mtr-miR156a在奶牛乳腺上皮细胞的靶基因筛选鉴定及其调控奶牛乳蛋白生物合成的研究

本试验旨在探究苜蓿miR156a(mtr-miR156a)在奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)的靶基因及其对乳蛋白合成的调控作用,为进一步研究外源性植物微小RNA(miRNA)调控奶牛乳蛋白合成提供研究基础。首先通过联川生物云平台、TargetScan和RNAhybrid在线网站预测和筛选出mtr-miR156a调控蛋白合成的候选靶基因,然后构建候选靶基因丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 56 kDa调节亚基delta亚型(PPP2R5D)和磷酸肌醇3激酶调控亚单位2(PIK3R2)的重组质粒,并通过双荧光素酶验证鉴定出靶向基因,最后运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测过表达mtr-miR156a对BMECs乳蛋白合成相关基因表达以及酪蛋白编码基因mRNA和蛋白表达的影响。结果表明:1)双荧光素酶报告基因和qRT-PCR鉴定了mtr-miR156a可以靶向结合PPP2R5D和PIK3R2并极显著降低其表达水平(P<0.01)。2)与mimic NC相比,过表达mtr-miR156a极显著降低丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)、核糖体蛋白S6激酶beta-1(S6K1)、真核翻译起始因子4B(eIF4B)、核糖体蛋白S6(RPS6)、结节性硬化症复合物亚基2(TSC2)、脑富集Ras同源物(RHEB)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和真核翻译起始因子4E(eIF4E)相对表达量(P<0.01),极显著提高蛋白激酶B1(Akt1)和真核翻译起始因子4E结合蛋白1(EIF4EBP1)相对表达量(P<0.01)。3)与mimic NC处理相比,过表达mtr-miR156a极显著提高酪蛋白alpha S1(CSN1S1)、酪蛋白alpha S2(CSN1S2)、酪蛋白beta(CSN2)和酪蛋白kappa(CSN3)相对表达量(P<0.01)。4)ELISA结果表明,与mimic NC处理相比,过表达mtr-miR156a显著提高BMECs培养液上清液中α酪蛋白和β酪蛋白含量(P<0.05),极显著提高上清液中κ酪蛋白含量(P<0.01)。综上所述,mtr-miR156a通过靶向结合位于磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信号通路的PPP2R5D和PIK3R2,调控PI3K/Akt/mTOR信号通路PDK1、S6K1、eIF4B、RPS6、Akt1、TSC2、RHEB、mTOR、eIF4E和EIF4EBP1等基因表达,上调BMECs中编码酪蛋白基因mRNA和蛋白表达水平,参与BMECs中酪蛋白的调控。

ptr-MIR156a启动子克隆及特征分析

miR156a在火炬松、烟草、拟南芥中的表达与病原菌侵染密切相关。为了研究miR156a在杨树与病原菌互作过程中分子机制,以毛果杨全基因组DNA为材料,预测ptr-MIR156a启动子的大概区域,设计特异性PCR引物,克隆了ptr-MIR156a上游启动子区500、1 000和1 500 bp片段,并进行顺式作用元件分析,然后分别构建了绿色荧光蛋白(GFP)报告基因植物表达载体,最后通过原生质体的瞬时表达体系对其进行了活性检测。结果表明,1 500 bp片段活性最高,1 000 bp片段次之,500 bp片段活性最低。

茶树miR156a靶基因SPL6和SPL9的克隆及表达分析

MicroRNA156a-SQUAMOSA promoter binding-like protein(miR156a-SPLs)参与植物生长阶段转变、叶片形态建成和逆境胁迫等复杂的生理过程。基于茶树转录组数据,从茶树中克隆出2个SPL家族成员——CsSPL6和CsSPL9。CsSPL6 cDNA全长2 318 bp,ORF框长1 668 bp,编码555个氨基酸;CsSPL9 cDNA全长1 954 bp,ORF框长1 116 bp,编码371个氨基酸;CsSPL6和CsSPL9都有典型SBP结构域和Csn-miR156a识别位点。时空表达特性分析表明,Csn-miR156a在芽中表达量最高,第7叶中最低,与CsSPL6和CsSPL9呈负调控关系;不同品种(系)表达特性分析表明,Csn-miR156a的表达模式与新梢生长量、光合指标结果一致,与CsSPL6和CsSPL9表达模式相反,说明Csn-miR156a、CsSPL6和CsSPL9参与茶树生长过程,Csn-miR156a和CsSPLs可作为初步判断品种生长势强弱的分子手段;高温处理4个品种(系)表达特性表明Csn-miR156a与CsSPL9呈负相关,推断茶树在高温胁迫下Csn-miR156a可能通过负调控CsSPL9来增加耐高温性。Csn-miR156a负调控CsSPLs在茶树生长发育、逆境胁迫中发挥作用,为茶树生长和抗逆机制提供理论依据。

芥蓝miR156a家族进化特性及表达分析

miRNA广泛参与植物的发育过程。芥蓝形态多样,叶片发育因品种而异。为了解miR156a家族的进化特性及其在芥蓝叶片发育中的表达模式。该研究对芥蓝miR156a成员及其前体pre-miR156a成员进行生物信息学分析,比较不同品种芥蓝叶形的差异,并采用qRT-PCR方法分析芥蓝不同组织部位中pre-miR156a的表达水平、以及叶形相似的芥蓝品种‘翠宝’和‘改良香菇’中不同类型叶片的pre-miR156a成员及其靶基因的表达水平。结果表明:(1)多序列比对和进化树分析发现芥蓝miR156a家族成员和pre-miR156a-3p_1在进化过程中高度保守;二级结构预测发现pre-miR156a每个成员均能形成茎环结构并包含2~3个miR156a成员序列;靶基因预测显示miR156a-5p和miR156a主要靶向SPL,而miR156a-3p_1则靶向CTPS等不同的基因。(2)‘翠宝’和‘改良香菇’芥蓝的叶形最为相似,qRT-PCR分析显示,pre-miR156a在‘翠宝’营养生长期的叶片中高度表达。(3)pre-miR156a成员在‘翠宝’和‘改良香菇’不同类型叶片中差异表达,pre-miR156a主要在成熟叶和菇叶中表达,而pre-miR156a-3p_1和pre-miR156a-5p在第一片真叶中表达量更高。(4)靶基因分析的结果在不同品种中呈现不同趋势,‘翠宝’成熟叶中SPL10/15高表达,SPL2表达量降低;‘改良香菇’中SPL10在成熟叶和菇叶中表达降低,SPL15在菇叶中高表达,SPL2在不同类型叶片中表达无差异。研究认为,miR156a成员及其靶基因SPL2/10/15可能参与调控芥蓝叶片发育,不同品种中作用的靶基因可能存在差异,从而导致了各品种芥蓝叶片发育的差异。

miR156a在不同海棠花瓣色泽形成中的作用

【目的】为了揭示miR156a对观赏海棠花瓣花色苷形成的调控作用。【方法】以观赏海棠‘王族’、‘印第安魔力’、‘当娜’3个品种不同时期花瓣为试验材料,确定pre-miR156a基因序列,并对miR156a的靶基因进行预测。通过分光光度法和qRT-PCR分析花瓣中花色苷含量和miR156a相对表达量的差异。【结果】3个品种不同时期海棠花瓣中miR156a的含量有明显差异,miR156a随着花瓣增长相对表达量逐渐增多,随着颜色变深相对表达量逐渐减少。【结论】在海棠花瓣中,miR156a负调控花色苷生物合成。

观赏海棠‘王族’miR156a的克隆及功能验证

【目的】为了揭示miR156a对观赏海棠花色苷形成的调控作用。【方法】以观赏海棠红叶品种‘王族’为试验材料,确定pre-miR156a基因序列,构建pre-miR156a的过表达和沉默载体后转入‘王族’组培苗叶片。用分光光度法分析花色苷含量以及实时荧光定量检测花色苷相关基因的表达量。【结果】结果表明,在叶片中过表达miR156a花色苷含量降低;沉默miR156a花色苷含量上升。【结论】在观赏海棠中,miR156a负调控‘王族’叶片中花色苷生物合成。

水曲柳miR156a克隆及功能的初步分析

【目的】水曲柳是木犀科白蜡树属落叶大乔木,为我国东北地区三大珍贵硬阔之一,国家储备林计划重要造林树种。MicroRNAs(miRNAs)是一种单链内源性非编码RNA,水曲柳miR156的克隆及功能的初步分析,为水曲柳miRNAs的系统研究奠定基础。【方法】对水曲柳miR156家族进行分析,克隆水曲柳miR156的初级转录本,构建了pROKⅡ-FmmiR156-GFP过表达载体,并对水曲柳下胚轴进行了遗传转化。【结果】生物信息学分析表明,水曲柳miR156前体序列与拟南芥和杨树亲缘性较远。在水曲柳中有4条miR156前体序列,并且均构成一条成熟序列。克隆水曲柳miR156初级转录本序列,构建过表达载体,以水曲柳下胚轴为外植体进行遗传转化,与FmSPL2-OE相比FmmiR156-OE出芽较多。预测水曲柳miR156靶向14条FmSPLs基因,转录表达分析结果证实了FmSPL2、FmSPL9和FmSPL13是miR156的下游靶基因,并被miR156下调表达。检测出芽相关基因(WUS)表达量,明确FmmiR156可以上调WUS基因的表达。【结论】首次克隆得到了水曲柳miR156的初级转录本序列,明确miR156可以靶向并负调控FmSPLs基因,还可以促进水曲柳下胚芽的再生,该结果的获得对水曲柳miRNA功能的进一步研究具有一定的参考价值。

黄瓜CsamiR156a及其靶基因CsSPLs的生物信息学分析

miR156是植物中广泛存在的一类miRNA,在逆境胁迫和植物生长发育过程中发挥了重要作用。为了深入研究CsamiR156a在黄瓜果实膨大中的功能,本研究采用生物信息学方法对CsamiR156a及其靶基因Cs SPLs(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)进行分析。结果表明,CsamiR156a前体序列具有完整的茎环结构,成熟序列高度保守。CsamiR156a有11条靶基因,编码8个不同的CsSPLs蛋白序列。8个CsSPLs蛋白均属不稳定蛋白,多数为碱性蛋白、亲水性蛋白。二级结构均为混合型,无信号肽和跨膜结构,均为可溶性蛋白。8个CsSPLs蛋白大部分都含有糖基化位点,有17~83个不等的磷酸化位点,均定位于细胞核。系统进化树表明,黄瓜CsSPLs蛋白与甜瓜、中国南瓜和印度南瓜等物种SPLs蛋白遗传距离较近;蛋白序列分析发现,各物种SPLs蛋白均含有SBP(Squamosa promoter binding protein)功能结构域,且其位置和数量大体相同,说明SPLs蛋白功能保守。据此推测,CsamiR156a通过靶向调控Cs SPLs基因表达参与了黄瓜果实膨大。该研究结果为今后深入研究黄瓜果实膨大的分子机理提供了一定的科学依据。

工业大麻miR156基因家族在NaHCO_(3)胁迫下的表达模式及生物信息学分析

工业大麻miR156基因家族在碱性盐胁迫响应过程中发挥重要的调控作用,为探究工业大麻miR156基因家族响应NaHCO_(3)胁迫的分子机制,以盐碱耐受型工业大麻品种火麻一号为供试材料,利用生物信息学和qRT-PCR方法,对miR156基因家族进行分析。结果表明,工业大麻miR156家族基因与芦笋、野草莓、苹果和大豆的亲缘关系较近。2条工业大麻pre-miR156序列,产生一条相同的miR156成熟体,且成熟体的保守性较高。在NaHCO_(3)胁迫后的24 h内,工业大麻miR156基因表达量随胁迫时间的延长呈先升高后降低再升高的趋势。该结果为进一步研究工业大麻miR156基因家族及其靶基因的调控网络提供理论依据。

马尾松miR156a基因表达及其耐低磷功能分析

马尾松(Pinus massoniana)是中国主要的针叶用材树种,具有速生、丰产、适应性强、经济价值高等优良特性。miR156家族是植物中含量丰富且高度保守的一类microRNA(miRNA),在调控植物叶片的形成、开花时间、侧根发育以及非生物胁迫中具有重要作用。为探究miR156a在马尾松幼苗响应低磷胁迫过程中的功能,比较了不同物种的miR156a的成熟序列,发现mi R156a在不同物种中序列的保守性高。对马尾松幼苗进行低磷胁迫,并分析miR156a在马尾松幼苗的时空表达模式;将Pma-miR156a转化至烟草植株并进行磷胁迫处理,观察转基因烟草地下部分根系的结构变化。结果表明,miR156a在马尾松幼苗地上部分的表达量要大于地下部分,并在磷胁迫48 d时被显著诱导表达,磷胁迫处理后的转基因植株的根系较野生型更为发达。综上所述,miR156a主要在马尾松幼苗的地上部分表达,推测其可能通过远距运输至地下部分来调节植物根系结构的变化进而响应磷胁迫,本研究为揭示马尾松耐低磷机制以及抗性种质的选育提供了一定的理论参考。

miR156调控猕猴桃果实抗坏血酸代谢机制初探

抗坏血酸(AsA)是一种重要的营养物质,猕猴桃果实富含AsA,然而猕猴桃内外果皮AsA含量调控机制尚不清楚。因此,通过生理生化以及转基因手段,探究猕猴桃内外果皮AsA代谢差异的原因。研究表明,猕猴桃内外果皮AsA合成途径和循环途径基因表达存在显著差异,miR156的表达水平与果实AsA含量变化呈正相关,转基因验证miR156正调控猕猴桃果实中的抗坏血酸含量,miR156调控猕猴桃果实中的抗坏血酸合成和循环途径基因表达。

miR156调控菊花逆境响应与开花的表达特性研究

为明确菊花miR156及其靶基因CmSPL13在逆境胁迫应答和生长发育中的表达特性,该研究以菊花‘神马’为材料,采用高保真PCR技术扩增MiR156启动子序列,并分析该序列特性;通过激素(茉莉酸甲酯、水杨酸甲酯、生长素类似物NAA)和逆境胁迫(干旱、盐)处理,分析菊花miR156及其靶基因CmSPL13对激素和逆境胁迫的响应表达特征;并分析蔗糖处理下miR156表达特性与开花时间的关系,为miR156参与菊花生长发育与逆境响应的分子机制研究奠定基础。结果表明:(1)克隆获得了MiR156启动子1 584 bp,该启动子序列包含激素(茉莉酸、水杨酸和生长素)应答、厌氧和干旱诱导等逆境胁迫以及光响应等顺式作用元件。(2)茉莉酸甲酯处理下,miR156的表达水平在0~3 h显著上调,3 h后逐渐下降,呈现出先上升后下降的趋势,而其靶基因CmSPL13的表达量呈先下降后上升的趋势,在12 h达到峰值;水杨酸甲酯和生长素NAA处理下,miR156的表达在3 h显著下调,而后逐渐升高,在6~12 h时达到峰值,而后又逐渐下降,但CmSPL13的表达具有与之相反的趋势;PEG处理下,miR156的表达水平均低于处理前,且在6~24 h逐渐下调,其靶基因CmSPL13在6~12 h显著上调;盐处理下,miR156的表达水平在0~3 h显著上调,而后逐渐降低,CmSPL13的表达在6~12 h逐渐上调。(3)miR156的表达水平随着菊花叶片成熟度的增加而逐渐降低,而CmSPL13的表达逐渐升高。(4)蔗糖可以抑制miR156的表达,但蔗糖处理可显著提高开花相关基因CmFTL3、CmAP1L1和CmSOC1的表达,从而促进菊花开花,花期提前2.8 d。研究认为,菊花miR156及其靶基因CmSPL13有参与调控幼年期向成年期的功能,也存在糖信号抑制miR156的表达从而促进菊花开花的调控机制;茉莉酸和水杨酸可能在处理的后期拮抗调控菊花miR156及其靶基因的表达,并且可能参与盐胁迫的早期应答。

苜蓿miR156及其靶基因生物信息学分析

【目的】分析苜蓿miR156(mtr-miR156)基因家族的序列组成及基因表达功能,为mtr-miR156跨界调控的研究提供理论基础。【方法】应用PmiREN数据库检索并分析mtr-miR156家族成员成熟序列、茎环序列和成熟序列染色体定位信息,weblogo在线网站对mtr-miR156家族成熟序列、茎环序列进行保守性分析,DNAMAN软件分析茎环序列同源性,同时利用联川生物云平台和TargentScan在线网站预测并下载获得mtr-miR156a的靶基因、靶基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,通过RNAhybrid在线网站比对预测到的所有靶基因与mtr-miR156a的结合位点和结合自由能值,选择符合自由能值的靶基因进行靶基因功能分析。【结果】PmiREN数据库共检索到10个mtr-miR156家族成员;10个成员成熟序列共定位在3条染色体上;10个成员中有8个成员成熟序列完全一致,其余2个成员成熟序列高度保守;10个成员茎环序列中位于成熟序列位置的碱基与成熟序列完全一致;茎环序列同源树分析结果显示10个成员共分为3个分支,mtr-miR156g与其他成员的亲缘关系最远;经过GO功能富集分析发现,预测到牛体内的靶基因显著富集于转录调控功能、细胞膜组成以及ATP合成等;利用KEGG通路注释表明,预测到牛体内的靶基因显著集中于脂肪酸降解通路和Ras信号通路调节等通路中。【结论】苜蓿miR156基因家族可能会通过相关靶基因跨界调控奶牛体内脂肪酸降解、ATP合成、细胞炎症、乳脂乳蛋白合成代谢等作用。

菊花MIR156c基因的克隆与功能分析

以菊花‘Jinba’和拟南芥为试材,采用生物信息学、分子生物学方法,研究了菊花MIR156c基因的前体序列及二级结构、进化关系、表达模式、生长发育的功能,以期为菊花生长发育的分子机制提供参考依据。结果表明:克隆的菊花MIR156c的序列长度为212 bp。cmo-MIR156c能形成典型的茎环结构,在成熟序列的第11位具有特异性,与已报道的菊花miR156相比,第14位的碱基也不相同,进化分析显示关系较远。miR156的成熟序列保守性强,其前体序列其它部分差异较大,特别是发夹区。cmo-MIR156c在菊花各器官中存在表达差异,其中根和管状花表达量最高。cmo-MIR156c在拟南芥中异源表达后改变莲座叶数目、分枝数及开花时间等,并影响花和角果的发育。

陆地棉miR156基因家族生物信息学分析及靶基因预测

为探究miR156基因家族在陆地棉生长发育过程中的作用,本文通过BLAST、WebLogo、RNA Folding Form等生物信息学方法发现陆地棉miR156基因家族在染色体上成簇分布,前体均可形成稳定的茎环结构,碱基序列保守性较高。通过psRNATarget预测到大部分陆地棉miR156基因家族成员的靶基因为SPL转录因子。通过Excel对陆地棉7个组织的转录组数据进行分析,发现miR156基因家族成员存在组织特异性表达。本研究结果为探究陆地棉miR156基因家族成员在陆地棉生长发育过程的功能提供了基础。

杨树MIR156基因家族的进化与功能分化

为阐明杨树MIR156基因家族的进化过程和功能分化,研究了杨树MIR156基因家族的扩张模式、倍增时间、系统发育、表达方式、启动子元件和靶基因。结果表明:杨树MIR156基因家族主要通过染色体大片段重复实现扩张,而串联重复对此没有贡献;不同家族成员表达方式已分化,其中ptc-MIR156g/h/i/j表达活性最高;家族成员启动子顺式作用元件存在差异;杨树MIR156的靶基因包括29个SBP结构域蛋白质,由于成熟序列存在差异,家族成员调控的靶基因也表现出差异。说明杨树MIR156基因家族成员的功能已经分化,在杨树中可能形成了复杂的调控网络。

拟南芥miR156与miR399在低磷胁迫中的对话机制初探

为了进一步研究miR156与miR399在低磷响应过程中是否存在对话机制,采用杂交方法,将35S:MIM156(miR156功能降低拟南芥植株)与miR399f(miR399f超表达拟南芥植株)杂交获得杂交转基因植株35S:MIM156miR399f。采用原位显色法和根际酸化能力测定法,研究低磷胁迫下35S:MIM156、miR399f及35S:MIM156miR399f植株根际酸化情况,并测定其花青素和无机磷含量。结果表明,35S:MIM156植株的花青素含量较野生型(WT)植株显著降低,miR399f、35S:MIM156miR399f植株与WT无显著差异;35S:MIM156植株的酸化能力较WT显著降低,miR399f、35S:MIM156miR399f植株酸化能力均较WT显著增强;35S:MIM156、miR399f、35S:MIM156miR399f植株的无机磷含量均较WT显著升高。综合分析,推测在低磷条件下miR399参与了miR156调控的花青素积累和根际酸化过程,miR156和miR399共同参与磷平衡过程。

沉默miR156表达的mimicry156载体的构建及转化烟草的研究

miR156在植物营养生长阶段幼年期向成年期的转变过程中发挥重要的调控作用,其通过降解SPLs基因m RNA和翻译抑制调控靶基因的表达。通过定向改造拟南芥内源性Target mimicry IPS1(INDUCED BY PHOSPHATE STARVATION 1)构建了抑制miR156表达的mimicry156载体,并转化获得转基因烟草植株,转基因植株mimicry156对内源性miR156具有抑制作用。该方法为研究miR156在植物营养生长阶段的调控作用提供了方便有效的途径。

哈克尼西棉细胞质雄性不育系和保持系花发育不同时期miR156及靶基因TBCC的研究

本研究以棉花细胞质雄性不育系和保持系不同发育时期的花蕾为材料分析miR156和预测的靶基因TBCC(Tublin binding cofactor C)在花蕾中的表达水平及相互关系,并从棉花中克隆TBCC,探讨TBCC在棉花花粉发育过程中的作用。结果表明,不育系和保持系花蕾中miR156表达量随花药发育进程而显著增加,TBCC的表达量在两材料花药发育不同阶段均存在显著差异,其中在保持系中随着花药发育逐渐降低,而在不育系中该基因的表达水平一直维持在较低水平,推测不育性状可能与TBCC的表达有关。克隆得到TBCC基因的cDNA全长序列,命名为GhTBCC(基因登录号KC488331)。其CDS长度为1713 bp,编码570个氨基酸,分子量为62.79 kD,含有保守的TBCC和CARP结构域。GhTBCC与杨树、蓖麻、拟南芥的氨基酸序列相似性分别为81%、80%、77%。

小麦tae-MIR156前体基因的克隆及其靶基因TaSPL17多态性分析

Squamosa-promoter binding protein(SBP)-box基因是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物生长发育,其部分成员受miR156调控。文章克隆了小麦(Triticum aestivum)tae-MIR156前体基因,转录后能够形成茎环结构。小麦10个SBP-box基因中,仅TaSPL3和TaSPL17在编码区存在tae-miR156识别位点。SPL17在普通小麦的A基因组供体种乌拉尔图小麦(Triticum urartu,AA)UR209和B基因组供体种拟斯卑尔脱山羊草(Aegilops speltoides,BB)Y2001中均为多拷贝(SPL17-A1、SPL17-A2和SPL17-A3;SPL17-B1、SPL17-B2和SPL17-B3),在D基因组供体种粗山羊草(Aegilops tauschii,DD)Ae38中仅检测到一种序列(SPL17-D);SPL17-A2与SPL17-B2,SPL17-A3与SPL17-B3、SPL17-D两两之间序列的一致性程度均大于99%,且与普通小麦(中国春、衡观35和双丰收)的TaSPL17序列具有较高的一致性,提示它们可能来源于共同的祖先基因,并且在进化过程中高度保守。靶基因TaSPL17中的tae-miR156识别位点非常保守,在根据单株穗数和基因型多样性挑选的SubP1和SubP2群体中均未检测到tae-miR156识别位点存在变异碱基。