LncRNA GNAS-AS1通过调节miR-449a/Notch1轴参与胃癌细胞的增殖和迁移

目的探究长链非编码RNA(LncRNA)GNAS反义RNA1(GNAS-AS1)通过调节miR-449a/缺刻基因1(Notch1)轴对胃癌(GC)细胞增殖和迁移的影响。方法收集四川省人民医院2013年9月至2017年9月30例确诊为GC的患者肿瘤组织与癌旁组织标本;将GC细胞AGS随机分为对照组(Control组)、si-NC组、si-GNAS-AS1组、si-GNAS-AS1+inhibitor NC组、si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组。实时荧光定量PCR检测GNAS-AS1、miR-449a和Notch1 mRNA的表达;MTT实验、平板克隆形成实验检测增殖;wound healing实验检测细胞迁移;Transwell实验检测细胞侵袭。Western Blot检测Notch1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-449a和GNAS-AS1、Notch1的关系。结果与癌旁组织相比,肿瘤组织中GNAS-AS1、Notch1 mRNA表达升高,miR-449a表达降低(P<0.05)。与Control组、si-NC组相比,si-GNAS-AS1组AGS细胞GNAS-AS1表达、OD_(490)值、克隆形成数、划痕愈合率、细胞侵袭数目、Notch1、Vimentin、N-cadherin蛋白表达表达降低,miR-449a表达、E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)。与si-GNASAS1组、si-GNAS-AS1+inhibitor NC组相比,si-GNAS-AS1+miR-449a inhibitor组OD_(490)值、划痕愈合率、细胞侵袭数目、Notch1、Vimentin、N-cadherin表达升高(P<0.05),miR-449a表达、E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。GNAS-AS1靶向负调控miR-449a表达,miR-449a靶向负调控Notch1表达。结论沉默GNAS-AS1可能通过上调miR-449a来抑制Notch1蛋白的表达,从而抑制GC细胞增殖、迁移、侵袭过程。

miR-449a下调TGIF2抑制甲状腺癌细胞CAL-62恶性增殖的研究

目的 探讨miR-449a靶向TGIF2对甲状腺癌细胞CAL-62恶性增殖、氧化应激和上皮间质转化(EMT)的调控作用。方法 以甲状腺癌细胞CAL-62作为研究对象。分为对照组、miR-449a mimic组、pcDNA-TGIF2组、miR-449a mimic+pcDNA-TGIF2共转染组。采用RT-qPCR检测细胞中miR-449a和TGIF2表达;TargetScan软件与双荧光素酶报告实验验证二者靶向关系;CCK8检测细胞活力;Brdu染色检测细胞增殖;试剂盒检测氧化应激标记物SOD和MDA含量;DCF染色检测ROS含量;Western blot检测EMT标记分子E-cadherin, N-cadherin和Fibronectin的蛋白表达。结果 TGIF2在CAL-62细胞中表达较高,与对照组相比,pcDNA-TGIF2转染组BrdU阳性细胞数目和百分率显著增加,SOD含量显著升高而MDA和ROS含量显著降低,同时N-cadherin和Fibronectin表达显著上升而E-cadherin表达显著下降(均P<0.05)。在miR-449a mimic+pcDNA-TGIF2共转染组中上述现象被有效缓解和逆转。结论 miR-449a过表达可通过靶向TGIF2抑制甲状腺癌细胞CAL-62恶性增殖,加剧其氧化应激和上皮间质转换。

hsa-miR-449a靶基因预测及生物信息学分析

目的:利用多种生物信息学数据库对hsa-miR-449a的靶基因及其生物学功能进行预测,为将来深入探索hsa-miR-449a的生物学功能及其对相关疾病的作用机制提供理论依据。方法:分析hsa-miR-449a在不同物种间的保守性及其在不同疾病中的表达情况;运用4个常用的在线数据库(mirDIP、TargetScan、miRDB、miRWalk)预测hsa-miR-449a的靶基因并取其交集,随后对其交集靶基因进行PPI网络构建、GO分析和KEGG Pathway分析。结果:hsa-miR-449a序列在10个物种间高度保守,并且在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、子宫癌等疾病中表达明显增高;4个miRNA靶基因预测数据库取交集后共得到386个靶基因,它们广泛存在于染色质、突触、核浆、胞质等细胞组分中,主要参与调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、细胞周期、信号转导等生物学过程,涉及P53、TGF-β、HIF-1、MAPK等信号通路,以及细胞衰老、胰岛素的分泌、甲状旁腺激素和醛固酮合成与分泌及神经系统的发育、肿瘤等疾病相关通路。结论:hsa-miR-449a广泛参与了细胞增殖与衰老等生命活动,以及癌症、心血管及神经系统疾病的发生发展过程。

miR-449a通过靶向NF-κB改善周围神经损伤炎症反应

旨在评估骨髓间充质干细胞通过miR-449a靶向调控NF-κB信号通路改善周围神经损伤炎症反应的作用机制。方法 采用过表达和抑制miR-449a转染干细胞,检测转然后干细胞的miR-449a水平和活力;体外共培养干细胞和神经元,评价过表达miR-449a的干细胞对神经元的体外作用机制;建立周围神经损伤大鼠模型,分为空白对照组、模型组、干细胞组、干细胞+miR-449a过表达组和干细胞+miR-449a抑制剂组。检测大鼠的行为状态,脊髓神经细胞miR-449a表达,分析NF-кB信号通路蛋白(IκBα、p50、p65)水平,评估炎症因子TNF-α和 IL-1β含量以及观察损伤组织的恢复情况。结果 体外干细胞组与实验组相比细胞活性无明显增加。而加入神经元后,miR-449a过表达组神经元活性明显增多,NF-кB信号通路蛋白(IκBα、p50、p65)表达减少,炎症因子TNF-α和 IL-1β明显减少(P<0.05)。大鼠体内实验也表明建模后大鼠反应迟钝,受到刺激后不鸣叫不躲避,而进干细胞治疗后大鼠体重以及反应逐渐恢复正常,干细胞+miR-449a过表达组中miR-449a表达显著增加,NF-кB信号通路蛋白(IκBα、p50、p65)表达减少,炎症因子TNF-α和 IL-1β明显减少,细胞活性明显增加(P<0.05)。干细胞+miR-449a抑制剂组可以逆转骨髓间充质干细胞修复周围神经损伤的炎症反应。结论 骨髓间充质干细胞可以通过miR-449a靶向调控NF-кB信号通路减轻周围神经损伤炎症反应修复神经损伤。

miR-449a/b负反馈调节E2F1抑制胃癌细胞增殖

目的探讨miR-449a/b在胃癌发生中的可能作用机制。方法采用qRT-PCR方法检测了miR-449a/b和E2F1基因在胃癌细胞BGC-823和胃粘膜细胞GES-1表达情况;采用瞬时转染技术将miR-449a/b模拟物(mimic)以及mimic阴性对照分别转入胃癌细胞BGC-823中,qRT-PCR验证转染成功后,通过CCK-8法检测胃癌细胞的增殖能力,流式细胞术检测胃癌细胞凋亡的变化,细胞划痕实验检测胃癌细胞的迁移能力,Western blot方法检测miR-449a/b上调后其靶基因蛋白的表达水平;并通过转染E2F1过表达质粒和空质粒对照入胃癌细胞BGC-823,Western blot确定转染效率后,分别用qRT-PCR和数字PCR检测miR-449a/b的表达水平。结果相比于正常胃粘膜细胞株GES-1,miR-449a/b在胃癌细胞株BGC-823中表达均下调(P<0.01);过表达miR-449a/b可抑制胃癌细胞BGC-823增殖和迁移,并促进其凋亡(P<0.05);过表达的E2F1可上调miR-449a/b的表达(P<0.001),而上调miR-449a/b的表达,其直接靶基因CDK4、CDK6表达下调,并可通过CDKs-pRb-E2F1信号通路,间接下调E2F1蛋白的表达(P<0.01)。结论 miR-449a/b的低表达和E2F1的高表达均参与了胃癌的发生、发展,并且miR-449a/b能负反馈调节E2F1抑制胃癌细胞增殖。

miR-449a对人乳腺癌细胞MCF-7增殖及迁移能力的影响

目的:通过敲低微小RNA(microRNA,miRNA)-449a的方法研究miR-449a对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖和迁移能力的影响。方法:采用miRNA芯片在乳腺癌细胞MCF-7和人正常乳腺细胞MCF-10A筛选具有表达差异的miRNA;化学合成法制备miR-449a的抑制剂(inhibitor),转染后经real-time PCR验证表达的变化;细胞增殖CCK-8实验对转染后细胞增殖能力进行检测;划痕实验检测细胞转移能力,transwell小室实验检测细胞侵袭的改变;蛋白免疫印迹法(Western blot)实验对MCF-7细胞增殖和迁移相关的β-catenin和E-cadherin蛋白进行检测;通过生物信息学软件预测miR-449a潜在靶基因为Notch 1,荧光素酶实验检测Notch 1是miR-449a的靶基因。结果:分别收集MCF-7和MCF-10A细胞,芯片结果显示miR-449a在MCF-7细胞的表达水平显著高于MCF-10A;本研究将细胞分为未处理组(Mock组),阴性对照组(negative control组,NC组)和处理组,通过收集不同组MCF-7细胞进行试验,CCK-8结果显示miR-449a下调后MCF-7细胞增殖能力显著降低;划痕实验结果显示miR-449a表达降低导致MCF-7细胞转移能力降低;transwell实验结果显示MCF-7细胞侵袭受到抑制;Western blot结果发现miR-449a敲低后β-catenin表达降低,E-cadherin表达增加;荧光素酶试验结果显示,miR-449a能够显著降低Notch 1-3'-UTR质粒的荧光素活性(P<0.01)。结论:在乳腺癌细胞MCF-7中敲低miR-449a能够显著抑制癌细胞增殖和迁移,而这一变化可能通过降低Notch 1蛋白表达实现的。

miR-449a/b在Ⅱ型子宫内膜癌中表达下调

目的分析Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌及良性子宫内膜组织间MicroRNA(miRNA)表达谱差异。方法收集子宫内膜癌手术患者内膜及良性患者内膜组织,利用免疫组化法分组,分别提取总RNA,基因芯片检测差异表达的miRNA,并经反转录PCR和荧光定量PCR验证差异表达的miRNA。结果芯片检测发现Ⅱ型子宫内膜癌与Ⅰ型子宫内膜癌及良性内膜组织间存在显著下调的miRNA分别有12个和9个,均下调的有miR-449a/b和miR-20b,显著上调的miRNA分别有18个和4个,均上调的有miR-29a。经反转录PCR和荧光定量PCR验证后发现miR-449a在Ⅱ型子宫内膜癌比Ⅰ型子宫内膜癌及良性内膜组织分别下调347倍和288倍,miR-449b分别下调461倍和424倍。结论Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌间miRNA的表达差异可能与不同类型子宫内膜癌的发生发展相关,而miR-449a/b可能与Ⅱ型子宫内膜癌的发病机制有关,可为进一步研究子宫内膜癌发生的分子机制提供依据。

miR-449a靶向调控外周血Toll样受体5影响风湿性心脏病发生发展的分子机制研究

目的:研究微小RNA-449a(miR-449a)是否通过靶向外周血中的Toll样受体5(TLR5)影响风湿性心脏病的发生发展。方法:实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测风湿性心脏病患者外周血中TLR5和miR-449a的表达水平。在风湿性心脏病心肌细胞中转染miR-449a模拟物或TLR5小干扰RNA si-TLR5。采用qRT-PCR检测miR-449a表达,Western blot分析细胞核相关抗原Ki67(Ki67)、活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)、TLR5、磷酸化p65(p-p65)和磷酸化IκBα(p-IκBα)蛋白表达,MTT测定细胞增殖,流式细胞仪评估细胞凋亡,ELISA测定炎症因子IL-1β、TNF-α水平。Starbase靶位点预测软件与双荧光素酶报告基因分析miR-449a与TLR5之间的靶向关系。在风湿性心脏病心肌细胞中共转染miR-449a模拟物和TLR5过表达质粒pcDNA-TLR5,观察细胞增殖、凋亡和NF-κB信号通路活性变化。结果:风湿性心脏病患者外周血中miR-449a的表达水平明显降低,TLR5 mRNA和TLR5蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。过表达miR-449a明显提高风湿性心脏病心肌细胞的Ki67蛋白表达水平、细胞存活率,显著降低Cleaved-caspase-3、p-p65、p-IκBα蛋白表达水平、细胞凋亡率和IL-1β、TNF-α水平(P<0.05)。低表达TLR5明显提高风湿性心脏病心肌细胞的Ki67蛋白表达水平、细胞存活率,显著降低Cleaved-caspase-3蛋白表达水平、凋亡率(P<0.05)。miR-449a通过靶向TLR5调控TLR5蛋白的表达。高表达TLR5后,miR-449a对风湿性心脏病心肌细胞增殖、Ki67蛋白表达的促进作用,以及miR-449a对细胞凋亡、Cleaved-caspase-3、p-p65、pIκBα蛋白表达和IL-1β、TNF-α水平的抑制作用被逆转。结论:miR-449a通过靶向TLR5抑制NF-κB信号通路活性,促进风湿性心脏病心肌细胞的增殖与抑制其凋亡。

miR-449a通过NOTCH1介导铁死亡调控非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡

目的 探讨miR-449a对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的调控作用及其分子机制。方法 用miR-499a过表达类似物Agomir-499a(Agomir-499a组)及其阴性对照(NC组)分别转染非小细胞肺癌NCI-H1975细胞,采用qRT-PCR检测转染细胞中miR-499a的表达水平,CCK-8和Ki67染色法检测细胞增殖,Annexin V染色法检测细胞凋亡。采用铁死亡抑制剂ferrostatin-1(Fer-1)和谷胱甘肽(GSH)分别处理转染Agomir-499a的NCI-H1975细胞(依次记为Agomir-499a+Fer-1组和Agomir-499a+GSH组),采用荧光探针法检测细胞内的Fe2+水平,光学比色法检测细胞内的GSH含量,qRT-PCR检测细胞内铁死亡和铁稳态相关基因的mRNA表达,Western blot检测NOTCH1信号通路相关蛋白的表达。结果 与NC组比较,Agomir-499a组NCI-H1975细胞的miR-449a表达水平明显增加(P=0.001),细胞增殖活力明显降低(P<0.05),细胞凋亡比例明显增加(P=0.004);铁死亡相关因子PTGS2、ACSL4、SLC7A11和COX2的表达水平,Fe2+细胞比例以及铁稳态相关基因TF、STEAP3、TFRC和DMT1的表达水平均明显增加(均P<0.05),但GSH含量以及NOTCH1信号通路相关分子NOTCH1、NICD、JAG1、JAG2、DLL1和HES1的表达水平均明显降低(均P<0.05)。与Agomir-449a组比较,Agomir-449a+Fer-1组铁死亡相关因子PTGS2、ACSL4、COX2和SLC7A11的表达水平,Fe2+细胞比例以及铁稳态相关基因TF和STEAP3的表达水平均明显降低(均P<0.05),但GSH含量和NOTCH1信号通路相关分子NICD、JAG1和DLL1的表达水平均明显增加(均P<0.05);Agomir-449a+GSH组SLC7A11、COX2和ACSL4的表达水平也较Agomir-449a组明显降低(均P<0.05)。结论 miR-449a可诱导非小细胞肺癌NCI-H1975细胞凋亡和增殖抑制,其作用机制可能与抑制NOTCH1信号介导的铁死亡有关。

骨肉瘤患者血清中miR-34a、miR-449a表达及与新辅助化疗耐药的关系

目的分析骨肉瘤患者血清中miR-34a、miR-449a表达水平及与新辅助化疗耐药的关系。方法随机选择骨肉瘤83例,将其纳入研究组。另选取同期体检健康受试者83例,将其纳入对照组。检测血清miR-34a、miR-449a表达水平。问卷调查骨肉瘤患者临床病理特征,给予新辅助化疗,统计耐药情况。结果研究组患者血清miR-34a水平(6.47±1.28)明显高于对照组(P<0.05),miR-449a水平(29.47±1.23)低于对照组(P<0.05)。不同年龄、性别、肿瘤位置患者血清miR-34a、miR-449a水平差异比较无统计学意义(P>0.05)。不同肿瘤大小、临床分期患者的血清miR-34a、miR-449a水平差异比较有统计学意义(P<0.05)。化疗有效组患者血清miR-34a表达水平(7.09±1.09)明显低于无效组(P<0.05),miR-449a表达水平(33.74±2.06)明显高于化疗无效组(P<0.05)。结论骨肉瘤患者血清miR-34a高表达,miR-449a低表达,且表达水平影响新辅助化疗效果,高表达会增加耐药性,增加化疗无效风险。

miR-449a靶向调节c-Met抑制Hela细胞的迁移和侵袭

目的探讨micro RNA-449a(mi R-449a)在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌进展的作用机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)测定mi R-449a及其靶向调节分子c-Met在宫颈癌组织及正常宫颈标本(对照组)中的表达水平。构建转染mi R-449a高表组(mi R-449a组)、转染c-Met干扰质粒组(si RNA组)和相应的空载质粒组(mock组),q PCR检测mi R-449a和c-Met m RNA表达量;免疫印迹法检测c-Met、MMP2和MMP9蛋白水平变化;细胞划痕修复和Transwell侵袭试验进一步观测mi R-449a和c-Met对细胞迁移和侵袭能力的影响。结果 mi R-449a在宫颈癌组织中表达量低于对照组(P<0.05),c-Met m RNA在宫颈癌组织中的表达高于对照组(P<0.05),两者间呈负相关关系(r=-0.32,P<0.05)。在宫颈癌细胞Hela细胞中过表达mi R-449a后,c-Met m RNA的表达水平降低(P<0.05),并且蛋白水平也明显降低。mi R-449a能显著抑制细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05),抑制c-Met表达后也能显著抑制细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。结论 mi R-449a通过靶向抑制c-Met的表达抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力。mi R-449a可能是潜在的宫颈癌筛查和诊断分子标志物,并为宫颈癌个体化治疗提供一个新的方向。

miR-449a在乳腺癌裸鼠皮下移植瘤模型中的作用

目的探究敲低miR-449a对裸鼠皮下乳腺癌细胞移植瘤生长的影响。方法本实验通过采用乳腺癌MCF-7细胞系建立乳腺癌的裸鼠皮下移植瘤动物模型,将含有shRNA-miR-449a表达的质粒稳定转染MCF-7细胞,将筛选的稳转细胞采取多点注射的方法注入裸鼠皮下,采用阴性质粒为阴性对照,PBS作为空白对照;处理裸鼠后检测成瘤体积并计算肿瘤生长抑制率;Real-time PCR检测肿瘤组织miR-449a、Notch 1表达情况;Western blot检测移植瘤组织内的Notch 1、β-catenin和E-cadherin蛋白水平;免疫组织化学技术检测肿瘤组织内Notch1、E-cadherin表达水平。结果移植瘤形成过程中裸鼠未出现死亡,肿瘤体积检测后发现miR-449a敲低后能够显著抑制肿瘤的生长(P<0.05);miR-449a在移植瘤组织内表达降低,同时Notch 1蛋白表达降低,β-catenin表达降低,而E-cadherin蛋白表达升高;免疫组化结果也显示Notch 1蛋白水平降低,E-cadherin蛋白的表达水平升高(P<0.05)。结论敲低miR-449a可能是通过下调Notch 1、β-catenin蛋白水平,促进E-cadherin蛋白表达,从而抑制乳腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长。

中国人群miR-449a单核苷酸多态性与胃癌易感性的相关性研究

目的 探讨miR-449a rs112310158基因多态性与胃癌易感性的关系。方法 共纳入448例胃癌患者和452例健康对照者。miR-449a rs112310158基因型检测采用聚合酶链反应结合直接测序方法。miR-449a表达水平检测采用荧光定量PCR方法。此单核苷酸多态性位点功能由RT-PCR和免疫组化试验验证。结果 相对于对照组,胃癌病例组在吸烟者（OR=1.345,95%CI=1.028-1.761）、饮酒者（OR=1.910,95%CI=1.465-2.490）、有肿瘤家族史者（OR=4.178,95%CI=1.554-11.231）、幽门螺杆菌感染率较高者（OR=1.428,95%CI=1.098-1.857）,差异均具有统计学意义。相较AA基因型,GG基因型显著增加胃癌的发病风险（OR=2.542,95%CI：1.304-4.954,P=0.005）。相较于A等位基因,携带G等位基因的个体罹患胃癌的风险升高（OR=1.279,95%CI：1.012-1.617,P=0.043）。GG型患者比AA型患者miR-449a表达水平下降。与AA基因型相比,miR-449a靶基因PRKCE在GG基因型胃癌患者中有更高的表达。结论 该研究发现miR-449a rs112310158是胃癌的遗传易感因素之一。

miR-449a在乳腺癌组织中的表达及生物信息学分析

探讨miR-449a在乳腺癌组织中的表达及其在乳腺癌发生发展过程中的作用。利用实时荧光定量PCR检测83例乳腺癌和癌旁组织中miR-449a的相对表达量,发现miR-449a在乳腺癌组织中的表达水平高于癌旁组织,并与肿瘤组织学级别、大小、雌激素受体状态和孕激素受体状态有关(P<0.05)。miR-449a在三阴性乳腺癌中的表达水平显著低于管腔型。使用Kaplan-Meier Plotter数据库进行生存分析,结果显示在三阴性乳腺癌中miR-449a低表达组总生存率显著低于高表达组,而在管腔B型乳腺癌中miR-449a高表达组总生存率显著降低(P<0.05)。利用ENCORI数据库预测得到靶基因186个,通过metascape数据库进行富集分析,发现其功能涉及间充质细胞分化、细胞迁移、内分泌抵抗、粘附连接、肌动蛋白细胞骨架调节以及NOTCH、TGF-β、Wnt、PI3K-Akt等介导的信号通路。通过string数据库进行蛋白互作网络分析,并使用Cytoscape软件筛选出由NOTCH1、JAG1和cyclin D1等蛋白构成的关键子网络。应用ENCORI数据库分析miR-449a与NOTCH途径靶基因的相关性,发现miR-449a与NOTCH1在乳腺癌组织中的表达呈负相关。本研究结果表明miR-449a在乳腺癌组织中的表达具有明显的异质性,可通过影响多种信号通路参与肿瘤发展过程,调控NOTCH信号通路可能是其在乳腺癌中的重要机制。

miR-449a通过Trim11影响高糖培养的肾小球系膜细胞增殖

目的探讨在高糖培养的系膜细胞中miR-449a与Trim11结合对细胞增殖的调控作用。方法 RT-qPCR检测miR-449a在高糖(25 mmol/L)和低糖(5.5 mmol/L)培养的系膜细胞中的表达;EdU检测miR-449a及Trim11对系膜细胞增殖的影响;生物信息学预测miR-449a与Trim11的结合位点;双荧光素酶验证miR-449a与Trim11靶向作用;Western blot检测上调、下调miR-449a后Trim11蛋白的变化。结果与低糖组比较,miR-449a在高糖培养的系膜细胞中的表达显著降低(P<0.01);双荧光素酶证实miR-449a直接靶向Trim11,过表达miR-449a后,细胞增殖减少,Trim11蛋白水平显著降低(P<0.01);沉默miR-449a,细胞增殖增加,Trim11蛋白水平显著上调(P<0.01);沉默Trim11后,抑制miR-449a对于细胞增殖促进作用被阻止。结论 miR-449a可抑制系膜细胞增殖,其机制可能与抑制靶基因Trim11的表达有关,可能是糖尿病肾病的重要保护性因子。

miR-449a通过下调HDAC1表达抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移

目的:分析miR-449a对人非小细胞肺癌细胞株A549增殖、侵袭和迁移的影响。方法:通过Real-time PCR检测人肺成纤维细胞MRC-5、人非小细胞肺癌细胞株A549和HCC827中miR-449a和组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)的表达水平。利用CCK-8法和Transwell法分析miR-449a对A549细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。使用生物信息软件分析miR-449a的靶向集合位点,并构建荧光素酶报告基因质粒,通过荧光素酶报告基因法分析miR-449a对HDAC1的靶向调控作用。通过Western blot分析miR-449a和HDAC1表达水平对A549细胞增殖及EMT相关分子表达水平的影响。建立裸鼠皮下瘤模型分析miR-449a和HDAC1对A549细胞体内增殖的影响。结果:miR-449a在MRC-5细胞中表达水平显著高于A549(P<0.0001)和HCC827(P<0.01);HDAC1在MRC-5细胞中表达水平显著低于A549(P<0.0001)和HCC827(P<0.01)。CCK-8法检测显示在A549细胞中转染miR-449a能够显著抑制其增殖。Transwell法检测显示在A549细胞中转染miR-449a能够显著抑制其侵袭和迁移(P<0.0001)。生物信息学预测显示miR-449a能够靶向结合HDAC1的3'-UTR;双荧光素酶报告基因分析显示,miR-449a能够靶向作用于HDAC1的3'-UTR抑制萤光素酶表达,Real-time PCR的结果表明过表达miR-449a能够显著抑制HDAC1的表达。在A549细胞中转染miR-449a或针对HDAC1小干扰RNA(siRNA)均能够下调HDAC1的表达,抑制细胞体内、外增殖;同时E-cadherin和ZO-1的表达水平下降,而N-cadherin、Fibronectin和Vimentin的表达水平增加。结论:miR-449a通过靶向抑制HDAC1的表达,抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

前列腺癌组织中miR-449a、miR-493-5p表达与临床病理参数及预后的关系

目的检测miR-449a、miR-493-5p在前列腺癌组织中的表达水平,探究miR-449a、miR-493-5p表达与前列腺癌患者临床病理参数和预后之间的关系。方法选取2013年2月至2015年3月在常州市第七人民医院住院的125例前列腺癌患者的石蜡组织样本及其相应的癌旁组织样本作为研究对象。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验检测组织中miR-449a、miR-493-5p表达水平,同时分析miR-449a和miR-493-5p表达与患者临床病理参数之间的关系,分析miR-449a、miR-493-5p表达与患者预后关系。结果与癌旁正常组织相比,前列腺癌组织中miR-449a、miR-493-5p表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。前列腺癌组织中miR-449a表达水平与Gleason评分、骨转移及肿瘤TNM分期有关(P<0.05);miR-493-5p表达水平与前列腺特异性抗原(PSA)、Gleason评分、骨转移及肿瘤TNM分期有关(P<0.05)。生存分析结果显示,miR-449a高表达患者的术后5年总生存率高于miR-449a低表达患者,差异具有统计学意义(P<0.05);miR-493-5p高表达患者的5年总生存率高于miR-493-5p低表达患者,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论前列腺癌组织中miR-449a和miR-493-5p均表现为低表达,且与部分临床病理参数相关,两者对前列腺癌患者的预后均有一定的预测价值。

bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c靶基因预测及生物信息学分析

【目的】试验旨在对bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的序列保守性、转录因子和靶基因进行生物信息学预测和分析,探究其影响精子发生的作用机制,为研究其生物学功能及作用机制提供指导和思路。【方法】利用miRBase数据库获取不同物种的bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c序列并进行相似性分析;通过TargetScan、miRWalk、miRDB等方法预测bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因,对获得的靶基因集合分别进行GO功能和KEGG通路富集分析;通过AnimalTFDB获取共同调控bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的转录因子,并构建TF-miRNA-mRNA作用网络。【结果】bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c在不同物种间高度保守。预测得到2个转录因子和49个候选靶基因,这些靶基因主要富集在精子发生、钙离子依赖性胞吐的调节、胰岛素分泌的调节等GO条目,以及HIF-1信号通路、甲状腺激素信号通路、Wnt信号通路等KEGG通路。bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c与上游转录因子NR2C2和HIC1,下游靶基因AXL、E2F3、DAAM1等共同构成的作用网络通过调控减数分裂、细胞周期、细胞凋亡、精子细胞能量代谢等生物过程影响精子发生。【结论】bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c通过上游转录因子和下游靶基因组成的分子调控网络共同调节精子发生过程。

真核生物表达成熟体miR-449a及其生物学活性的研究

通过分子克隆技术将pre-miR-449a及其上下游200 bp序列克隆至pcDNA3.0多克隆位点,采用脂质体转染该载体至人宫颈癌Hela细胞中,Real-Time PCR检测载体的表达能力,同时使用荧光淬灭法检测表达产生的miRNA的生物学活性。结果表明:转染实验组载体的Hela细胞miR-449a的表达明显升高,而对照组表达几乎无变化,显示真核表达载体pcDNA3.0可以高效表达miRNA;此外,目的质粒与报告质粒共转染Hela细胞后绿色荧光明显淬灭而对照组荧光未淬灭,证明表达的miRNA具有生物学活性。

miR-449a-5p调控Bax对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡的影响及其机制研究

目的:探讨miR-449a-5p对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡的影响和机制。方法:将肺泡上皮细胞AECⅡ分为6组,依次为对照组、肺炎链球菌组、miR-NC组、miR-449a-5p组、miR-449a-5p+pcDNA3.1组和miR-449a-5p+pcDNA3.1-Bax组,除对照组外,其他组均用肺炎链球菌处理细胞。酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测细胞培养液上清中白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-10(IL-10)的含量;流式细胞术检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR(qPCR)检测细胞中miR-449a-5p的表达水平;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。双荧光素酶报告实验和Western blotting验证miR-449a-5p和Bax的靶向关系。结果:与对照组相比,肺炎链球菌组细胞凋亡率和IL-6含量显著升高,IL-10含量和miR-449a-5p的表达水平显著降低(P<0.05)。与miR-NC组相比,miR-449a-5p组细胞凋亡率和IL-6含量显著降低,IL-10含量和miR-449a-5p的表达水平显著升高(P<0.05)。与miR-449a-5p+pcDNA3.1组相比,miR-449a-5p+pcDNA3.1-Bax组细胞凋亡率和IL-6含量显著升高,IL-10含量和miR-449a-5p的表达水平显著降低(P<0.05)。结论:miR-449a-5p通过负性调控Bax表达抑制肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡。