0.05)。相比于CSE组,过表达MEG8后CSE刺激的16HBE细胞凋亡和炎症因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平降低(P<0.05),促凋亡蛋白Bax、Caspase3和Cleaved-caspase3表达水平降低(P<0.05),凋亡抑制因子Bcl-2表达水平升高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验验证了MEG8可靶向抑制miR-367-3p(P<0.05),同时miR-367-3p可靶向抑制PTEN的表达(P<0.05),进而抑制CSE刺激的16HBE细胞的凋亡和炎症反应(P<0.05)。在CSE刺激下,相较于Control组,加入miR-367-3p inhibitor可显著上调16HBE细胞中PTEN的蛋白表达水平(P<0.05),增强细胞增殖活性(P<0.05),减少细胞凋亡(P<0.05),显著下调促凋亡蛋白Bax、Caspase 3和Cleaved-caspase3的表达水平(P<0.05),上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(P<0.05),抑制炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平(P<0.05),随后敲降MEG8或PTEN可恢复PTEN的蛋白表达水平(P<0.05),抑制细胞增殖活性(P<0.05),逆转miR-367-3p inhibitor导致的细胞凋亡(P<0.05)以及对凋亡相关蛋白的调控作用(P<0.05),增强炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平(P<0.05)。结论 MEG8通过调控miR-367-3p/PTEN轴抑制CSE刺激的16HBE细胞的凋亡和炎症反应,并可能为临床COPD的治疗提供新的治疗策略。

皮肤恶性黑色素瘤组织miR-205、miR-367表达及其临床意义

目的探讨皮肤恶性黑色素瘤(CMM)组织中miR-205、miR-367的表达及与临床病理特征和预后的关系。方法选取2013年5月至2019年12月我院收治的85例CMM患者术中切除的肿瘤组织作为CMM组,另选取同期于本院治疗的80例皮肤良性色素痣患者的痣组织标本作为对照组。采用qRT-PCR法检测miR-205、miR-367的表达水平。收集CMM患者的临床病理资料,分析miR-205、miR-367表达与临床病理特征的关系。Kaplan-Meier法绘制患者术后3年的生存曲线,采用Log-rank检验分析患者生存率。COX比例风险回归模型分析预后的影响因素。结果CMM组患者miR-205表达水平低于对照组(P<0.05),miR-367表达水平高于对照组(P<0.05)。miR-205低表达组患者溃疡、临床分期高、肿瘤侵袭、KPS评分低、原发灶厚、Clark分级高、淋巴结转移的比例高于miR-205高表达组(P<0.05),miR-367高表达组患者以上指标比例高于miR-367低表达组(P<0.05)。随访3年,中位时间为28.3个月,失访1例。Kaplan-Meier生存曲线显示,miR-205高表达组患者3年生存率高于miR-205低表达组(P<0.05);miR-367低表达组患者3年生存率高于miR-367高表达组(P<0.05)。COX多因素分析显示,临床分期高、KPS评分低、Clark分级高、淋巴结转移及miR-367表达升高为患者预后的危险因素,miR-205表达升高为其保护因素(P<0.05)。结论CMM组织中miR-205低表达,miR-367高表达,且均与患者溃疡、临床分期高、肿瘤侵袭、KPS评分低、原发灶厚、Clark分级高、淋巴结转移和预后不良有关,可作为CMM患者预后评估的潜在标志物。

Ang-2、miR-302b、IL-6在心肌梗死伴肺部感染患者早期诊断及心肌损伤评估中的价值

目的:探讨促血管生成素2(Ang-2)、微小RNA-302b(miR-302b)、白细胞介素-6(IL-6)在急性心肌梗死(AMI)伴肺部感染患者早期诊断及心肌损伤评估中的价值。方法:选取2019年1月~2021年12月中山大学附属第三医院粤东医院AMI伴肺部感染患者49例作为感染组,同期选取62例AMI患者作为未感染组。统计两组入院时、入院48 h后、出院时Ang-2、miR-302b、IL-6水平,绘制受试者工作特征(ROC)曲线及ROC曲线下面积(AUC),分析血液各指标单一或联合诊断AMI伴肺部感染价值,并根据是否发生心肌损伤分为中重度心肌损伤(n=26)和轻度心肌损伤(n=23),比较入院时、入院48 h后、出院时血液各指标及心肌酶谱指标[肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白(cTnI)、谷草转氨酸(AST)],分析两者相关性。结果:入院48 h后两组血清Ang-2、miR-302b、IL-6水平达到峰值,感染组血清Ang-2、miR-302b、IL-6水平高于未感染组,差异有统计学意义(P<0.05);联合诊断AMI伴肺部感染价值的AUC>入院48 h后Ang-2>入院48 h后miR-302b>入院48 h后IL-6,差异有统计学意义(P<0.05);入院48 h后中重度心肌损伤及轻度心肌损伤患者血清Ang-2、miR-302b、IL-6水平达到峰值,中重度心肌损伤患者血清Ang-2、miR-302b、IL-6水平高于轻度心肌损伤患者,差异有统计学意义(P<0.05);Ang-2、miR-302b、IL-6均与CK-MB、cTnI、AST呈正相关,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Ang-2、miR-302b、IL-6在AMI伴肺部感染患者中呈高表达,具有较高的疾病诊断价值,且与心肌损伤呈显著正相关。

miR-302/367家族研究进展

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为22 nt的内源性小分子非编码RNA,几乎参与了机体生命活动的所有过程。Micro RNA-302/367(miR-302/367)家族,包括miR-302a/b/c/d和miR-367等成员。近些年,人们对miR-302/367家族在胚胎干细胞的自我更新与多能干细胞的诱导机制进行较为深入的研究。此外,该家族在肿瘤和炎症反应等方面调控作用也日益受到关注。现就miR-302/367的功能研究进展作一综述。

草苁蓉多糖下调miR-302a-3p表达对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响

目的探讨草苁蓉多糖(boschniakia rossica polysaccharides,BRPS)对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)诱导的心肌细胞损伤的影响及其作用机制。方法H/R诱导大鼠心肌细胞H9c2建立细胞损伤模型,不同剂量的BRPS处理H9c2细胞;酶联免疫吸附剂测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)的水平和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性;流式细胞术检测凋亡率;qRT-PCR检测miR-302a-3p的表达量;anti-miR-NC、anti-miR-302a-3p分别转染至H9c2细胞后进行H/R处理,miR-NC、miR-302a-3p mimics分别转染至H9c2细胞后加入100 mg·L^(-1)BRPS处理24 h,进行H/R处理;Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白表达;线软件预测和双荧光素酶报告实验检测miR-302a-3p和LRP8的靶向关系;Western blot检测低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)的表达量。结果BRPS降低H/R诱导的H9c2细胞中MDA的水平、miR-302a-3p的表达量、细胞凋亡率、Bax表达(P<0.05),提高SOD、GSH-Px、Bcl-2(P<0.05);转染anti-miR-302a-3p后,MDA的水平、细胞凋亡率、Bax表达下调(P<0.05),SOD、GSH-Px、Bcl-2上调(P<0.05);转染miR-302a-3p mimics后,MDA的水平、细胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05),SOD、GSH-Px和Bcl-2降低(P<0.05)。miR-302a-3p靶向调节LRP8,且BRPS通过下调miR-302a-3p上调LRP8基因的表达。结论BRPS通过调节miR-302a-3p/LRP8轴减轻H/R诱导的心肌细胞损伤。

miR-302d的载体构建及其与Tle4基因的靶向关系验证

试验旨在探究精原干细胞(SSCs)形成过程中的关键miR-302d行使功能的分子机制。试验克隆mi R-302d前体序列并连入PGMLV-CMV-MCS-EF1-Zs Green1-T2A-Puro构建mi R-302d过表达载体(mi R-302d mimics);合成mi R-302d的干扰靶点并连入PGMLV-SC5载体构建mi R-302d干扰载体(mi R-302d inhibitor)。通过生物信息预测获得mi R-302d靶基因并构建其3′UTR的野生型(WT)和突变型载体(MT);将mi R-302d过表达载体分别与WT和MT载体共转染DF-1和293T细胞,检测靶基因3′UTR的活性。同时检测在DF-1细胞中过表达或干扰mi R-302d后靶基因的表达变化。结果显示:成功构建mi R-302d的过表达和干扰载体;预测结果显示Tle4为mi R-302d的潜在靶基因,且该基因为ESCs分化为SSCs过程的重要基因;双荧光素酶活性检测结果显示不论是在DF-1还是293T细胞中,与转染WT+mi R-NC组相比,转染WT+mi R-302d组的双荧光素酶活性显著下降(P<0.05),而共转染MT+mi R-302d组的荧光素酶活性差异不显著(P>0.05),且过表达mi R-302d后下调Tle4的表达,而干扰mi R-302d后上调Tle4的表达。结果表明,miR-302d可直接调节靶基因Tle4的表达。

LncRNA LINC01194在非小细胞肺癌中对miR-302e的影响及机制研究

目的:初步探索长链非编码RNA(lncRNA LINC01194)在非小细胞肺癌(NSCLC)中对miR-302e的影响及机制。方法:实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测NSCLC组织、癌旁组织和人肺正常上皮细胞BEAS-2B及NSCLC细胞株中lncRNA LINC01194、miR-302e表达,筛选最佳干预细胞系;将NCI-H1975细胞分为:control组(正常培养)、si-NC组(转染si-NC)、si-LINC01194组(转染si-LINC01194)、si-LINC01194+anti-miR-NC组(si-LINC01194和anti-miR-NC共转染)、si-LINC01194+anti-miR-302e组(si-LINC01194和anti-miR-302e共转染);qRT-PCR检测细胞中lncRNA LINC01194、miR-302e的表达;MTT法、平板克隆实验、Transwell小室、流式细胞仪分别检测细胞增殖、迁移及侵袭、凋亡;Western blot方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、B细胞淋巴瘤蛋白2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达;双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA LINC01194与miR-302e靶向调控关系。结果:在NSCLC组织和细胞中,lncRNA LINC01194表达水平升高,miR-302e表达水平降低(P<0.05);抑制lncRNA LINC01194表达可显著抑制NCI-H1975细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞凋亡(P<0.05);抑制miR-302e表达可逆转抑制lncRNA LINC01194表达对NCI-H1975细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用及对细胞凋亡的促进作用(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实lncRNA LINC01194与miR-302e存在靶向调控关系。结论:在NSCLC组织和细胞中lncRNA LINC01194上调表达,miR-302e下调表达,抑制lncRNA LINC01194可通过上调miR-302e表达,从而抑制NSCLC细胞增殖、迁移与侵袭,促进其凋亡。

吸入糖皮质激素对毛细支气管炎患儿血miR-302e、NF-κB RNA表达的治疗观察

目的观察毛细支气管炎患儿miR-302e、NF-κB RNA的表达水平及雾化吸入糖皮质激素对其的治疗作用。方法收集毛支患儿分为激素组、非激素组各30例,急性期、恢复期各采集血标本,收集门诊体检健康儿31例为对照组,采集血标本。采用RT-PCR法检测各组血miR-302e、NF-κB RNA的表达水平。结果急性期毛支激素组、非激素组患儿血miR-302e的表达水平[(1.21±0.07)pg/ml,(1.22±0.09)pg/ml]均显著低于对照组[(1.51±0.09)pg/ml],而NF-κB RNA的表达水平[(0.63±0.13)pg/ml,(0.66±0.12)pg/ml]显著高于对照组[(0.43±0.09)pg/ml]。经吸入糖皮质激素治疗后,恢复期毛支激素组患儿血miR-302e的表达水平[(1.48±0.11)pg/ml]显著高于非激素组[(1.36±0.09)pg/ml],而NF-κB RNA的表达水平[(0.39±0.09)pg/ml]显著低于非激素组[(0.47±0.11)pg/ml]。经Pearson等级相关分析,毛支患儿血miR-302e的表达水平与NF-κB RNA的表达水平呈显著负相关(r=-0.727,P<0.01),miR-302e的表达水平与入院临床症状评分呈负相关(r=-0.845,P<0.01)。结论吸入糖皮质激素能上调毛支血miR-302e的表达,抑制NF-κB RNA的表达从而发挥抗炎作用。

结肠癌组织LncRNA MEG3、miR-302b-3p表达与临床分期的相关性及对手术治疗预后的指导价值探究

背景越来越多的长非编码RNA与微小RNA被发现在肿瘤的发生和发展中表达量变化显著,能够影响抑癌基因或者癌基因的表达,在癌细胞的增殖、转移中发挥了重要的作用.目的探究结肠癌组织长链非编码RNA母系印记基因3(LncRNA MEG3)、微小RNA(miR)-302b-3p表达与临床分期的相关性及对手术治疗预后的指导价值.方法选取2017-01/2022-03金华市中医医院97例结肠癌患者,观察比较不同组织LncRNA MEG3、miR-302b-3p表达,分析LncRNA MEG3、miR-302b-3p表达与临床病理特征的相关性;比较不同LncRNA MEG3、miR-302b-3p表达患者复发情况,分析结肠癌术后复发影响因素,并分析LncRNA MEG3、miR-302b-3p交互作用对结肠癌复发的影响,评价LncRNA MEG3、miR-302b-3p表达对结肠癌术后复发的预测价值.结果结肠癌组织LncRNA MEG3、miR-302b-3p表达均低于癌旁组织(P<0.05);结肠癌组织LncRNA MEG3、miR-302b-3p表达与性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05),与分化程度、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05);结肠癌组织中LncRNA MEG3、miR-302b-3p高表达组1年内复发率低于LncRNA MEG3、miR-302b-3p低表达组(P<0.05);分化程度、临床分期、淋巴结转移均为结肠癌复发危险因素,癌组织LncRNA MEG3、miR-302b-3p表达均为结肠癌复发保护因素(P<0.05);交互作用分析显示,LncRNA MEG3、miR-302b-3p同时暴露的协同效应是LncRNA MEG3或miR-302b-3p单纯暴露产生效应的15.888倍,且二者同时暴露时,结肠癌复发风险中有56.98%归因于二者协同作用;LncRNA MEG3、miR-302b-3p预测结肠癌患者预后的曲线下面积(area under the curve,AUC)(95%CI)分别为0.720(0.620-0.807)、0.767(0.670-0.847),二者联合预测AUC(95%CI)为0.892(0.813-0.946),明显高于LncRNA MEG3、miR-302b-3p单独预测,最佳敏感度及特异度分别为92.31%、83.33%.结论结肠癌患者癌组织LncRNA MEG3、miR-302b-3p表达下调,与临床分期有关,临床检测其表达可用于明确肿瘤恶性程度、预测手术治疗预后,为临床后续治疗方案调整提供参考依据.

miR-302c调控CXCL8表达抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭

目的:探讨miR-302c调控CXC趋化因子配体8(CXCL8)表达对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞增殖和侵袭的影响。方法:收集行手术治疗的ESCC病人ESCC组织和其对应的癌旁组织,以及人ESCC细胞系Eca109、Ec9706、TE-11、TE-10、食管正常上皮细胞系Het-1A为研究对象,qRT-PCR检测miR-302c表达;利用LipofectamineTM2000转染试剂盒对Eca109细胞进行转染,分组为:空白组(细胞未转染)、miR-NC组、miR-302c mimics组、si-CXCL8组、si-NC组、miR-302c mimics+OE-NC组、miR-302c mimics+OE-CXCL8组,qRT-PCR检测各组细胞中miR-302c表达;MTT法检测各组细胞增殖情况;Transwell实验检测各组细胞侵袭情况;双荧光素酶报告基因检测实验验证miR-302c与CXCL8靶向关系;Western blotting检测CXCL8、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达情况。结果:miR-302c在ESCC组织中的表达水平低于癌旁组织(P<0.05),与人食管正常上皮细胞系Het-1A比较,人ESCC细胞系Eca109、Ec9706、TE-11、TE-10中miR-302c表达水平降低(P<0.05),且Eca109细胞中miR-302c表达水平最低,因此,选择Eca109细胞进行后续研究;miR-302c靶向负调控CXCL8表达;上调miR-302c和沉默CXCL8均能抑制Eca109细胞的增殖与侵袭,并降低Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05);过表达CXCL8可逆转上调miR-302c对Eca109细胞增殖与侵袭的影响。结论:上调miR-302c表达可通过靶向抑制CXCL8表达,抑制ESCC细胞的增殖和侵袭。

LINC01342靶向miR-367-3p调控OX-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡及细胞炎症反应的实验研究

目的 探究LINC01342靶向miR-367-3p调控氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)诱导的血管内皮细胞凋亡及细胞炎症反应的实验研究。方法 用MTT法检测OX-LDL细胞A值;采用100μg/mL OX-LDL处理HUVEC细胞,将细胞分为NC组(正常培养细胞)、OX-LDL组(OX-LDL处理细胞)、si-NC+OX-LDL组(转染si-NC,用OX-LDL处理细胞)、si-LINC01342+OX-LDL组(转染si-LINC01342,用OX-LDL处理细胞)、miR-NC+OX-LDL组(转染miR-NC,用OX-LDL处理细胞)、miR-367-3p+OX-LDL组(转染miR-367-3p,用OX-LDL处理细胞)、si-LINC01342+anti-miR-NC+OX-LDL组(共转染si-LINC01342和anti-miR-NC,用OX-LDL处理细胞)、si-LINC01342+anti-miR-367-3p+OX-LDL组(共转染si-LINC01342和anti-miR-367-3p,用OX-LDL处理细胞),qRT-PCR检测LINC01342和miR-367-3p含量;Western blot法和流式细胞术分别检测细胞凋亡和凋亡蛋白Cleaved-caspase-3;ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α含量;双荧光素酶报告实验检测LINC01342和miR-367-3p关系。结果 与NC组比较,OX-LDL组LINC01342表达水平、Cleaved-caspase-3蛋白表达、凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高,miR-367-3p表达水平显著降低。下调LINC01342或过表达miR-367-3p可下调OX-LDL诱导的HUVEC细胞Cleaved-caspase-3蛋白表达、凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量。LINC01342靶向负调控miR-367-3p的表达,抑制miR-367-3p可以逆转下调LINC01342对OX-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡和炎症反应的影响。结论 LINC01342靶向负调控miR-367-3p抑制OX-LDL诱导的血管内皮细胞凋亡、炎症反应。

miR-302a对结直肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性的影响及机制

目的:探究miR-302a对结直肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性的影响及机制。方法:在四株结直肠癌细胞系HT29、HCT8、SW480、SW1463中,通过转染miR-302a mimic构建miR-302a过表达模型,RT-PCR检测过表达效果;CCK-8法检测转染48 h后高表达miR-302a细胞的增殖能力及对奥沙利铂的敏感性;蛋白质印迹法检测转染后P-gp蛋白及Wnt/β-catenin通路相关蛋白MMP-7、c-Jun、c-myc、β-catenin、LEF1的变化。结果:相比正常小肠上皮细胞HIEC,miR-302a在结直肠癌细胞系HT29、HCT8、SW480、SW1463中的表达较低。转染mimic后,miR-302a的表达明显上调(P<0.001)。增殖实验发现miR-302a的上调并不影响结直肠癌细胞的增殖,而在转染miR-302a的细胞中加入奥沙利铂,miR-302a组HT29、HCT8、SW480和SW1463细胞存活率相比miR-NC组分别降低2.46、1.89、2.39、2.86倍。进一步探究miR-302a增加奥沙利铂敏感性的机制,发现miR-302a可抑制P-gp蛋白的表达,并且抑制Wnt/β-catenin通路相关蛋白MMP-7、c-Jun、c-myc、β-catenin、LEF1的表达。结论:miR-302a可增加结直肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性,其机制可能是通过抑制P-gp的蛋白表达,并抑制Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达而实现。

胃癌患者组织中TGF-α、TGF-β1和miR-302a的表达及其与胃癌的相关性研究

目的探讨转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β1)和微小RNA-302a(miR-302a)在胃癌患者组织中的表达及其与胃癌的相关性。方法选取2016年6月至2018年6月唐山市人民医院收治的92例胃癌患者作为研究对象,患者均接受手术治疗,手术过程中取病灶组织,设为胃癌组;选择癌旁组织(距离病灶≥3 cm),设为对照组。采用实时荧光PCR检测技术测定92组织样本中miR-302a的表达量,同时采用免疫组化法检测组织样本中TGF-α和TGF-β1的表达水平;并分析其与胃癌分级、淋巴转移和TNM分期等的相关性。结果胃癌组织中TGF-β1呈强阳性表达,在胃癌组织旁增殖区域及旺盛增殖区域呈现弱阳性表达,在正常黏膜中呈现弱阳性或阴性表达。胃癌组中TGF-α和TGF-β1表达水平明显高于对照组(P<0.01),胃癌组miR-302a表达水平明显低于对照组(P<0.01)。胃癌组织中TGF-α、TGF-β1和miR-302a表达水平与年龄、性别无统计意义(P>0.05);胃癌组织中TGF-α、TGF-β1和miR-302a表达水平与组织分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关(P>0.05)。胃癌组织中TGF-α、TGF-β1和miR-302a表达水平与患者临床分期呈正相关性(P<0.05)。结论TGF-α、TGF-β1和miR-302a在胃癌组织中表达量显著改变,且与肿瘤细胞的TNM分期、分化程度和淋巴结转移相关,提示TGF-α、TGF-β1和miR-302a可能在胃癌的发生、分化和转移过程中起一定作用。

血清miR-302b在老年急性心肌梗死中的表达及其临床意义

目的探讨血清miR-302b在老年急性心肌梗死(AMI)患者中的表达及其临床意义。方法选取本院收治的138例老年AMI患者和65例老年体检者,比较两组血清miR-302b、心肌肌钙蛋白I(cTnI)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平变化。应用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-302b、cTnI及CK-MB水平对老年AMI的诊断价值。采用Pearson相关性分析,分析老年AMI患者miR-302b水平与cTnI、CK-MB的相关性。结果 AMI组血清miR-302b(4.25±1.30 vs. 0.51±0.16)、cTnI(ng/mL:3.17±1.36 vs. 0.04±0.01)及CK-MB(U/L:73.50±19.36 vs. 11.70±2.25)水平均明显高于对照组(P<0.01)。ROC曲线分析显示,miR-302b、cTnI及CK-MB诊断AMI的临界值分别为2.73、1.52 ng/mL、61.30 U/L,三项联合诊断老年AMI的AUC最大为0.935,95%CI(0.872~0.985),其敏感度和特异度分别为94.8%和89.2%。相关分析显示,老年AMI患者血清miR-302b水平与cTnI、CK-MB均呈正相关(r=0.826、r=0.745,P<0.01)。结论血清miR-302b在老年AMI患者中呈高表达,与cTnI、CK-MB联合检测有助于提高老年AMI诊断的准确性。

hsa-miR-21-5p/ZNF367分子轴通过PI3K/Akt通路影响胃癌细胞的增殖和迁移

目的探讨ZNF367通过PI3K/Akt通路抑制胃癌(GC)细胞的增殖和迁移,并初步探讨其作用分子机制。方法收集2015年8月–2018年10月上海市第八人民医院普外科手术切除的GC组织(非坏死部分)和相邻癌旁组织(距肿瘤组织>3 cm)标本46例,同时选取正常人胃黏膜上皮细胞GES1及GC细胞系MGC-803和MKN-45。采用qRT-PCR、Western blot实验检测ZNF367和hsa-miR-21-5p(mi R-21-5p)在组织和细胞系中的表达情况,进行Kaplan-Meier生存分析得出总生存期;利用脂质体LipofectamineTM 2000转染寡核苷酸片段mi RNA-NC、miR-21-5pmimic和miR-21-5pinhibitor至MGC-803细胞,通过CCK8法和划痕实验检测细胞的增殖和迁移能力;采用双荧光素酶报告载体系统验证ZNF367和miR-21-5p的作用靶点,采用qRT-PCR、 Westernblot实验检测miR-21-5pmimic和miR-21-5pinhibitor转染MGC-803细胞中ZNF367、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin以及PI3K/Akt通路中p-PI3K和p-Akt的表达情况。结果 ZNF367在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达水平分别显著低于癌旁组织和GES-1细胞(P<0.01),且在MGC-803细胞中表达水平最低,而miR-21-5p的表达正相反;在MGC-803细胞中,OE-ZNF367和miR-21-5p inhibitor转染组的细胞增殖和迁移能力显著低于对照组,而si RNA-ZNF367和miR-21-5pmimic转染组的细胞增殖和迁移能力显著高于对照组;生物信息学和荧光素酶活性实验结果表明ZNF367与miR-21-5p具有直接靶向关系;qRT-PCR、Western blot实验结果表明在miR-21-5p inhibitor转染组中,E-cadherin的表达是显著提高的(P <0.01),而N-cadherin、Vimentin、p-PI3K和p-Akt的表达是显著下降的(P<0.01);在miR-21-5pmimic转染组中,结果相反(P <0.01)。结论 hsa-miR-21-5p/ZNF367分子轴通过调控PI3K/Akt通路抑制EMT过程,从而影响胃癌细胞MGC-803的增殖和迁移。

miR-302a对叶酸缺乏小鼠胚胎干细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-302a对叶酸缺乏小鼠胚胎干细胞(mESC)增殖和凋亡的影响。方法 mESC分为完全培养基组(对照组),无叶酸培养基组(无叶酸组),无叶酸培养基+miR-302amimic组(miR-302a组),通过RT-PCR进行检测miR-302a在完全培养基及无叶酸培养基中的表达。构建miR-302amimic,后转染到无叶酸培养基mESC中,采用MTT法检测miR-302a mimic对mESC活力的影响,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测miR-302amimic对mESC细胞凋亡的影响;流式细胞术检测miR-302amimic对mESC细胞周期的影响;Western blot检测及磷脂酰肌醇3羟激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路激活情况,以及下游分子细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、p27表达的影响。结果 RT-PCR证实无叶酸组中miR-302a表达量下降(P<0.01)。与完全培养基比较,无叶酸培养基中,mESC细胞活力下降,细胞凋亡增加,细胞周期阻滞在G1期,Akt及mTOR磷酸化水平下降,CyclinD1表达下调,p21及p27表达上调,差异均具有统计学意义(P<0.01)。与无叶酸组比较,miR-302a组中,mESC细胞活力上升,凋亡下降,G1期缩短,AKT及mTOR磷酸化水平提高,CyclinD1表达上调,p21及p27表达下调,差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论 miR-302a类似物能显著抑制缺乏叶酸mESC凋亡,能促进其增值,与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。

炎症相关细胞因子对食管癌细胞株miR-302b表达的影响

目的:研究食管癌细胞在炎症相关细胞因子作用下miR-302b表达情况,以明确miR-302b的表达水平是否与食管癌肿瘤相关性炎症有关。方法:选择4株食管癌细胞及1株永生化食管上皮细胞株作为对照。用含LPS、IL-6、IFN-γ、TGF-β的RPMI 1640培养基以及普通RPMI 1640培养基培养细胞。于刺激0h、12h、24h、48h提取总RNA,qRT-PCR检测miR-302b表达水平。结果:食管癌细胞miR-302b的表达水平较永生化食管上皮细胞的表达水平低;炎症相关细胞因子可以抑制食管癌细胞miR-302b的表达水平,而且随着刺激时间的延长,对miR-302b的抑制率逐渐升高;而永生化食管上皮细胞miR-302b的表达无明显变化。结论:miR-302b的表达与食管癌肿瘤相关性炎症具有相关性。

miR-367-3p在非小细胞肺癌组织中的表达及对细胞功能的影响

目的:研究miR-367-3p在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中促进肿瘤生长的作用机制。方法:收集非小细胞肺癌患者的临床标本,检测miR-367-3p在非小细胞肺癌组织中的表达。利用qRT-PCR、MTT和流式细胞术分别评估miR-367-3p的表达改变对肿瘤细胞增殖和周期的影响。Western blot检测miR-367-3p表达改变对FBXW7的影响。双荧光素酶实验验证miR-367-3p与FBXW7之间的直接关系。结果:miR-367-3p在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于对应癌旁组织。miR-367-3p作为促癌的miRNA,在非小细胞肺癌细胞中促进肿瘤细胞增殖和细胞周期进程。miR-367-3p对NSCLC细胞生物学功能的影响部分依赖靶向抑制FBXW7。结论:miR-367-3p通过靶向抑制FBXW7的表达促进NSCLC细胞增殖和周期。