不同年龄小鼠骨髓间充质干细胞中miR203的差异及其对细胞增殖的调控

目的：探索不同年龄骨髓间充质干细胞中miR203的表达变化，及其对骨髓间充质干细胞自我更新的作用机制。方法分别分离培养4周龄和18～24月龄的Balb/c小鼠BMSCs，对比不同年龄小鼠BMSCs增殖潜能的差异，并检测不同年龄小鼠BMSCs中miR-203的表达变化差异，从而探讨miR-203在骨髓间充质干细胞增殖调节中的作用机制。结果根据干细胞贴壁特性获得了稳定的骨髓间充质干细胞，其在分化诱导条件下可获得经茜素红染色呈红色结节及油红O 染色显示有脂质沉淀，且成骨诱导后Ⅰ型胶原蛋白显著表达。在增殖条件下，与年轻BMSCs相比，老年BMSCs增殖（传代）能力明显下降。年轻小鼠（4周龄）BMSCs中miR-203远低于老年小鼠（18～24月龄）BMSCs中miR-203表达（P＜0．05）。结论年轻骨髓间充质干细胞增殖能力优于老年骨髓间充质干细胞，可能与miR-203表达较低有关。

血清miR-203和壳多糖酶3样蛋白1联合检测对肝显著纤维化/肝硬化的诊断价值

目的探讨微小RNA(miR)-203和血清壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单独及联合诊断肝显著纤维化/肝硬化的价值。方法将该院2022年1月至2022年12月住院的慢性乙型肝炎(CHB)患者80例纳入研究,同时选取体检健康者40例作为健康对照组。根据组织检查结果将纳入研究的CHB患者分为无/轻度纤维化组(50例)和肝显著纤维化/肝硬化组(30例)。检测各组血清miR-203和CHI3L1水平,肝纤维化4项[Ⅲ型前胶原(P-Ⅲ)、Ⅳ型胶原(C-Ⅳ)、层粘连蛋白(LN),透明质酸酶(HA)]和生化指标[丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)],计算天门冬氨酸氨基转移酶-血小板比值指数(APRI)、肝纤维化指数(FIB-4)。用非参数秩和检验进行组间各项指标的比较。用Spearman相关进行miR-203和CHI3L1与肝纤维化指标的相关性分析。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估miR-203和CHI3L1单独和联合对肝显著纤维化/肝硬化的诊断效能。结果miR-203与C-Ⅳ、HA、FIB-4、ALT呈负相关(r=-0.282、-0.318、-0.238、-0.224,P<0.05),与血小板计数(PLT)呈正相关(r=0.298,P<0.05)。CHI3L1与C-Ⅳ、HA、LN、FIB-4、APRI、ALT呈正相关(r=0.296、0.467、0.254、0.284、0.300、0.316,P<0.05),与PLT呈负相关(r=-0.506,P<0.05)。ROC曲线显示miR-203预测肝显著纤维化/肝硬化发生的曲线下面积(AUC)为0.820,CHI3L1预测疾病的AUC为0.873,均优于APRI和FIB-4(P<0.05),两者联合诊断的AUC为0.895;抗病毒治疗后miR-203和CHI3L1水平与治疗前比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论血清miR-203和CHI3LI的检测可用于肝显著纤维化/肝硬化诊断和抗病毒疗效的评价,两者联合应用可提高诊断效能。

miR-214-5p通过DNMT1介导的AXIN2基因DNA甲基化修饰在皮肤基底细胞癌中的作用机制

目的探讨皮肤基底细胞癌中轴抑制蛋白2(Axis inhibition protein 2,AXIN2)基因启动子甲基化对基因转录的影响及miR-214-5p通过靶向DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)对AXIN2甲基化率的调控机制。方法收集2022年1月-2023年6月在广州市皮肤病防治所就诊治疗的102例皮肤基底细胞癌(Cutaneous basal cell carcinoma,BCC)患者作为研究对象,提取癌组织和癌旁正常组织标本及基线资料。焦磷酸测序法检测AXIN2基因启动子区甲基化率。实时荧光定量PCR检测AXIN2、DNMT1基因mRNA和miR-214-5p的表达水平。将miR-214-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及其阴性对照(mimic NC和inhibitor NC)分别对基底细胞癌A431细胞进行转染,48 h后检测DNMT1基因mRNA表达水平和AXIN2基因甲基化率。结果BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率显著高于癌旁正常组织(t=5.128,P<0.001),AXIN2基因mRNA相对表达水平显著低于癌旁正常组织(t=7.826,P<0.001),DNMT1基因mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(t=4.838,P<0.001),miR-214-5p表达水平显著低于癌旁正常组织(t=5.426,P<0.001)。BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率与其mRNA表达水平呈负相关(r=-0.793,P<0.001),DNMT1基因mRNA水平与AXIN2基因甲基化率呈正相关(r=0.814,P<0.001),miR-214-5p表达水平与DNMT1基因mRNA水平呈负相关(r=-0.747,P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验结果证实,DNMT1是miR-214-5p的靶基因。细胞转染后,与mimic NC、inhibitor和inhibitor NC比较,mimic的DNMT1基因mRNA水平、AXIN2基因甲基化率显著降低(P<0.001);而inhibitor的DNMT1基因mRNA水平和AXIN2基因甲基化率相较于其他三组明显上升(P<0.001)。结论miR-214-5p可通过调控下游靶蛋白DNMT1表达,影响AXIN2基因的DNA甲基化率,调控AXIN2基因的表达水平,参与皮肤基底细胞癌的发生机制。

非小细胞肺癌组织中miR-203启动子DNA甲基化状态与SRC表达及临床病理因素的相关研究

目的探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中miR-203启动子DNA甲基化状态与SRC蛋白表达及临床病理因素的关系,并进一步证实了miR-203启动子DNA甲基化可能参与SRC的表达调控。方法收集45例经手术切除的非小细胞肺癌组织标本及其对应的癌旁正常组织。采用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)检测miR-203基因启动子DNA甲基化水平,并通过亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)进行确认,实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测miR-203的表达丰度,并通过免疫组织化学染色(Immunohistochemical,IHC)研究SRC蛋白在肺癌组织中的表达情况。分析miR-203基因启动子DNA甲基化与miR-203、SRC表达的相关性,以及与患者临床病理特征的关系。结果肺癌组织中miR-203甲基化率为66.67%(30/45),明显高于癌旁组织的24.44%(11/45),与miR-203表达呈负相关(r_(s)=-0.615,P<0.05),而与SRC表达呈显著正相关(r_(s)=0.703,P<0.01),与肿瘤大小、浸润程度、TNM分期等临床病理因素相关(P<0.05)。结论非小细胞肺癌组织中,miR-203启动子DNA发生了高甲基化,这种变化可能是通过上调SRC蛋白表达促进非小细胞肺癌的恶性增殖。

miR-4756在前列腺癌组织中的甲基化水平及对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响

目的分析miR-4756在前列腺癌组织中的甲基化水平并探讨其对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响及作用机制。方法采用iMETHYL数据库分析前列腺癌组织中miR-4756的甲基化情况。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测前列腺癌22Rv1、DU-145、PC-3、C4-2B细胞中miR-4756的表达。采用5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)试剂处理前列腺癌细胞,以qRT-PCR检测5-Aza-CdR对前列腺癌细胞中miR-4756表达的影响。采用miR-4756模拟物转染22Rv1细胞上调miR-4756的表达。采用克隆形成实验和划痕愈合实验检测上调miR-4756对22Rv1细胞增殖和迁移的影响。采用双荧光素酶报告实验验证miR-4756和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-6(GPC6)的靶向关系。qRT-PCR和Western blot检测上调miR-4756对22Rv1细胞中GPC6基因表达的影响。Western blot检测上调miR-4756对22Rv1细胞中Wnt信号通路蛋白Wnt1、Wnt2、ROR1、ROR2表达的影响。结果前列腺癌组织中miR-4756甲基化水平高于癌旁组织(P<0.01)。与人正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)比较,前列腺癌细胞中miR-4756表达降低(P<0.01)。5-Aza-CdR试剂能够促进前列腺癌细胞中miR-4756的表达(P<0.01)。miR-4756组22Rv1细胞克隆形成数目低于对照组(P<0.01)。miR-4756组22Rv1细胞迁移率低于对照组(P<0.01)。miR-4756能够靶向结合GPC6信使RNA(mRNA)(P<0.01)。与对照组22Rv1细胞比较,miR-4756组22Rv1细胞中GPC6基因表达明显受到抑制(P<0.01)。与对照组比较,上调miR-4756抑制22Rv1细胞中GPC6蛋白表达量,Wnt信号通路蛋白Wnt1、Wnt2、ROR1、ROR2表达降低(P<0.01)。结论前列腺癌组织中miR-4756甲基化水平高于癌旁组织,上调miR-4756通过靶向下调前列腺癌22Rv1细胞中GPC6表达抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移。

子宫内膜癌组织中LncRNA FAM83H-AS1、miR-203的表达及与预后的关系

目的探讨子宫内膜癌组织中长链非编码RNA(LncRNA FAM83H-AS1)和microRNA(miR)-203的表达及其与患者临床病理特征和预后的关系。方法选取收治的89例子宫内膜癌患者为研究对象进行前瞻性研究,患者均行手术切除,术后随访时间2年。采用免疫组化法检测LncRNA FAM83H-AS1和miR-203表达情况,对比癌组织、癌旁组织中LncRNA FAM83H-AS1和miR-203表达,分析子宫内膜癌患者癌组织中LncRNA FAM83H-AS1和miR-203表达情况与临床病理参数的关系,分析影响子宫内膜癌患者预后的因素,双荧光素没酶报告实验研究LncRNA FAM83H-AS1和miR-203的靶向关系;分析癌组织中LncRNA FAM83H-AS1和miR-203表达与子宫内膜癌患者生存的关系。结果截止随访结束,11例患者失访。癌组织中LncRNA FAM83H-AS1阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05),miR-203阳性表达率低于癌旁组织(P<0.05)。浸润深度≥1/2、Ⅲ期、合并脉管癌栓子宫内膜癌患者癌组织LncRNA FAM83H-AS1阳性表达率分别高于浸润深度<1/2、Ⅰ~Ⅱ期、未合并脉管癌栓者(P<0.05),浸润深度≥1/2、Ⅲ期、合并脉管癌栓子宫内膜癌患者癌组织miR-203阳性表达率分别低于浸润深度<1/2、Ⅰ~Ⅱ期、未合并脉管癌栓者(P<0.05)。78例子宫内膜癌患者中62例(79.49%,64/78)无病生存,70例(89.74%,70/78)生存。将LncRNA FAM83H-AS1、miR-203表达作为自变量,将是否出现大血管病变作为因变量,对其进行赋值,进行logistic多因素回归分析,结果显示LncRNA FAM83H-AS1、miR-203表达均是预后不良的独立危险因素(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,子宫内膜癌组织LncRNA FAM83H-AS1、miR-203及两者联合对子宫内膜癌患者术后复发预测的灵敏度分别为75.00%(95%CI:54.78%~88.57%)、78.57%(95%CI:58.54%~90.97%)、75.00%(95%CI:54.78%~88.57%),特异度分别为78.21%(95%CI:70.75%~84.24%)、73.08%(95%CI:65.29%~79.71%)、96.15%(95%CI:91.44%~98.43%),AUC分别为0.724(95%CI:0.653~0.787)、0.796(95%CI:0.730~0.851)、0.856(95%CI:0.797~0.904)。结论子宫内膜癌患者癌组织中LncRNA FAM83H-AS1和miR-203表达与临床病理参数及预后有关,LncRNA FAM83H-AS1阳性、miR-203阴性者预后不良风险高。

miR-204启动子甲基化作为结直肠癌表观遗传生物标志物的临床研究

目的 探讨miR-204启动子甲基化在结直肠癌(CRC)中的临床意义。方法 收集2018年1月至2020年3月于我院就诊的69例CRC患者血浆样本、肿瘤组织标本和癌旁正常结肠黏膜组织标本;另外招募68例健康志愿者作为正常对照组,采集血浆样本。使用肿瘤基因图谱计划(TCGA)数据库与基因芯片数据(Methyl450K)分析肿瘤和正常组织中识别的CpG位点的甲基化水平。采用定量甲基化特异性PCR法(qMSP)和实时荧光定量PCR法(qPCR)检测样本中miR-204启动子区甲基化状态和基因表达量。结果 TCGA数据表明miR-204表达与宿主基因TRPM3的表达协调下调,并确定了miR-204启动子周围的两个CpG岛。与癌旁组织比较,CRC组织中miR-204启动子甲基化参考百分比(PMR)升高[1.78(0.35,16.61)vs. 1.51(0.45,2.98),P<0.001],且与miR-204表达量呈负相关(r=-0.324,P=0.007),与DNA甲基转移酶1 mRNA呈正相关(r=0.502,P<0.001)。此外,与正常对照组比较,CRC患者血浆cfDNA中miR-204启动子PMR显著升高[6.57(0.76,12.45)vs. 1.60(0.59,3.4),P=0.015],并且与CRC组织miR-204启动子PMR呈正相关(r=0.418,P<0.001)。血浆cfDNA中miR-204启动子PMR用于CRC的诊断的受试者工作特征曲线下面积为0.701(95%CI:0.610~0.791),灵敏度和特异度分别为56.5%和94.1%。此外,进一步依据临床分期、分化程度等进行分层分析,并未观察到miR-204启动子超甲基化与CRC患者主要临床特征的关系(P>0.05)。结论 miR-204启动子甲基化与CRC显著相关,并且血浆cfDNA中miR-204启动子甲基化状态或可作为CRC诊断和监测的潜在生物标记物。

LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2促进甲状腺癌的恶性行为

目的:探讨长链非编码RNA MIAT(LncRNA-MIAT)对甲状腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的调控作用与分子机制。方法:用癌症基因组图谱(TCGA)和甲状腺癌(THCA)mRNA-seq数据分析LncRNA-MIAT和组蛋白甲基化转移酶2(EZH2)在甲状腺癌中的表达。用人正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1和人甲状腺癌细胞系FTC-133作为靶细胞。qPCR法检测LncRNA-MIAT、miR-519d-3p、EZH2 mRNA的表达水平差异。RNA荧光原位杂交(FISH)检测LncRNA-MIAT在FTC-133细胞中的定位,Western blot检测EZH2蛋白的表达。荧光素酶报告基因检测LncRNA-MIAT和miR-519d-3p以及miR-519d-3p与EZH2的直接作用。将FTC-133细胞分为6组[空白对照组(control组)、空载体组(Empty vector组)、过表达LncRNA-MIAT组(LncRNA-MIAT组)、miR-519d-3p的抑制剂组(miR-519d-3p inhibitor组)、EZH2的抑制剂EPZ-6438处理组(EPZ-6438组)、miR-519d-3p抑制剂联合过表达LncRNA-MIAT组(LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组)]。用Edu试剂盒和平板克隆法检测细胞增殖。用流式细胞术检测细胞凋亡。用Transwell细胞迁移和侵袭实验检测细胞的行为。结果:LncRNA-MIAT和EZH2在甲状腺癌组织和细胞中的表达均上调,二者具有正相关性(r=0.466,P<0.05),miR-519d-3p在FTC-133细胞中表达下调(P<0.05)。经过双荧光素酶报告基因实验检测发现miR-519d-3p的靶基因是EZH2,且LncRNA-MIAT靶向抑制miR-519d-3p激活EZH2。与Empty vector组相比,LncRNA-MIAT组和miR-519d-3p inhibitor组的Edu阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数均显著上调(P<0.05),细胞凋亡率均减少(P<0.05)。EZH2的抑制剂EPZ-6438则减少Edu阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数(P<0.05),增加细胞凋亡率(P<0.05)。分别与LncRNA-MIAT组或miR-519d-3p inhibitor组比,LncRNA-MIAT+miR-519d-3p inhibitor组的Edu阳性细胞百分比、细胞克隆数、细胞侵袭和迁移数均显著上调(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论:甲状腺癌细胞中LncRNA-MIAT通过抑制miR-519d-3p激活EZH2促进甲状腺癌的恶性行为。

血清miR⁃152、miR⁃153和miR⁃203在宫颈上皮内病变中的表达及临床意义

目的探究血清miR⁃152、miR⁃153和miR⁃203在宫颈上皮内病变中的表达及临床意义。方法选取2019年12月至2020年12月安庆市立医院收治的宫颈上皮内病变患者80例(CIN组),根据宫颈上皮内病变级别分为低度鳞状上皮内病变(LSIL)组(n=48)和高度鳞状上皮内病变(HSIL)组(n=32)。另选取宫颈筛查正常、因子宫肌瘤入院患者50例作为对照组,比较CIN组和对照组临床资料、miR⁃152、miR⁃153和miR⁃203水平,采用多因素分析miR⁃152、miR⁃153和miR⁃203与宫颈上皮内病变的关系,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析miR⁃152、miR⁃153和miR⁃203对宫颈上皮内病变的诊断价值。结果CIN组和对照组年龄、BMI、吸烟史、CEA、CA199、CA125比较,差异无统计学意义(P>0.05);CIN组血清miR⁃152、miR⁃153和miR⁃203水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);多因素Logistic回归分析结果显示,miR⁃152(OR=0.271)、miR⁃153(OR=0.201)和miR⁃203(OR=0.164)是宫颈上皮内病变的影响因素(P<0.05)。miR⁃152、miR⁃153和miR⁃203诊断宫颈上皮内病变的ROC曲线下面积分别为0.825、0.755和0.792,miR⁃152、miR⁃153和miR⁃203的特异性/敏感性分别为80.55%/78.65%、72.12%/71.90%和76.93%/78.13%。LSIL组患者血清miR⁃152、miR⁃153和miR⁃203水平显著高于HSIL组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论血清miR⁃152、miR⁃153和miR⁃203在宫颈上皮内病变患者中呈异常表达,三者或可作为诊断宫颈上皮内病变的指标。

地西他滨通过甲基化调控DU145细胞中miR-3064-5p 的表达

目的探讨miR-3064-5p在前列腺癌(PCa)细胞中的表达调控机制。方法利用脂质体转染法将阴性对照(NC)组及miR-3064-5p模拟物(miR-3064-5p mimics)转染入PCa细胞DU145中,细胞平板克隆实验、划痕实验、Western blot法分别检测DU145细胞增殖和迁移侵袭能力;qRT-PCR检测前列腺正常上皮细胞及PCa细胞中miR-3064-5p的表达;生物信息学软件分析,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测miR-3064-5p启动子区的甲基化水平;使用地西他滨(decitabine,DAC)处理DU145细胞,MSP和qRT-PCR分别检测DAC对miR-3064-5p启动子甲基化状态和表达的影响;Western blot检测相关蛋白水平。结果过表达miR-3064-5p可抑制DU145细胞的增殖和转移(P均<0.05);与正常前列腺上皮细胞RWPE-1相比,miR-3064-5p在前列腺癌细胞中表达均下调(P均<0.05);miR-3064-5p的启动子区存在甲基化岛,miR-3064-5p启动子区的甲基化水平高于正常前列腺细胞(P<0.05);DAC处理后,DU145细胞中miR-3064-5p启动子区的甲基化水平降低,甲基化转移酶(DNMT3B)的表达降低,同时,miR-3064-5p的表达增强,并促进了E-Cadherin的表达,抑制了Vimentin及PCNA的表达(P均<0.05)。结论在前列腺癌细胞中DNA甲基化介导了miR-3064-5p的沉默,DAC可降低miR-3064-5p启动子区的甲基化水平,激活其表达,恢复其抑癌作用。

基于生物信息学方法分析miR-3193及其甲基化在宫颈癌中的临床意义

目的 评估miR-3193表达及其甲基化作为宫颈癌不良预后的生物标志物的可行性。方法 从The Cancer Genome Atlas (TCGA)数据库中获取宫颈癌患者的基因表达数据和相应的临床信息。通过生物信息学方法揭示宫颈癌患者miR-3193表达及甲基化与患者的临床特征与预后之间的关系。结果 miR-3193表达与宫颈癌临床分期、肿瘤大小呈正相关。Cox回归和Kaplan-Meier法证实miR-3193上调是宫颈癌不良预后的独立危险因素。miR-3193受DNA甲基化负调控,miR-3193低甲基化提示宫颈癌患者预后不良。功能富集分析显示miR-3193可能通过调控TGF-β和PI3K-Akt等信号通路参与宫颈癌发病机制。通过CMap分析筛选出对宫颈癌有潜在抑制作用的4种小分子药物(阿霉素、喜树碱、GW-8510和阿扎胞苷)。结论 miR-3193低甲基化可能是宫颈癌不良预后的生物标志物。

miR-203与消化系统肿瘤研究进展

microRNA(miRNA)是内源性非编码单链小RNA,由18~25个核苷酸组成,与肿瘤细胞的增殖凋亡、侵袭迁移及分化等功能密切相关。microRNA-203(miR-203)最早被检测到在上皮细胞内特异性高表达,后来在其他系统肿瘤细胞内也被检测到存在表达,但其作用存在争议,使其成为近几年miRNA在肿瘤治疗研究领域里的热点之一。消化系统肿瘤是目前最常见的一种侵袭转移能力较强的恶性肿瘤,文章就miR-203的特点及其与消化系统肿瘤之间的最新研究成果进行综述。

miR-4465对喉癌Hep-2细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其机制

目的探讨miR-4465调控第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)甲基化对喉癌Hep-2细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法选取2017年1月至2022年1月复旦大学附属中山医院青浦分院耳鼻喉科手术治疗患者的喉癌组织及相应的癌旁组织20例,实时荧光定量RT-PCR检测组织中miR-4465和PTEN的表达,甲基化特异性PCR检测PTEN甲基化水平,Pearson法分析癌组织中miR-4465和PTEN的相关性,并分析PTEN基因启动子甲基化率与性别、年龄、临床分型、肿瘤分期、淋巴结转移的关系。将Hep-2细胞分为空白组、对照组(转染mimic NC)、miR-4465 mimic组(转染miR-4465 mimic),qRT-PCR检测Hep-2细胞中PTEN mRNA表达,Western blot检测Hep-2细胞中PTEN蛋白表达,CCK-8检测Hep-2细胞增殖,Transwell实验检测Hep-2细胞侵袭,细胞划痕愈合实验检测Hep-2细胞迁移。再将Hep-2细胞分为pcDNA3.0组(转染pcDNA3.0质粒)和pcDNA3.0-PTEN组(转染pcDNA3.0-PTEN质粒),CCK-8检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭,细胞划痕愈合实验检测细胞迁移。结果喉癌组织中miR-4465和PTEN的相对表达低于癌旁组织(P<0.001);癌组织中miR-4465的表达与PTEN呈正相关性(r=0.459,P=0.036);PTEN在癌组织的甲基化率明显高于癌旁组织(P<0.001);PTEN基因启动子甲基化率与性别、年龄、临床分型无相关性(P>0.05),与肿瘤分期、淋巴结转移具有一定的关系(P<0.001)。与空白组和对照组相比,miR-4465 mimic组PTEN mRNA和蛋白相对表达显著升高(P<0.001),miR-4465 mimic组Hep-2细胞增殖能力明显降低(P<0.001),Hep-2细胞侵袭能力明显降低(P<0.001),Hep-2细胞迁移率明显降低(P<0.001)。与pcDNA3.0组相比,pcDNA3.0-PTEN组Hep-2细胞增殖、侵袭、迁移能力明显降低(P<0.001)。结论miR-4465在喉癌组织中低表达,过表达miR-4465可以抑制Hep-2细胞的增殖、侵袭和迁移,这可能与PTEN启动子甲基化程度降低和PTEN表达增加有关。

MALDI-TOF MS技术检测胃癌患者外周血中miR-34b/c甲基化及临床意义

目的探讨胃癌患者外周血中miR-34b/c启动子区甲基化状态及临床意义。方法采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionisation,time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术检测31例胃癌患者和24例正常人群外周血中miR-34b/c启动子区甲基化状态,筛选与胃癌发生相关的差异性甲基化CpG位点,并分析其与胃癌临床病理特征的相关性。14 C尿素呼气试验(UBT)检测胃癌患者HP感染状态,分析其与miR-34b/c甲基化的相关性。免疫组化EnVision两步法检测胃癌组织中MMR蛋白表达,分析其与miR-34b/c甲基化的相关性。结果胃癌中miR-34b/c整体甲基化水平高于正常对照组,其中3个CpG单位CpG_3.4、CpG_20、CpG_25在胃癌中的甲基化水平(13.61%、11.32%、15.32%)明显高于正常对照组(2.36%、0.41%、7.60%),差异有显著性(P<0.01)。进一步分析CpG位点与临床病理特征的关系,发现miR-34b/c CpG_3.4高甲基化与胃癌淋巴结转移相关(P<0.05),而miR-34b/c CpG_3.4、CpG_20、CpG_25高甲基化与患者年龄、性别、发病部位、分化程度、TNM分期无相关性(P>0.05)。31例胃癌患者HP感染阳性检出率为51.61%(16/31)。HP感染与miR-34b/c高甲基化无相关性(P>0.05)。31例胃癌患者中,错配修复基因缺失(deficient mismatch repair,dMMR)2例(6.45%),错配修复基因完整(proficient mismatch repair,pMMR)29例(93.55%)。MMR蛋白表达与miR-34b/c高甲基化无相关性(P>0.05)。结论miR-34b/c启动子区高甲基化改变可能在胃癌的发生、发展中发挥重要作用,并可作为胃癌诊断和预后预测的潜在生物学标志物。

胃癌患者外周血miR-34a甲基化的检测及临床意义

目的探讨胃癌患者miR-34a甲基化在胃癌发生中的作用以及与临床病理特征、幽门螺杆菌(HP)感染的相关性。方法运用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术检测31例胃癌患者和24例对照组外周血DNA miR-34a基因甲基化水平。结果胃癌中miR-34a甲基化水平高于对照组,miR-34a CpG_5,CpG_12.13在胃癌中平均甲基化率高于对照组(51.7%±5.9%vs.37.8%±7.8%,84.61%±8.2%vs.68.1%±12.1%,P<0.01)。miR-34a CpG_5在淋巴结转移组中的甲基化率要高于无淋巴结转移组(53.55%±4.86%vs 47.22%±6.07%,P<0.01),且CpG_5在TNM分期(Ⅱ期+Ⅲ期)中甲基化水平高于Ⅰ期(53.21%±4.8%vs 46.57%±6.9%,P<0.05)。结论miR-34a高甲基化可能参与了胃癌的发生和发展。

miRNA203在Barrett食管和食管癌中的表达及相关性研究

目的研究miRNA203(miR203)在Barrett食管癌变中的表达及其可能的甲基化机制,探讨其启动子区甲基化状态与Barrett食管癌变的关系。方法用荧光定量PCR法检测经去甲基化处理前及处理后的Barrett食管、食管癌和正常食管粘膜细胞中miR203的表达水平,并检测Barrett食管、食管癌及病变邻近正常组织中miR203的表达水平;运用甲基化特异性PCR(MSP)检测miR203启动子甲基化水平,免疫组化检测Barrett食管、食管癌以及相邻正常食管组织中K-RAS蛋白的表达情况。结果 Barrett食管与食管癌细胞miR203表达水平相比,正常食管粘膜细胞显著减低(P=0.003);经过去甲基化处理后,上述样本中miR203表达水平显著升高(P=0.043),食管癌细胞miR203表达水平较Barrett食管细胞升高的幅度更大(P=0.03),Barrett食管(P=0.001)和食管癌(P=0.000)组织miR203表达水平明显低于相邻正常组织。MSP结果表明,食管癌细胞和Barrett食管细胞miR203启动子经过去甲基化处理后表现为低甲基化或非甲基化表达,食管癌和Barrett食管组织miR203启动子甲基化程度高于相邻病变旁正常组织。免疫组化显示,K-RAS蛋白在食管癌和Barrett食管组织中较相邻正常食管组织高,且食管癌组织较Barrett食管组织表达更高。结论 miR203表达水平在正常食管、Barrett食管和食管癌细胞中表达呈逐渐降低趋势,提示miR203启动子高甲基化是导致miR203表达下调的原因之一,且参与Barrett食管的癌变过程,miR203表达水平及其启动子甲基化程度可能成为监测和预防Barrett食管癌变的重要分子生物学指标。

DNA甲基化介导miR-203/CREB1信号调控对多发性骨髓瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨DNA甲基化介导miR-203/CREB1信号途径的调控对多发性骨髓瘤细胞增殖、侵袭和凋亡等生物学行为的影响。方法:采用重亚硫酸氢盐测序法定量检测多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞株中miR-203的甲基化水平;实时荧光定量PCR检测miR-203的表达水平;应用5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)干预RPMI 8226细胞建立去甲基化模型;转染miR-203模拟物(mimic)构建miR-203过表达细胞;采用CCK-8法、Transwell、流式细胞术分别检测RPMI 8226细胞增殖、侵袭和凋亡;采用双荧光素酶报告实验验证miR-203与CREB1的靶向作用关系;Western blot检测CREB1的蛋白表达水平。结果:RPMI 8226细胞miR-203启动子区存在高甲基化且低表达,去甲基化可以诱导表达;去甲基化作用可以抑制RPMI 8226细胞增殖及细胞侵袭能力,促进细胞凋亡,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。miR-203过表达组的细胞增殖抑制作用、细胞侵袭能力、凋亡率与去甲基化作用组相当。双荧光素酶报告实验证实,CREB1是miR-203的直接作用靶点;去甲基化作用通过上调miR-203抑制CREB1蛋白的表达水平,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-203甲基化沉默导致CREB1表达上调是维持多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞恶性生物学行为的重要原因。

miR-203基因启动子区甲基化与肥胖膝关节骨性关节炎患者滑膜炎症水平相关性研究

目的研究滑膜组织miR-203基因启动子区异常甲基化状态与肥胖膝关节骨性关节炎(KOA)关节液促炎因子水平相关性。方法 KOA患者滑膜组织及关节液取自2018年1月~2019年1月于河北省邯郸市中心医院行膝关节人工关节置换的36例患者,体重指数(BMI)≥28.0 kg/m^2的患者纳入肥胖组(23例),18.0 kg/m^2≤BMI≤23.9 kg/m^2的患者纳入正常对照组(13例)。甲基化特异性PCR(MSP)检测滑膜组织miR-203的基因启动子区甲基化状态。通过定量聚合酶链反应(qPCR)检测miR-203在滑膜组织的表达水平;应用qPCR检测miR-203在肥胖组和正常对照组中的表达水平;采用Pearson相关分析探讨miR-203与BMI,关节液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)的相关性。结果肥胖组滑膜组织中miR-203基因启动子区呈异常低甲基化状态,正常对照组则呈部分低甲基化状态。与正常对照组比较,肥胖组滑膜组织中miR-203的表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。肥胖组关节液中IL-1β、IL-6、TNFα的相对表达均高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。miR-203基因启动子区甲基化水平与人群BMI和关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α均呈负相关(均P<0.05);miR-203表达水平和与人群BMI和关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α均呈正相关(均P<0.05)。结论 KOA患者滑膜组织miR-203基因启动子区低甲基化与肥胖KOA患者BMI及关节液促炎因子水平密切相关,miR-203可作为肥胖KOA炎症的重要调控因素及KOA治疗的潜在靶标。

血清miRNA-21和miRNA-203在上皮性卵巢癌中的表达及诊断价值

目的探讨微小核糖核酸21(miR-21)和微小核糖核酸203(miR-203)在上皮性卵巢癌(EOC)中的表达情况,及两者与血清糖类抗原125(CA125)在EOC诊断中的临床价值。方法采用QPCR检测40例EOC患者(EOC组)、40例上皮性卵巢良性肿瘤患者(良性组)和42例健康女性(正常对照组)血清miR-21和miR-203的表达情况;同时采用电化学发光法检测上述3组人群血清CA125的表达水平;分析miR-21和miR-203的表达与EOC临床病理特征的关系,用受试者工作特征曲线(ROC)评价两者的临床诊断价值并分别计算CA125、miR-21和miR-203单独和联合检测在EOC诊断中的灵敏度和特异度。结果 EOC组miR-21和miR-203的相对表达量分别为2.27±0.48和3.61±0.71,均高于良性组的1.20±0.22和1.47±0.38以及正常对照组的1.00±0.33和1.00±0.28,差异有统计学意义(P<0.05);而良性组与正常对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。miR-21和miR-203表达与临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05),与年龄、绝经状态、病理类型和CA125水平无关(P>0.05);CA125单独检测的特异度最高,为82.50%;CA125、miR-21和miR-201联合检测的灵敏度最高,达95.00%。结论 miR-21和miR-203可能在EOC的发生、发展中发挥原癌基因的作用;血清CA125、miR-21和miR-203三者联合检测可提高EOC诊断的灵敏度。

TLR4、SOCS3、miR-203在IgA肾病大鼠肾组织中的表达变化及意义

目的观察IgA肾病(IgAN)大鼠模型建立过程中Toll样受体4(TLR4)、细胞因子信号传导抑制因子3(SOCS3)及miR-203在肾组织中的表达变化,初步探讨其在IgAN发病机制中的作用。方法 20只SPF级雄性SD大鼠,随机分为正常对照组和IgAN模型组,运用联合免疫诱导方法建立实验性IgAN大鼠模型,分别在建模第8、9周收获大鼠肾脏,免疫荧光检测肾组织IgA表达以验证模型成功建立,通过高碘酸-希夫(PAS)染色评价肾小球系膜增生病变,采用Western blotting免疫印迹法检测TLR4及SOCS3蛋白表达变化,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测TLR4、SOCS3 mRNA及miR-203的表达变化。结果 IgAN大鼠模型建立第8周肾脏病理显示肾小球有系膜增生改变,与正常对照比较,肾脏TLR4、SOCS3蛋白及mRNA表达显著增加,miR-203表达水平也明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);第9周肾小球系膜增生病变加重,TLR4蛋白及mRNA表达与第8周相比无显著变化,但SOCS3蛋白及mRNA表达水平较第8周明显下降(P<0.05),miR-203表达则较第8周升高(P<0.05)。结论 IgAN大鼠模型肾组织中TLR4、SOCS3、miR-203表达增加,可能与IgAN的发生发展有关,随着系膜增生病变加重SOCS3表达反而下降,提示SOCS3可能在IgAN进展中起保护作用。