miR-99a-3p对中波紫外线影响系统性红斑狼疮B淋巴细胞自噬作用的研究

目的探讨中波紫外线(UVB)加重系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者自噬进而导致疾病进展的潜在机制,有望为SLE的靶向治疗提供新的思路。方法免疫磁珠法分离正常人外周血B淋巴细胞(B细胞),流式细胞仪读取B细胞比例,miR-99a-3p激动剂、拮抗剂、阴性对照转染Ball-1及B细胞,50 mJ/cm^(2)的UVB照射转染后细胞,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-99a-3p、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(EIF4EBP1)、微管相关蛋白1轻链3 B(LC3B)、溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP-2A)mRNA表达水平。结果转染miR-99a-3p激动剂可以降低靶基因EIF4EBP1及自噬相关基因LC3B、LAMP-2A的表达,转染拮抗剂可以提高EIF4EBP1及LC3B、LAMP-2A的表达,UVB可引起Ball-1和B细胞miR-99a-3p表达减少,而EIF4EBP1、LC3B、LAMP-2A的表达升高。结论强紫外线辐射可通过降低miR-99a-3p表达,加重SLE患者自噬,进而导致SLE进展。

款冬花多糖通过调控miR-99a/PI3K/Akt通路影响食管癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的探索款冬花多糖通过miR-99a/PI3K/Akt通路影响食管癌细胞增殖、迁移和侵袭。方法MTT检测款冬花多糖(10、20、40、80、160 mg/L)对食管癌细胞Eca109细胞存活的影响;Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭;Western blot检测MMP2、MMP9、Cyclin D1、p-PI3K和p-Akt蛋白表达;RT-PCR检测miR-99a表达。在Eca109细胞中转染miR-99a、anti-miR-99a并使用80 mg/L款冬花多糖进行处理,观察其在细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。结果款冬花多糖抑制Eca109细胞增殖、迁移、侵袭及MMP2、MMP9、CyclinD1、p-PI3K、p-AKT蛋白表达(P<0.05),促进miR-99a表达(P<0.05)。过表达miR-99a抑制Eca109细胞中Cyclin D1、MMP2、MMP9蛋白表达,减少细胞存活率、迁移细胞数和侵袭细胞数(P<0.05)。低表达miR-99a部分逆转款冬花多糖对细胞增殖、迁移、侵袭、CyclinD1、MMP2、MMP9、p-PI3K和p-AKT蛋白表达的抑制作用。结论款冬花多糖通过调控miR-99a/PI3K/Akt通路抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭。

和厚朴酚通过上调miR-99a/b抑制HeLa细胞增殖和侵袭

目的探究和厚朴酚对宫颈癌He La细胞增殖和侵袭的影响,并初步探讨相关分子机制。方法将培养的对数期的人宫颈癌He La细胞分为对照组、Scramble组、mi R-99a/b mimic组、和厚朴酚高、中、低剂量组。MTT实验用于检测不同干预对He La细胞增殖的影响,Transwell小室用于测定He La的侵袭能力,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)用于检测细胞中mi R-99a、mi R-99b的表达情况,蛋白免疫印迹(WB)检测细胞中cyclin D1、MMP7蛋白表达。结果和厚朴酚高、中、低剂量组细胞增殖率和侵袭细胞数均明显低于对照组和DMSO溶剂组(P <0. 05),并呈剂量依赖性。minic组和厚朴酚高、中、低剂量组mi R-99a和mi R-99b表达水平明显高于对照组和Scramble组(P <0. 05);随着和厚朴酚剂量的增加,He La细胞中mi R-99a和mi R-99b表达水平逐渐升高。和厚朴酚高、中、低剂量组mi R-99a和mi R-99b表达水平明显高于对照组和Scramble组(P <0. 05),且呈剂量依赖性。和厚朴酚高、中、低剂量组He La细胞增殖率和侵袭能力明显低于对照组和Scramble组,呈现剂量依赖性。Western blot法检测结果显示,minic组和和厚朴酚高、中、低剂量组cyclin D1和MMP7表达水平明显低于对照组和Scramble组(P <0. 05);随着和厚朴酚剂量的增加,He La细胞中cyclin D1和MMP7表达水平明显降低。结论和厚朴酚可能通过上调mi R-99a/b表达,进而抑制宫颈癌He La细胞增殖和侵袭,为宫颈癌的靶向治疗提供一定的理论依据。

TGF-β1调节miR-99家族对卵巢癌细胞恶性行为的影响

目的:探讨TGF-β1通过调节miR-99家族各miRNA对卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭行为的影响。方法:TGF-β1、miR-99家族各miRNA模拟物、miR-99家族各miRNA抑制物分别刺激或转染卵巢癌细胞系A2780及SKOV3。实时荧光定量PCR检测miR-99家族各miRNA表达水平。CCK-8法检测细胞增殖能力。划痕实验检测细胞迁移能力。Transwell检测细胞侵袭及迁移能力。结果:与空白对照组比较,TGF-β1处理组卵巢癌细胞中miR-99家族各miRNA表达上调(P<0.01),卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭能力明显增强(P<0.05);miR-99家族各miRNA模拟物转染组细胞增殖减弱(P<0.05),迁移及侵袭能力增强(P<0.05);miR-99家族各miRNA抑制物转染组细胞增殖增强(P<0.05),迁移及侵袭能力减弱(P<0.05)。结论:TGF-β1可通过调节miR-99家族表达水平促进卵巢癌细胞系A2780及SKOV3的增殖、迁移及侵袭能力,TGF-β1及miR-99家族表达水平可能作为卵巢癌恶性程度预测及预后判断的参考指标。

miR-99a表达调控机制及抑制LPS所致内皮细胞炎症作用

研究炎症相关转录因子NFκB对miR-99a生成的调控作用,并进一步研究miR-99a对LPS所致内皮炎症的保护作用及机制,为动脉粥样硬化疾病的抗炎治疗提供依据.采用PROMO软件对miR-99a的启动子进行分析.构建不同长度的miR-99a启动子区段载体,并将这些载体与NF-κB共转染,双荧光报告基因检测NF-κB对报告基因表达的影响.采用EMSA法和ChIP法进行验证.采用ELISA法对炎症相关因子TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1进行检测,Westernblot法对NF-κB、IκB、β-actin、HistonH1和mTOR蛋白进行检测.结果表明,NF-κB可直接作用于miR-99a启动子的-1643至-1652位点,促进miR-99a的表达.在内皮细胞中,LPS（10mg·L-1）可明显抑制miR-99a的表达（降低为正常对照组的10.4%）.MiR-99a过表达可明显抑制LPS导致的炎性因子表达升高,抑制mTOR的上调、NF-κB的核易位.miR99a对LPS损伤的内皮细胞具有保护作用,为动脉粥样硬化抗炎治疗的潜在靶点.

miR-99a对乳腺癌细胞侵袭和迁移的负向调控机制研究

目的探讨miR-99a对乳腺癌细胞侵袭及迁移的影响,并初步分析其影响乳腺癌细胞侵袭及迁移的可能分子机制。方法利用荧光实时定量PCR检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7中miR-99a的表达。运用脂质体介导的转染方法分别将miR-99a模拟物(miR-99a mimics)、miR-99a抑制物(miR-99a inhibitors)以及相应对照miRNA转染MDA-MB-231和MCF-7细胞,通过Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭力;采用Transwell迁移实验及划痕实验检测细胞的迁移能力;利用生物信息学方法预测miR-99a的靶基因,并对靶基因进行验证。结果(1)高转移潜能的MDA-MB-231细胞中miR-99a表达明显低于低转移潜能的MCF-7细胞,划痕实验中转染miR-99a mimics的与转染control mimics的MDA-MB-231细胞比较迁移能力显著减弱(P<0.05),而MCF-7细胞转染miR-99a inhibitors后迁移能力明显增强(P<0.01)。(2)Transwell的侵袭及迁移实验显示,转染miR-99a mimics后MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移能力明显减弱(P<0.01);MCF-7细胞转染miR-99a inhibitors后迁移能力增强(P<0.01),而侵袭能力基本不变(P>0.05)。(3)生物信息学方法预测徼管相关蛋白(MTMR3)是miR-99a的靶点,实时定量PCR和3'UTR荧光素酶报告基因实验验证了该靶点。(4)干扰了MTMR3后MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力明显减弱。结论(1)miR-99a对乳腺癌细胞的侵袭及迁移发挥负向调控作用。(2)miR-99a可能通过靶向于MTMR3发挥其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的调控作用。

肿瘤相关巨噬细胞相关性miR-99a对子宫内膜癌细胞生长和侵袭的调控作用

背景与目的:肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)浸润与肿瘤进展密切相关,但作用机制尚不明确,因此,探索miR-99a对单核巨噬细胞极化的影响及其对子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)细胞生长、侵袭的影响。方法:检测EC组织中巨噬唾液酸蛋白(macrosialin)CD68表达并分析其与临床病理学特征之间的关系;运用人EC细胞系HEC-1B、RL95-2培养上清液诱导人单核细胞U937向TAM(M2型巨噬细胞)分化;将人工合成的miR-99a模拟物片段转染至诱导后的巨噬细胞,转染后运用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)及流式细胞术检测巨噬细胞相关因子CD68、CD163以及巨噬细胞甘露糖受体(mcrophage mannose receptor)CD206表达量变化,并运用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测巨噬细胞分泌相关细胞因子IL-12、IL-4和IL-10分泌量变化;将转染miR-99a的诱导后巨噬细胞与EC细胞共培养,运用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和transwell法检测其对EC细胞增殖和侵袭能力的影响,并初步分析其可能的作用机制。结果:EC组织CD68高表达并与肿瘤肌层浸润及血管生成呈正相关;肿瘤细胞培养上清液成功诱导单核细胞向M2型TAM极化。转染miR-99a后单核细胞组CD68及CD163表达较对照组下降(P<0.01),而CD206表达差异无统计学意义(P>0.05),流式细胞术进一步证实上述表达变化;ELISA结果发现,转染miR-99a诱导后巨噬细胞中IL-12分泌增多(P<0.01),而IL-4、IL-10分泌减少(P<0.01),提示巨噬细胞向M2型极化受抑制。将诱导后巨噬细胞与EC细胞共培养,共培养后EC细胞增殖侵袭能力较对照组增加,而转染miR-99a模拟片段至诱导后巨噬细胞能够抑制其对增殖(P<0.01)及侵袭能力的促进作用(P<0.05)。诱导后巨噬细胞中过表达miR-99a后细胞中mTOR及其通路受到抑制。结论:EC间质巨噬细胞浸润与肿瘤肌层浸润及血管新生相关,miR-99a能够逆转单核细胞向M2表型极化,并抑制EC细胞介导TAM的促EC细胞生长和侵袭作用,其作用可能通过调控mTOR通路产生。

miR-99a模拟物提高膀胱癌细胞化疗药物敏感性的机制研究

目的:研究miR-99a模拟物对膀胱癌细胞增殖及化疗药物敏感性的影响及相关分子机制。方法:培养膀胱癌BIU-87细胞株,随机分为对照组、吡柔比星组、miR-99a组、吡柔比星+miR-99a组,分别采用不含血清的培养基、1.0μg/mL的吡柔比星、miR-99a的模拟物以及miR-99a的模拟物联合1.0μg/mL的吡柔比星进行处理,处理后12、24、48h时分别测定细胞活力以及PI3K、AKT、ABCE1、MRPS5的表达量。结果:吡柔比星组、miR-99a组、吡柔比星+miR-99a组的细胞活力值以及PI3K、AKT、ABCE1、MRPS5的表达量均显著低于对照组,吡柔比星+miR-99a组的细胞活力值以及PI3K、AKT、ABCE1、MRPS5的表达量均显著低于吡柔比星组和miR-99a组。结论:miR-99a模拟物能够通过靶向抑制PI3K/AKT信号通路及下游ABCE1、MRPS5基因表达的方式抑制膀胱癌细胞增殖、增加膀胱癌细胞对化疗药物的敏感性。

肿瘤抑制因子miR-99a对口腔鳞状细胞癌细胞迁移、增殖和凋亡的影响

目的探讨肿瘤抑制因子miR-99a对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞迁移、增殖和凋亡的影响。方法逆转录-定量聚合酶链反应分析miR-99a在OSCC细胞系中的表达水平。CCK-8试验评估细胞增殖,细胞划痕和Transwell试验检测细胞迁移和侵袭能力。流式细胞仪检测miR-99a对HN4细胞周期和凋亡的影响。结果 miR-99a的上调抑制了HN4和SCC6细胞增殖,miR-99a的上调抑制了HN4和SCC6细胞侵袭和迁移能力。流式细胞仪分析证实,miR-99a的上调促进了HN4和SCC6细胞的凋亡,细胞周期中G1期的百分比明显升高,在G2期和S期的百分比明显降低。结论 miR-99a可能是OSCC肿瘤发生中的肿瘤抑制因子。

腺病毒介导miR-99a过表达抑制人结肠癌HCT-8细胞的生长抑制及其作用机制

目的探讨miR-99a过表达对人结肠癌HCT-8细胞的生长抑制及其作用机制。方法构建miR-99a的重组腺病毒Ad5-miR-99a,并感染人结肠癌HCT-8细胞。采用甲基化特异性PCR检测miR-99a、抑癌基因SOCS1和P16的甲基化水平;采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测miR-99a、DNAC5胞嘧啶甲基转移酶、SOCS1和P16的表达情况;采用MTT法、细胞集落形成和流式细胞术检测HCT-8细胞的体外增殖凋亡情况;采用裸鼠体内荷瘤实验检测HCT-8细胞体内成瘤性。结果成功构建miR-99a腺病毒载体Ad5-miR-99a。Ad5-miR-99a感染HCT-8细胞后,Ad5-miR-99a组细胞中miR-99a表达显著高于空载腺病毒组和空白对照组(P<0.05),而其甲基化水平显著低于空载腺病毒组和空白对照组(P<0.05);Ad5-miR-99a组细胞中DNAC5胞嘧啶甲基转移酶表达显著低于空载腺病毒组和空白对照组(P<0.05);Ad5-miR-99a组细胞中SOCS1和P16表达显著高于空载腺病毒组和空白对照组(P<0.05),而其甲基化水平显著低于空载腺病毒组和空白对照组(P<0.05)。MTT法、细胞集落形成、流式细胞术和裸鼠体内荷瘤实验显示,Ad5-miR-99a组细胞的体外增殖和体内成瘤能力显著低于空载腺病毒组和空白对照组(P<0.05)。结论 miR-99a可显著抑制人结肠癌HCT-8细胞的体外增殖和体内成瘤能力,其机制可能与miR-99a过表达导致DNMT1表达升高,降低抑癌基因SOCS-1和P16甲基化程度,使得SOCS-1和P16高表达,从而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。

miR-99a对口腔鳞癌增殖能力的影响

目的:探讨miR-99a在口腔鳞状细胞中的表达及对口腔鳞癌细胞生物学行为的影响。方法:检索GEO数据库中与口腔鳞癌相关的miRNA芯片进行二次分析。检测63例口腔鳞癌组织和口腔鳞癌细胞株内miR-99a的表达,分析其与临床病理指标及患者预后之间的关系。上调miR-99a的表达,检测其对口腔鳞癌细胞生长和克隆形成的影响,并通过Targetscan等软件预测其靶基因。采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果:GSE103931芯片显示,miR-99a在口腔鳞癌中下调最显著,且miR-99a也在口腔鳞癌细胞株内显著低表达。miR-99a的表达与患者T分期、病理分级和预后密切相关。上调miR-99a的表达可抑制口腔鳞癌细胞增殖;而抑制miR-99a的表达,则促进口腔鳞癌细胞增殖。通过Targetscan等软件发现,mTOR是miR-99a的靶基因,且与miR-99a的表达呈负相关。结论:miR-99a在口腔鳞癌组织和细胞系中低表达。上调miR-99a能抑制口腔鳞癌细胞株SCC25和SCC9的增殖能力,其机制是通过调控mTOR的表达而实现。

MiR-99a调控CTDSPL影响儿童急性髓性白血病细胞增殖及凋亡

目的探讨miR-99a对儿童急性髓性白血病(AML)的影响及其作用机制,为寻找新的靶向治疗方法提供理论依据。方法用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测57例AMLL患儿及10例对照患儿的骨髓标本中miR-99a的表达;在细胞系水平通过对miR-99a过表达或抑制表达,利用MTT细胞增殖及双染凋亡试验研究miR-99a对AML细胞增殖、凋亡的影响。用在线软件预测miR-99a可能的靶基因,并通过双荧光报告及蛋白印迹技术对其靶基因进行验证。结果miR-99a在AML患儿初诊时高表达,在完全缓解(CR)时低表达;miR-99a促进AML细胞的增殖,抑制其凋亡;采用双荧光报告及蛋白印迹技术在细胞系中验证出CTDSPL可能是miR-99a的靶基因;并通过蛋白印迹技术在AML患儿标本中验证出miR-99a抑制CTDSPL蛋白的表达。结论miR-99a通过靶向负调控CTDSPL基因影响AML细胞增殖及凋亡,靶向抑制miR-99a表达可能成为治疗AML的一个新策略。

miR-99a-3p靶向调控CD36基因对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响及其机制

目的探讨miR-99a-3p对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的影响及其机制。方法将小鼠足细胞分为对照(NG)组、高糖(HG)组、miR-NC组、miR-99a-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-99a-3p组、HG+miR-NC组、HG+miR-99a-3p组、HG+si-NC组、HG+si-CD36组、HG+miR-99a-3p+pcDNA组、HG+miR-99a-3p+pcDNA-CD36组,转染均采用脂质体法。qRT-PCR检测miR-99a-3p和CD36 mRNA的表达水平;Western印迹检测蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。结果高糖可以促进CD36的表达,抑制miR-99a-3p的表达,且促进小鼠足细胞凋亡。过表达miR-99a-3p表达和抑制表达CD36可保护高糖刺激的小鼠足细胞损伤。miR-99a-3p靶向调控CD36的表达,过表达CD36能逆转miR-99a-3p过表达对高糖刺激小鼠足细胞损伤的保护作用。结论miR-99a-3p可能通过下调CD36对高糖刺激的小鼠足细胞损伤起保护作用。

miR-99a通过下调RRM2抑制人子宫颈癌HeLa细胞系增殖、迁移和侵袭

目的探讨miR-99a与核糖核苷酸还原酶小亚基M2(RRM2)的靶向关系,并分析二者对人子宫颈癌(CC)HeLa细胞系增殖、侵袭及迁移的影响。方法将HeLa细胞,分为对照组(control)、阴性对照组(inhibitor-NC)、抑制miR-99a表达组(miR-99a-inhibitor)、共转染组(RRM2-siRNA+miR-99a-inhibitor)。MTT法、平板集落实验检测细胞增殖;划痕实验、Transwell小室法检测细胞迁移、侵袭;Western blot检测RRM2、细胞增殖核抗原(PCNA)、E-钙黏附蛋白(E-cadherin)、N-钙黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)蛋白表达;免疫荧光法检测E-cadherin、N-cadherin、vimentin定位及表达;生物信息学及双荧光素酶报告基因实验验证miR-99a与RRM2靶向关系;RT-qPCR检测细胞中miR-99a、RRM2 mRNA水平。结果下调miR-99a表达,可增高HeLa细胞增殖率(100.00比128.86±4.25,P<0.05);上调集落形成率、划痕愈合率、侵袭细胞数;增加RRM2、PCNA、N-cadherin与vimentin蛋白表达,降低E-cadherin蛋白表达(P<0.05)。抑制RRM2表达能减轻下调miR-99a对HeLa细胞生物学行为的影响(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验及RT-qPCR证实miR-99a与RRM2存在靶向关系(P<0.05)。结论抑制miR-99a可能靶向上调RRM2表达并促进HeLa细胞增殖,有望成为CC新的潜在治疗靶点。

环状RNA _005647通过结合miR-99b-5p抑制心肌细胞中肥厚相关基因的表达

目的研究环状RNA circRNA_005647抑制心肌肥厚相关基因表达的作用机制。方法建立血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)灌注诱导的心肌肥厚小鼠模型。原代分离获得C57BL/6乳小鼠心肌细胞(NMVC),AngⅡ处理NMVC建立心肌细胞肥大模型。利用NMVC,分别感染circRNA_005647重组腺病毒(rAd-circRNA_005647)和转染miR-99b-5p模拟物来研究对NMVC肥大的影响。通过双荧光素酶报告基因实验和RNA Pull-down实验验证circRNA_005647与miR-99b-5p的结合作用。实时荧光定量PCR和Western blot检测NMVC中心肌肥厚相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果在AngⅡ诱导的小鼠心肌肥厚模型和心肌细胞肥大模型中,circRNA_005647及其宿主基因肌球蛋白IXA(Myo9a)表达升高。过表达circRNA_005647可抑制AngⅡ诱导的NMVC中肥厚相关基因心房钠尿肽(Anp)和肌球蛋白重链7(Myh7)基因表达升高。circRNA_005647与miR-99b-5p间存在结合作用。过表达circRNA_005647可抑制miR-99b-5p促心肌细胞肥大的作用。结论circRNA_005647通过结合miR-99b-5p发挥抑制心肌细胞肥大的作用。

miR-99a对帕金森模型细胞活力及ROS水平的影响

目的:分析miR-99a对帕金森病细胞模型作用。方法:采用Western blotting以及Real-time PCR方法,对miR-99a以及其靶基因FZD5表达水平进行研究。采用CCK-8方法,检测细胞存活力。结果:过表达miR-99a,可将MPP+抑制PC12细胞存活作用明显缓解,该作用是通过调控miR-99a/FZD5轴完成的。结论:miR-99a在帕金森病细胞模型中,可对MPP+导致的PC12细胞存活抑制作用明显缓解,是通过靶向及下调FZD5实现的。

三唑磷对斑马鱼miR-99及其预测靶标ckmt2的表达的影响

在农药三唑磷作用下,miRNA的表达发生改变;并通过与靶基因的配对,从而调控基因的表达。本文采用荧光定量PCR和Western blot等方法对miR-99及其潜在靶基因ckmt2的表达变化进行了研究。结果表明,三唑磷处理后miR-99表达是对照的0.062倍,助剂处理是对照的0.414倍,表达下调;三唑磷处理后ckmt2基因是其对照的0.91倍,助剂处理是其对照的0.89倍,在mRNA水平变化不显著。三唑磷及助剂处理后,斑马鱼的总蛋白含量减少,CKMT2蛋白含量增加,采用独立样本检验方法分析结果表明,处理前后的CKMT2蛋白质含量差异显著。综上所述,在三唑磷作用下,斑马鱼miR-99对潜在靶标基因ckmt2的表达可能存在抑制作用,miR-99表达的降低致使对ckmt2表达抑制的作用减弱,从而提高ckmt2的表达。

miR-99a-5p在MDS患者骨髓中的表达及功能分析

目的:检测miR-99a-5p在骨髓增生异常综合症(MDS)患者中的表达,利用生物信息学预测其靶基因并进行功能分析,探讨miR-99a-5p在MDS的发生发展中可能的作用。方法:利用qRT-PCR技术检测miR-99a-5p在初治MDS患者骨髓中的表达量,分析其与MDS临床病理参数的相关性;运用靶基因在线预测软件Targetscan、Miranda和Microcosm预测其可能的靶基因,取预测结果的交集作为miR-99a-5p在MDS中的潜在靶基因。结果:与正常对照组相比,MDS患者骨髓中miR-99a-5p表达升高(P<0.001)。按IPSS的预后评分,将MDS患者分为相对低危组(包括低危险组和中危1组)和相对高危组(包括中危2组和高危组)发现,在相对低危组中miR-99a-5p的表达量是正常对照组的2.40倍(P<0.001),相对高危组中miR-99a-5p的表达量是对照组的6.66倍(P<0.001),相对高危组中miR-99a-5p表达量是相对低危组的2.80倍(P<0.001);转白血病组(t-MDS)中miR-99a-5p的表达量是对照组的6.35倍(P<0.001)。相关分析显示,患者骨髓miR-99a-5p表达量与原始细胞比例呈显著正相关(P<0.001);而与染色体核型、外周血血象无明显相关。利用靶基因在线预测软件预测mi R-99a-5p的可能靶基因,并结合文献,得出ST5可能是mi R-99a-5p在MDS中的潜在靶基因。结论:mi R-99a-5p在MDS患者中表达明显上调,且随着危险度的增加其表达呈上升趋势,并可能通过负性调控靶基因ST5参与MDS的发病。

miR-99b-5p通过靶向TRIB1基因调控乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的研究

目的:探讨miR-99b-5p靶向Tribbles同源蛋白1(Tribbles pseudokinase 1,TRIB1)基因调控人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡。方法:采用RT-PCR检测人乳腺上皮细胞HBL-100和乳腺癌MCF-7细胞中miR-99b-5p的表达水平,采用Western blotting检测人乳腺上皮细胞HBL-100和乳腺癌MCF-7细胞中TRIB1蛋白表达量。在MCF-7细胞中转染miR-99b-5p mimics或mimics对照,分别记为miR-99b-5p组和miR-NC组,RT-PCR检测细胞中miR-99b-5p表达变化,Western blotting检测TRIB1蛋白表达量,MTT法检测细胞增殖能力,AnnexinV-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡水平,双荧光素酶报告基因实验检测miR-99b-5p和TRIB1的靶向关系。结果:与人乳腺上皮细胞HBL-100比较,乳腺癌MCF-7细胞中miR-99b-5p的表达量明显降低(P<0.01),而TRIB1蛋白的表达明显升高(P<0.01)。与miR-NC组比较,miR-99b-5p组MCF-7细胞中miR-99b-5p的表达量升高(P<0.05),TRIB1蛋白表达水平降低(P<0.05),细胞增殖能力减弱(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测实验结果显示,miR-99b-5p能够明显降低TRIB1-Wt MCF-7细胞相对荧光素酶活性(P<0.01),而对TRIB1-Mut MCF-7细胞相对荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)。结论:miR-99b-5p在乳腺癌MCF-7细胞中呈低表达,TRIB1蛋白呈高表达,过表达miR-99b-5p能够靶向抑制TRIB1阻碍MCF-7细胞增殖并促进细胞凋亡。

miR-99b通过下调mTOR的表达抑制胃腺癌细胞系SGC-7901的增殖及迁移

目的:探讨hsa-miR-99b在胃腺癌细胞系的表达及其影响胃腺癌细胞系增殖和迁移的潜在作用机制。方法:Real-time PCR检测miR-99b在人胃上皮细胞系GES-1和人胃腺癌细胞系SGC-7901、BGC-823、MGC-803中的表达。用人工合成的miR-99b模拟物转染SGC-7901细胞构建过表达miR-996细胞系,转染对照模拟物作为对照组,CCK-8法检测过表达miR-99b的SGC-7901细胞的增殖情况,Transwell法检测SGC-7901细胞系的迁移情况,Western blotting检测SGC-7901细胞系中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)的表达情况。结果:miR-99b在胃腺癌细胞系中的表达水平显著低于胃上皮细胞系,其中以SCG-7901细胞最甚。转染miR-99b模拟物48 h后,实验组SCG-7901细胞增殖能力低于对照组(0.20±0.00 vs 0.27±0.02,P<0.05);与转染对照模拟物的细胞相比,转染24 h后,实验组SCG-7901穿膜细胞数低于对照组[(226.67±25.17)vs(523.33±25.17)个,P<0.05]。miR-99b可下调人胃腺癌细胞系SGC-7901中m TOR蛋白的表达。结论:miR-99b在胃腺癌细胞系中的表达明显下调,miR-99b抑制人胃腺癌细胞系SGC-7901增殖和迁移的作用可能与下调m TOR表达有关。