非小细胞肺癌患者血清外泌体中miR-539的临床意义及生物学功能研究

目的:分析非小细胞肺癌患者预后相关的外泌体miRNA的临床意义,并通过实验验证其功能,作为肺癌诊断和治疗的生物标志物。方法:从公共数据库下载非小细胞肺癌患者血清外泌体和肺癌组织的miRNA表达谱及临床数据;分别利用R语言“limma”“survival”和“survminer”包进行miRNA的差异表达分析和生存分析;通过靶基因富集分析预测miRNA生物学功能并分析其与免疫细胞浸润的相关性;在两种肺癌细胞中敲低miRNA,通过CCK-8、EdU和Transwell实验分析其对细胞增殖和迁移的影响;收集过表达miRNA肺癌细胞的外泌体,处理人正常支气管上皮细胞BEAS-2B并分析生物学功能变化。结果:基于差异分析和单因素COX分析,选定has-miR-539-5p(miR-539)进一步探究其与多个肿瘤相关信号通路和免疫系统相关;相关性分析表明miR-539表达与多种免疫细胞浸润显著相关;敲低miR-539能够显著降低肺癌细胞增殖和迁移能力,而过表达miR-539肺癌细胞外泌体处理正常肺细胞能够使其获得恶性细胞特征,包括增殖和迁移能力的增强。结论:miR-539能够调控肺癌细胞增殖和迁移能力,并且在非小细胞肺癌患者肿瘤组织和血清外泌体中上调,对患者诊断和预后具有重要的指导意义。

miR-539抑制乳腺癌细胞MCF-7迁移的作用机制分析

利用定量PCR检测其在乳腺癌细胞系中表达,Transwell检测其对细胞迁移的作用,利用TargetScan7.1、RNA22、miRDB、miRTarbase、DAVID和GEPIA分析miR-539的靶基因、生物功能及组织表达。结果表明,miR-539在乳腺癌组织低表达,且在4种乳腺癌细胞系中表达存在差异,抑制MCF-7的迁移,在物种间高度保守;174个靶基因主要富集在RNA降解、雌激素信号通路(P<0.01);GEPIA分析结果显示42个靶基因在乳腺癌和正常组织中存在表达差异。

miR-539-5p通过靶基因TPX2调控胃癌细胞增殖、侵袭、迁移的分子机制

目的探究微小RNA-539-5p(miR-539-5p)调控胃癌细胞增殖、侵袭、迁移的分子机制。方法采用实时定量PCR与Western印迹分别检测胃癌细胞系MGC-803、MKN-45、AGS与正常胃黏膜上皮细胞系GES-1中miR-539-5p、Xklp2靶蛋白(TPX2) mRNA及蛋白的表达。采用miR-539-5p mimics、si-TPX2及miR-539-5p、pcDNA-TPX2共转染胃癌MGC-803细胞。双荧光素酶报告基因实验验证miR-539-5p与TPX2的靶向关系。Western印迹检测细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达。结果 miR-539-5p在胃癌细胞中比正常胃黏膜上皮细胞显著下调(P<0.05);体外过表达miR-539-5p可抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭,促进p21、p27表达,而抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9、MMP-14表达;TPX2是miR-539-5p的靶基因,且miR-539-5p可负向调控TPX2的表达;下调TPX2表达较si-NC组胃癌细胞增殖、迁移及侵袭能力明显受到抑制;与miR-539-5p+pcDNA组比较,上调TPX2表达可回复miR-539-5p过表达对MGC-803细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。结论 miR-539-5p可通过下调TPX2表达而抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭,其可能作为未来胃癌治疗的潜在治疗靶点。

miR-539增强顺铂对非小细胞肺癌耐药株的杀伤作用研究

目的研究miR-539对顺铂诱导的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)耐药细胞株凋亡的影响。方法通过荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测NSCLC细胞系和人正常支气管上皮细胞16HBE中miR-539表达情况;通过转染miR-539建立miR-539过表达细胞系,观察miR-539过表达对顺铂抑制NSCLC细胞生长率的影响,检测细胞凋亡水平及相关基因的表达。结果 NSCLC细胞系中miR-539表达水平低于人正常支气管上皮细胞(P<0.01)。阴性对照组培养48、72、96 h NCI-H460细胞增殖率均明显低于空白对照组,转染miR-539组培养不同时间NCI-H460细胞增殖率均明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。阴性对照组和转染miR-539组NCI-H460细胞凋亡率高于空白对照组(P<0.05)。阴性对照组和转染miR-539组的Bcl-2、Bcl-x L基因表达量均低于空白对照组,且转染miR-539组低于阴性对照组,而Bim、Bax、P53、Myc基因表达量高于空白对照组,且转染miR-539组高于阴性对照组(P<0.05,P<0.01)。结论 miR-539能够增强顺铂对NSCLC耐药细胞株的杀伤作用,可作为NSCLC基因治疗的有效靶点。

miR-539靶向GPD1L对雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型凋亡和自噬的影响

目的研究miR-539对雨蛙素(Cerulein)诱导的急性胰腺炎(AP)细胞模型凋亡和自噬的影响及分子机制。方法用15 nmol/L Cerulein处理胰腺腺泡A42J细胞4、8、12、24 h,建立AP模型。淀粉酶试剂盒检测细胞上清中淀粉酶(AMY)水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清中白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-539和甘油3-磷酸脱氢酶1样蛋白(GPD1L)mRNA的水平,Western印迹检测GPD1L、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、膜型LC3(LC3Ⅰ)、胞浆型LC3(LC3Ⅱ)、Beclin1和p62的表达,流式细胞术测定细胞凋亡率,双荧光素酶报告系统验证miR-539与GPD1L间的调控关系。结果与Control组相比,Cerulein组AR42J细胞中miR-539含量显著升高(P<0.05),GPD1L mRNA和GPD1L蛋白含量显著降低(P<0.05),与Control组相比,Cerulein组AR42J细胞中miR-539含量和细胞凋亡率Bax、LC3-ⅡCerulein均显著升高,Bcl-2、p62含量显著降低(P<0.05);与Cerulein+anti-miR-con组相比,Cerulein+anti-miR-539组结果相反(P<0.05)。与miR-con组相比,过表达miR-539的Cerulein处理组细胞中GPD1L mRNA和蛋白含量均显著降低(P<0.05);抑制miR-539组的Cerulein处理组细胞中GPD1LmRNA和蛋白含量均显著升高(P<0.05)。与Cerulein+pcDNA-NC组相比,Cerulein+GPD1L组的AR42J细胞中GPD1L Bcl-2、p62水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率、Bax、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和Beclin1含量均显著降低(P<0.05)。与Cerulein+anti-miR-539+si-con组相比,Cerulein+anti-miR-539+si-GPD1L组AR42J细胞中GPD1L、Bcl-2、p62、细胞凋亡率均显著下降,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和Beclin1、Bax显著升高(P<0.05)。结论miR-539通过靶向GPD1L调控Cerulein诱导的胰腺AR42J细胞凋亡和自噬。

miR-539对非小细胞肺癌细胞增殖凋亡的影响及机制

目的探究分析非小细胞肺癌细胞H460中miR-539表达差异及凋亡相关基因的影响,阐明其作用机制。方法采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测非小细胞癌细胞系H460和健康人体的支气管上皮细胞(16HBE)miR-539表达。实验分为空白对照组、阴性对照组及转染组(miR-539);MTT法检测各组细胞的增殖作用,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,qPCR检测细胞凋亡相关基因表达。结果健康人体支气管上皮细胞的miR-539表达水平为1.01±0.09,高于NCI-H460的0.21±0.03,差异具有统计学意义(P<0.05)。48、72、96 h时,空白组和阴性对照组细胞增殖能力高于转染组;空白组细胞增殖能力高于阴性对照组(P<0.05)。转染组、阴性对照组和空白组细胞凋亡率分别为(88.4±5.7)%、(64.5±8.2)%和(58.1±5.2)%,差异有统计学意义(P<0.05)。转染组、阴性对照组和空白组细胞凋亡率分别为(88.4±5.7)%、(64.5±8.2)%和(58.1±5.2)%,差异有统计学意义(P<0.05)。转染组Bcl-xL、Bcl-2基因表达水平低于阴性对照组和空白组(P<0.05),Bax、Bim、Myc、P53基因表达水平高于阴性对照组和空白组(P<0.05)。结论miR-539在非小细胞肺癌细胞中低表达,上调miR-539表达可增强顺铂对肺癌细胞的增殖抑制作用以及凋亡水平。

姜黄素作用于miR-539对胃癌细胞生物学行为影响的研究

背景:研究发现,姜黄素可调控多种miRNAs表达来影响肿瘤细胞的生物学行为,而姜黄素是否通过调控miR-539表达影响胃癌细胞的生物学行为尚未明确。目的:探讨姜黄素通过调控miR-539表达对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等生物学行为的影响及其作用机制。方法:收集49例胃癌患者组织,将胃癌AGS、SGC7901细胞分为空白组、姜黄素组、阴性对照组、miR-539 mimics组、miR-539抑制剂组、抑制剂对照组、miR-539抑制剂+姜黄素组。采用qRT-PCR法检测胃癌组织和细胞中miR-539 mRNA表达。MTT法检测细胞增殖,划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测APOBEC3B、c-Myc、cyclin D1、claudin-1、N-cadherin蛋白表达。结果:胃癌组织和细胞中miR-539表达均显著低于对照组(P<0.05),且miR-539表达与肿瘤分期有关(P<0.05)。姜黄素可剂量依赖性地上调胃癌细胞中miR-539表达(P<0.05)。与相应对照组相比,miR-539 mimics组、姜黄素组胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力均明显降低,细胞凋亡率明显增加,APOBEC3B、c-Myc、cyclin D1、claudin-1、N-cadherin蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论:MiR-539在胃癌组织中表达降低,姜黄素可通过上调miR-539表达来抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭,并诱导细胞凋亡。

三叶苷调控miR-539-5p表达保护缺氧缺糖心肌细胞损伤研究

目的:探讨三叶苷对缺氧缺糖心肌细胞损伤的保护作用及机制。方法:采用不同浓度的三叶苷作用于缺氧缺糖诱导的心肌细胞H9C2,试剂盒检测丙二醛(MDA)含量、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,流式细胞术、蛋白质印记(Western blot)检测细胞凋亡以及B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)和Bcl相关X蛋白(Bax)蛋白表达,实时荧光定量PCR(RTq PCR)检测miR-539-5p表达。转染miR-539-5p模拟物至H9C2细胞,检测过表达miR-539-5p对缺氧缺糖诱导的H9C2细胞损伤的影响。结果:三叶苷作用于缺氧缺糖诱导的H9C2细胞后,细胞中MDA含量、LDH释放量、细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平显著降低,SOD活性、Bcl-2蛋白和miR-539-5p表达水平显著升高(P<0.05)。过表达miR-539-5p后,缺氧缺糖诱导的H9C2细胞中MDA含量、LDH释放量、细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平显著降低,SOD活性、Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。抑制miR-539-5p表达可减弱三叶苷对缺氧缺糖诱导的H9C2细胞MDA含量、LDH释放量、SOD活性、凋亡,以及Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。结论:三叶苷可有效降低缺氧缺糖诱导的心肌细胞损伤,其机制与上调miR-539-5p表达有关。

miR-539通过靶向调控DCLK1抑制非小细胞肺癌的侵袭能力

目的探讨非小细胞肺癌组织中miR-539的表达水平及其抑制肺癌细胞侵袭的作用机制。方法通过基因表达数据库dbDEMC分析miR-539在非小细胞肺癌组织及正常肺组织中的表达量差异。根据235例miR-539高表达的非小细胞肺癌患者和102例miR-539低表达的非小细胞肺癌患者随访资料,分析miR-539与非小细胞肺癌患者预后的相关性。利用生物信息预测结合双荧光素酶报告基因实验研究miR-539的潜在靶基因。在肺癌A549细胞中分别过表达miR-539、转染miR-539抑制剂,利用Transwell法检测肺癌A549细胞的侵袭能力。结果dbDEMC数据库资料显示miR-539在非小细胞肺癌组织中的表达量显著低于其在正常肺组织中的表达量(P=3.10×10-4)。生存分析发现miR-539的表达量与肺癌患者预后正相关(P=0.033)。通过在线生物信息学预测结合双荧光素报告实验发现miR-539在转录水平减少DCLK1的表达。Transwell侵袭实验发现,过表达miR-539可以抑制肺癌A549细胞的侵袭能力,而沉默miR-539可以增加A549细胞的侵袭能力。结论miR-539是肺癌发生中的抑癌基因,可能是通过靶向沉默DCLK1的表达,而抑制肺癌细胞A549的侵袭能力。

EM患者子宫内膜组织的ESCs中miR-539表达水平及其靶向MMP-9对ESCs侵袭和迁移的影响

目的探究子宫内膜异位症(EM)患者子宫内膜组织的子宫内膜基质细胞(ESCs)中miR-539表达水平,以及miR-539靶向基质金属蛋白酶9(MMP-9)对ESCs侵袭和迁移的影响。方法收集60例EM患者子宫内膜异位组织及47例正常子宫内膜组织,分离ESCs原代培养,实时荧光定量PCR检测miR-539和MMP-9 mRNA表达水平,并采用双荧光素酶报告基因检测其靶向关系。利用Lipofectamine 3000试剂转染ESCs,并将其分为miR-539 mimics组、mimics NC组、miR-539 inhibitors组和inhibitors NC组。CCK-8检测各组细胞增殖情况;划痕实验检测细胞迁移;Transwell检测细胞侵袭;Western blot法检测各组细胞中MMP-9蛋白表达水平。结果EM组miR-539 m RNA水平显著低于对照组,MMP-9 mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)。双荧光素酶报告实验结果显示miR-539与MMP-9具有明显的靶向关系(P<0.05)。与mimics NC组相比,miR-539 mimics组ESCs细胞增殖、划痕愈合率、侵袭细胞数量及MMP-9蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与inhibitors NC组相比,miR-539 inhibitors组ESCs细胞增殖、划痕愈合率、侵袭细胞数量及MMP-9蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。结论miR-539可靶向调节MMP-9表达水平,影响ESCs的增殖、迁移和侵袭。

miR-539通过抑素调控非小细胞肺癌的细胞增殖、迁移和凋亡

目的:探讨miR-539通过抑素调控非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移和凋亡的机制。方法:选择2019年1月至2020年1月期间武汉科技大学附属孝感医院收治的6例NSCLC手术患者作为研究对象进行回顾性分析,术中采集未实施放化疗的NSCLC标本,置于液氮中保存,提取总RNA,通过miR-539在NSCLC中靶基因的筛选确定抑素是miR-539的候选靶基因。采用反转录荧光定量聚合酶链式反应技术定量检测miR-539、抑素,CCK-8检测细胞增殖,划痕试验检测细胞迁移,流式细胞术检测细胞凋亡。比较靶向抑制抑素组、过表达miR-539组和低表达miR-539组的细胞增殖、迁移及凋亡情况检测。结果:过表达组抑素mRNA相对表达量(1.00±0.07)明显高于阴性对照组(0.20±0.02)(t=26.917,P<0.001),细胞增殖能力(4.21±1.21)较阴性对照组(8.09±0.97)降低(t=6.128,P<0.001),细胞迁移能力[(514.28±36.14)个]较阴性对照组[(1500.33±156.25)个]降低(t=15.060,P<0.001),细胞凋亡率[(53.21±7.59)%]较阴性对照组[(40.25±6.21)%]增高,(t=3.237,P=0.009)。抑制抑素组细胞增殖能力(11.32±0.36)较低表达组(9.03±0.28)和过表达组(5.69±0.08)高(F=672.994,P<0.001),细胞凋亡率[(38.56±5.24)%]较低表达组[(47.26±4.98)%]和过表达组[(58.61±6.32)%]低(F=19.735,P<0.001)。结论:抑素作为miR-539的候选靶基因,两者均可作为抑癌基因抑制癌细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡。miR-539对NSCLC细胞增殖、迁移、凋亡的调控作用与抑素具有紧密的关系。

miR-539-5p对雄激素非依赖性前列腺癌细胞阿帕鲁胺敏感性及恶性表型的影响及机制研究

目的研究miR-539-5p对雄激素非依赖性前列腺癌细胞C4-2B阿帕鲁胺(ARN-509)敏感性及恶性表型的影响及相关机制。方法获取去势抵抗性前列腺癌、去势敏感性前列腺癌及良性前列腺组织,并选取处于对数生长期C4-2B前列腺癌细胞,传代扩增后,采用miR-539-5p质粒对C4-2B细胞系进行转染,共分为空白组,转染组(miR-539-5p质粒)及对照组(对照质粒)。qPCR检测组织及3组细胞中miR-539-5p、AR及热休克因子结合蛋白1(heat shock factor binding protein 1,HSBP1)基因的表达含量;Western blot检测3组细胞雄激素受体AR及HSBP1的蛋白表达含量;Transwell实验检测3组细胞的侵袭迁移能力;CCK-8法检测3组细胞的增殖能力及雄激素受体拮抗剂ARN-509的半抑制浓度(IC_(50));平板克隆实验检测3组细胞的克隆形成能力。结果组织qPCR提示:良性前列腺组织、前列腺癌去势敏感患者肿瘤组织及前列腺癌去势抵抗患者肿瘤组织miR-539-5p的表达分别为0.29±0.04、0.17±0.02、0.07±0.01,AR的表达分别为0.13±0.02、0.28±0.04、0.79±0.11,HSBP1的表达分别为0.20±0.03、0.38±0.04、0.72±0.11。相比良性前列腺组织和前列腺癌组织,前列腺癌去势抵抗患者的组织中AR及HSBP1基因的表达含量较高,miR-539-5p表达较低(P<0.001)。细胞qPCR提示:空白组、对照组及转染组miR-539-5p表达分别为1.00±0.09、1.07±0.11、7.19±0.51,AR的表达分别为1.00±0.10、1.03±0.14、0.51±0.08,HSBP1的表达分别为1.00±0.10、0.96±0.12、0.97±0.11。转染组细胞的miR-539-5p表达显著高于对照组及空白组,AR基因表达含量明显低于对照组及空白组,HSBP1基因表达水平无显著差异。Western blot显示:空白组、对照组及转染组AR的蛋白表达分别为1.00±0.10、1.12±0.22、0.72±0.16,HSBP1的蛋白表达分别为1.00±0.10、0.94±0.18、0.48±0.11,转染组细胞的AR及HSBP1的蛋白表达明显少于对照组及空白组。Transwell实验显示:转染组侵袭及迁移细胞明显少于对照组及空白组。CCK-8法及平板克隆实验结果显示:转染组细胞的增殖能力及克隆形成数明显少于对照组及空白组。与空白组及对照组细胞相比,转染组细胞ARN-509的IC_(50)值显著降低。结论miR-539-5p可能通过干扰HSBP1的翻译水平,抑制细胞的恶性表型及去势抵抗。

miR-539通过靶向EMT调节宫颈癌细胞增殖、转移

目的 探讨微小RNA-539(miR-539)对人宫颈癌细胞C33a增殖、转移的影响及转移机制。方法 收集宫颈癌组织及癌旁正常组织并检测组织中miR-539 mRNA含量;以人正常宫颈上皮细胞系HUCECs作为对照,筛选宫颈癌细胞中miR-539 mRNA相对表达量最低的细胞株;甲基噻唑基四唑(MTT)法检测宫颈癌细胞的增殖;Transwell小室法检测miR-539对细胞侵袭、迁移能力的影响;实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检法、蛋白免疫印迹(Western blot)法检测波形蛋白(vimentin)相对表达量。结果 RT-qPCR结果显示,宫颈癌癌组织中miR-539含量较癌旁正常组织显著减少(P<0.05);与人正常宫颈上皮细胞系HUCECs相比,宫颈癌细胞C33a的miR-539明显降低(P<0.05);当成功过表达C33a细胞中miR-539后,与空白对照组相比,mimics-miR-539组增殖能力减弱(P<0.05);与空白对照组相比,过表达miR-539组细胞侵袭和迁移能下降(P<0.05);mimics-miR-539组vimentin mRNA及蛋白相对表达量较对照组显著降低(P<0.05)。结论 miR-539在人宫颈癌表达降低,在人宫颈癌细胞C33a中,过表达miR-539能够抑制其增殖、迁移,迁移机制可能与下调vimentin表达有关。