miRNA-16在常见头颈部恶性肿瘤中的研究进展

miRNAs是高度保守的内源性非编码小RNA分子,通过与特定mRNA 3’非翻译区(3’UTR)互补序列结合,降低靶基因的转录和/或蛋白水平。miRNAs在许多生理过程中发挥着重要作用,如代谢、分化等。然而,miRNAs异常表达也与肿瘤的发生发展相关。miRNA-16被证实在多种肿瘤中存在异常表达,故本文就miRNA-16在常见头颈部恶性肿瘤中的研究做一综述。

miRNA-16对肺腺癌A549细胞增殖和VEGF-A表达水平的影响

目的探讨miRNA-16作用不同时间对体外培养的人肺腺癌A549细胞增殖的影响,以及对VEGF-A表达水平的影响。方法将50 nmol/L,的miRNA-16和阴性对照序列用Lipofectamine 2000转染进人肺腺癌A549细胞中,通过qRT-PCR法检测转染后A549细胞中miRNA-16的表达水平,MTT法检测转染miRNA-16后细胞的增殖抑制情况,ELISA法检测转染miRNA-16后细胞VEGF-A表达水平。结果转染培养24h后,测得转染组miRNA-16表达水平明显高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);转染组细胞增殖抑制率明显高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);转染组细胞VEGF-A表达水平较阴性对照组和空白对照组明显降低(P<0.05)。结论 miRNA-16能引起细胞增殖抑制,并且可能与下调VEGF-A的表达有关。

miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223在类风湿关节炎患者外周血中检测的临床意义

目的研究miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223在类风湿关节炎(RA)患者外周血中的表达水平与健康人群的差异,探讨这3项指标的临床意义。方法收集68例RA确诊患者(RA组)及20例健康志愿者(健康对照组)的空腹静脉血,采用实时荧光定量PCR技术检测研究对象外周血中miRNA-16、miRNA-146a、miR-223的相对表达水平;比较RA患者与健康志愿者外周血中miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的相对表达水平差异,Pearson分析RA患者血清这3项指标与类风湿因子(RF)、C反应蛋白(CRP)、DAS28评分的相关性;构建miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的ROC曲线并计算曲线下面积(AUC),进而比较各指标单独及联合检测的灵敏度和特异度。结果 RA组患者外周血中miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的相对表达水平显著高于健康对照组(P<0.05)。根据DAS28评分,进一步将RA患者分为缓解组和活动组,发现活动组患者外周血中miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223相对表达水平高于缓解组和健康对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。miRNA-16的表达水平与CRP、DAS28呈正相关(r=0.470、0.446,P<0.05),miRNA-146a的表达水平与CRP、DAS28呈正相关(r=0.408、0.407,P<0.05)。miRNA-223的表达水平与RF、CRP呈正相关(r=0.527、0.518,P<0.05)。miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223的AUC分别为0.63、0.75、0.89,灵敏度分别为68.70%、85.24%、87.63%,特异度分别为55.39%、63.57%、90.35%。三者联合使用作为RA标志物作ROC曲线,得到AUC为0.91,灵敏度为89.34%,特异度为91.56%。结论 miRNA-16、miRNA-146a、miRNA-223与RA发生、发展存在密切关系,联合检测具有更高的灵敏度和特异度,适用于临床早期诊断RA。

血清miRNA-16和miRNA-92a在2型糖尿病合并骨质疏松症患者中的表达及与骨代谢相关性研究

目的探讨血清miRNA-16和miRNA-92a在2型糖尿病(T2DM)合并骨质疏松症患者中的表达及与骨代谢的相关性。方法选取丽水市人民医院2019年1月至2021年1月收治的T2DM合并骨质疏松症患者91例作为T2DM合并骨质疏松组,另选取本院同期收治的单纯T2DM患者80例作为非骨质疏松组。采用qRT-PCR法测定血清miRNA-16和miRNA-92a相对表达量,电化学发光免疫分析法测定I型胶原羧基端肽β特殊系列(β-CTX)和ALP水平,ROC曲线分析miRNA-16和miRNA-92a对T2DM合并骨质疏松症的诊断效能,Pearson相关分析miRNA-16、miRNA-92a与β-CTX、ALP的相关性,多因素logistic回归分析影响T2DM合并骨质疏松的独立危险因素。结果T2DM合并骨质疏松组miRNA-16和miRNA-92a相对表达量均明显高于非骨质疏松组(均P<0.05)。T2DM合并骨质疏松组β-CTX水平高于非骨质疏松组,而ALP水平低于非骨质疏松组(均P<0.05)。用于诊断T2DM合并骨质疏松症时,miRNA-16的灵敏度为71.70%,特异度为55.26%;miRNA-92a灵敏度为69.35%,特异度为58.62%。miRNA-16和miRNA-92a与β-CTX均呈正相关(r=0.673、0.754,均P<0.05),而与ALP均呈负相关(r=-0.767,-0.719,圴P<0.05)。经多因素logistic回归分析显示,年龄>60岁、miRNA-16和miRNA92表达均为影响T2DM合并骨质疏松症的独立危险因素(均P<0.05)。结论血清miRNA-16和miRNA-92a在T2DM合并骨质疏松症患者中高表达,且与骨代谢明显相关。

急性胰腺炎患者外周血miRNA-16和miRNA-192表达及其与病情严重程度的相关性

目的:探讨急性胰腺炎(AP)患者外周血miRNA-16和miRNA-192表达及其与病情程度的相关性。方法:选取广东省第二人民医院2019年1月至2021年1月诊治的AP患者91例为研究对象,按照病情程度分为轻中度组(n=57)和重度组(n=34);另选同期健康体检者为对照组(n=50)。受试者入院24h内采集外周静脉血,分离血清后采用实时荧光定量PCR法测定血清miRNA-16和miRNA-192表达程度。比较三组急性生理与慢性健康评分(APACHEⅡ)、miRNA-16和miRNA-192表达量;采用ROC曲线分析miRNA-16和miRNA-192在AP中的诊断价值;采用Pearson分析miRNA-16和miRNA-192与APACHEⅡ评分相关性。结果:轻中度组和重度组APACHEⅡ评分明显高于对照组,且重度组APACHEⅡ评分明显高于轻中度组,P均<0.05。轻中度组和重度组血清miRNA-16和miRNA-192相对表达量明显高于对照组,且重度组血清miRNA-16和miRNA-192相对表达量明显高于轻中度组,P均<0.05。ROC曲线分析显示,miRNA-16和miRNA-192诊断AP的灵敏度分别为67.27%和72.22%,特异度分别为63.89%和72.97%。miRNA-16和miRNA-192与APACHEⅡ评分均呈明显线性正相关,P均<0.05。结论:AP患者外周血miRNA-16和miRNA-192均呈高表达,且与病情严重程度呈明显线性正相关。

西酞普兰对抑郁症患者外周血miRNA-16/5-羟色胺转运体通路的影响

目的·探讨西酞普兰对抑郁症患者外周血miRNA-16/5-羟色胺转运体(serotonin transporter,SERT)通路相关指标的影响。方法·将未服药的抑郁症患者45例(未服药病例组)、经药物治疗的抑郁症患者32例(药物治疗组)及健康对照者32名(健康对照组)纳入研究,行汉密尔顿抑郁量表17项(Hamilton Depression Scale-17 items,HAMD-17)评估。采用荧光定量PCR检测血浆miRNA-16表达水平,采用Western blotting检测血小板中SERT蛋白表达水平。对未服药病例组中医师处方予以西酞普兰治疗的14例患者进行2个月的随访,随访结束后进行HAMD-17评估,检测血浆miRNA-16及血小板SERT蛋白的表达水平。结果·血浆miRNA-16表达水平在3组之间比较,差异无统计学意义(F=0.421,P=0.657);血小板SERT蛋白表达水平在3组之间比较,差异无统计学意义(F=0.112,P=0.894)。随访研究结果显示:14例处方予以西酞普兰治疗的患者,2个月后HAMD-17评分降低(Z=-3.187,P=0.001),血浆miRNA-16表达水平升高(t=2.455,P=0.032),血小板SERT蛋白表达水平无变化(t=-0.750,P=0.470)。结论·5-羟色胺再摄取抑制剂类药物西酞普兰对抑郁症患者血浆miRNA-16的表达具有下调作用;血小板5-羟色胺的减少并非是由血小板膜上SERT蛋白减少这一变化引起,可能与SERT功能降低有关。

电针对抑郁模型大鼠不同脑区miRNA-16及5-羟色胺转运体的影响

目的:通过电针刺激印堂、百会穴对慢性不可预见性温和应激(CUMS)抑郁模型大鼠海马、中缝核miRNA-16及5-羟色胺转运体(SERT)的影响研究,揭示电针治疗抑郁症的可能作用机制。方法:雄性SD大鼠40只,随机分为4组,每组10只,分别为正常对照组、模型组、氟西汀组、电针组。除正常对照组外,其余各组大鼠进行孤养,并接受CUMS刺激方式造模。各组大鼠分别于应激前1天、应激后1天进行强迫游泳试验并记录数据,观察大鼠的行为学变化。运用RT-RCR技术检测各组大鼠海马、中缝核miRNA-16的表达变化;Western blot法观测各组大鼠海马、中缝核SERT蛋白的表达水平。结果:与正常对照组比较,模型组强迫游泳时被动漂浮时间延长(P<0.01),大鼠提前表现绝望;与模型组比较,氟西汀组和电针组被动漂浮时间缩短(P<0.05),表现较活跃;与氟西汀组比较,电针组漂浮时间较短(P<0.05)。与正常对照组比较,模型组大鼠海马、中缝核miRNA-16含量升高(P<0.01),SERT表达水平亦升高(P<0.01);与模型组比较,电针组海马和中缝核miRNA-16含量降低(P<0.05),SERT含量亦降低(P<0.05),差异均有统计学意义。结论:脑区miRNA-16的变化可能与抑郁症的发生相关,而电针能通过抑制脑区SERT的表达,发挥抗抑郁作用。

多发性骨髓瘤中miRNA-16相对表达量与Mayo危险分层的关系

目的研究多发性骨髓瘤(MM)患者miRNA-16(简称miR-16)表达水平的变化及与危险分层、预后判断的关系。方法收集2016年8月至2017年1月于广西医科大学附属第一医院血液内科住院治疗的31例MM患者的骨髓标本各10mL,并取5例健康骨髓捐献者的骨髓标本作为健康对照。利用实时荧光定量聚合酶链反应技术(qRT-PCR)分析miR-16相对表达量变化。同时利用荧光原位杂交技术(iFISH)检测异常基因。统计学分析miR-16相对表达量与以iFISH为基础的Mayo危险分层的关系,和患者自身治疗前后miR-16的相对表达量差异。结果 miR-16在MM患者中相对表达量升高,与Mayo危险分层呈正相关。同时病程进展后的MM患者,miR-16相对表达量上升。结论 miR-16可作为临床判断MM疾病复发或进展恶化的指标,根据其表达量变化指导临床个体化治疗。

miRNA-16与肿瘤的研究进展

微小RNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA,长18～25个核苷酸,可以通过互补的碱基与特定mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)结合,从而使靶mRNA发生降解或影响其翻译,作为转录后水平调控基因的表达。不同或相同的miRNA可以分别表现出促癌基因或抑癌基因的作用,并且涉及肿瘤发生发展的每一个阶段。然而到目前为止,只有少数miRNA的靶基因及其调控通路被研究清楚,大部分miRNA在细胞中的作用仍未明确。近年来,对miRNA潜在调节的分子生物学机制的探索已成为肿瘤研究的热点之一,本文就miRNA-16与肿瘤关系的相关研究进展作一综述。

miRNA-15a/16调控Bmi-1蛋白在卵巢癌顺铂化疗耐药中的作用

目的探讨miRNA-15a和miRNA-16在逆转卵巢癌顺铂化疗耐药过程中的作用机制。方法使用miRNA-15a和miRNA-16模拟物转染人卵巢癌顺铂耐药细胞株CoC1/DDP,予顺铂处理,qRT-PCR检测正常培养CoC1/DDP细胞组、顺铂处理组、阴性对照组、转染miRNA-15a组、转染miRNA-16组和过表达的Bmi-1质粒的转染miRNA-15a和miRNA-16组的miRNA-15a、miRNA-16的表达水平,同时应用Western blot检测各组细胞中Bmi-1的表达水平,CCK-8法、Annexin V/PI法检测每组细胞的存活及凋亡情况、γ-H2AX免疫荧光检测细胞凋亡情况。结果卵巢癌顺铂耐药细胞株CoC1/DDP中miRNA-15a和miRNA-16低表达,Bmi-1蛋白高表达。过表达miRNA-15a、miRNA-16水平,Bmi-1蛋白下降(P<0.05),细胞存活率下降(P<0.05),DNA凋亡明显增加(P<0.05),DNA损伤程度更严重(P<0.05)。过表达Bmi-1质粒可提高细胞活度(P<0.05),降低细胞凋亡率(P<0.05)。结论Bmi-1蛋白可能是miRNA-15a和miRNA-16的调节蛋白靶点,高表达miRNA-15a和miRNA-16可以通过降低Bmi-1蛋白来提高顺铂对卵巢癌细胞的敏感性。通过对卵巢癌顺铂化疗耐药性分子标记的预测和对卵巢癌肿耐药性目标的攻克提供了新的思路。

miRNA-16在系统性红斑狼疮患者外周血中的表达及作用

目的探讨miRNA-16表达在系统性红斑狼疮（SLE）发病中的作用。方法选取符合1997年美国风湿病学会修定的SLE诊断标准的SLE患者16例（SLE组），体检正常的健康对照者12名（健康对照组）作为研究对象。取研究人群外周血分离外周血单个核细胞（PBMC），提取和纯化总RNA，实时定量PCR检测miRNA-16的表达，以小分子RNAU6作为内对照，计算标准化后的2-△ct。值表示miRNA的相对表达含量。并分析其与SLE临床特征的相关性。结果SLE组PBMC中miRNA-16的表达水平919．87±715．45高于健康对照组413．63±330．69，差异有统计学意义（t=-2．497，P〈0．05）；SLE活动组miRNA-16的表达水平1298．79±803．79高于稳定组540．95±350．15，差异有统计学意义（t=-2．445，P〈0．05）；miRNA-16的表达水平与抗核小体抗体呈正相关（r=0．669，P=0．005），与红细胞沉降率呈正相关（r=0．608，P=0．012），与SLE活动指数评分呈正相关（r=0．530，P=0．035）。结论SLE患者PBMC中miRNA-16异常高表达，与狼疮活动有关。

蒙医三根平衡针法对抑郁大鼠p11/组织型纤溶酶原激活物/脑源性神经营养因子通路和miRNA-16的影响

目的:观察蒙医三根平衡针法对慢性应激抑郁模型大鼠海马和中缝核区p11/组织型纤溶酶原激活物(tPA)/脑源性神经营养因子(BDNF)通路及miRNA-16的影响,探讨蒙医三根平衡针治疗抑郁的作用机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、药物组和蒙医针组,每组12只,采用慢性温和不可预见性轻度应激法建立抑郁大鼠模型。药物组大鼠给予盐酸氟西汀灌胃,1次/d,连续28 d。蒙医针组大鼠于应激刺激后1 h给予蒙医三根平衡针法干预,1次/d,连续28 d。观察造模前、干预后各组大鼠行为学改变,免疫荧光法检测大鼠中缝核区p11和tPA阳性表达,Western blot法检测大鼠海马和中缝核区p11和tPA表达量,荧光定量PCR法检测大鼠海马和中缝核区miRNA-16和BDNF mRNA表达。结果:干预后与正常组比较,模型组大鼠水平运动次数、垂直运动次数、糖水消耗量、中缝核区tPA和p11阳性表达、海马和中缝核区tPA和p11相对表达量均减少(P<0.05),海马和中缝核区miRNA-16表达增加(P<0.05),而BDNF mRNA表达减少(P<0.05)。与模型组比较,药物组、蒙医针组大鼠水平运动次数、垂直运动次数、糖水消耗量、中缝核区tPA和p11阳性表达、海马和中缝核区tPA和p11相对表达量均增加(P<0.05),药物组大鼠海马miRNA-16、蒙医针组大鼠海马和中缝核区miRNA-16表达均降低(P<0.05),药物组和蒙医针组大鼠海马和中缝核区BDNF mRNA表达均增加(P<0.05)。结论:抑郁模型大鼠海马和中缝核区内miRNA-16能靶向调控BDNF表达,p11/tPA/BDNF信号通路可能参与了蒙医三根平衡针的抗抑郁效应。

microRNA-16在人结肠癌组织中的表达及对结肠癌细胞增殖、侵袭、周期和凋亡的影响

目的探讨microRNA-16(miRNA-16)在人结肠癌组织中的表达及对结肠癌细胞增殖、侵袭、周期和凋亡的影响。方法收集30例结肠癌患者的结肠癌组织、癌旁组织及正常结肠组织标本。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测miRNA-16在人结肠癌组织和人结肠癌细胞系SW480中的表达,分析不同临床特征结肠癌患者结肠癌组织中miRNA-16的表达水平。将miRNA-16转染至SW480细胞作为转染组,以未转染的细胞作为对照组,应用RT-PCR检测miRNA-16的表达水平,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果结肠癌组织中miRNA-16的表达水平为(0.375±0.156),明显低于癌旁组织的(1.000±0.020)和正常结肠组织的(0.941±0.102),差异均有统计学意义(P﹤0.01)。有淋巴结转移、疾病进展结肠癌患者结肠癌组织的miRNA-16表达水平均低于无淋巴结转移、疾病未进展的患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。RT-PCR检测结果显示,转染组中miRNA-16凝胶条带的亮度明显强于对照组,其灰度值分别为(2.20±0.23)和(1.01±0.02),差异有统计学意义(P﹤0.01)。MTT检测结果显示,转染组和对照组细胞的增殖率比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。Transwell实验结果显示,转染组中穿透Matrigel胶的SW480细胞数量为(28.0±3.0),明显少于对照组的(91.0±4.0),差异有统计学意义(P﹤0.01)。流式细胞仪检测结果显示,转染组和对照组中G1期、S期及G2期细胞所占比例比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05);转染组细胞的早期凋亡率为(13.770±3.460)%,明显高于对照组的(1.250±0.410)%,差异有统计学意义(P﹤0.01)。结论 miRNA-16在结肠癌中低表达,过表达miRNA-16可抑制结肠癌细胞的侵袭并诱导其早期凋亡,提示miRNA-16参与结肠癌的发生发展,可能成为一种潜在的治疗靶点和生物标志物。

miR-9靶向调控跨膜蛋白16A基因对胶质瘤T98G细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨mi R-9和跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16,TMEM16A)基因在胶质瘤T98G细胞中的表达,阐明mi R-9对TMEM16A基因的靶向作用及其对T98G细胞增殖和侵袭的影响。方法运用生物信息学方法对mi R-9和TMEM16A基因的靶向配对关系进行预测,采用荧光素酶报告系统鉴定;脂质体2000转染mi R-9模拟物及干扰RNA后,Real-time PCR检测mi R-9与TMEM16A m RNA在癌细胞中的表达,Western blot检测TMEM16A蛋白在癌细胞中的表达,平板克隆形成实验检测癌细胞的增殖情况以及Transwell小室检测癌细胞体外的侵袭性。结果生物信息学软件Target Scan和mi Randa显示mi R-9与TMEM16A基因靶向配对良好,荧光素酶报告系统鉴定发现mi R-9能够抑制TMEM16A m RNA表达。Real-time PCR和Western blot检测结果均表明过表达mi R-9能够降低TMEM16A m RNA和蛋白的表达。平板克隆形成实验和Transwell实验发现过表达mi R-9能够分别抑制T98G细胞的增殖和侵袭。结论 mi R-9通过负性调控胶质瘤T98G细胞中TMEM16A基因的表达抑制癌细胞的增殖和侵袭。

苦参碱对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞生物学活性的影响

目的研究苦参碱对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts,RASFs)增殖、侵袭及细胞因子分泌的影响。方法分别采用MTT法、Transwell小室法检测不同浓度苦参碱对的影响RASFs增殖、侵袭;RT-PCR检测苦参碱对RASFs基质金属蛋白酶3(matrix metallo proteinase 3,MMP-3)、TNF-α及IL-1β表达的影响;Western blot法检测苦参碱对RASFs中NF-κB信号通路相关蛋白的影响。结果增殖实验结果表明苦参碱可剂量依赖性抑制RASFs的增殖;细胞侵袭结果表明它可显著抑制RASFs的侵袭;苦参碱可下调MMP-3、TNF-α及IL-1β的表达水平,同时它可抑制NF-κB p65的表达水平。结论苦参碱通过NF-κB信号通路抑制MMP-3、TNF-α及IL-1β的表达,进而抑制RASFs增殖、侵袭。

新疆南部维吾尔族宫颈鳞癌microRNA研究

背景与目的:宫颈癌是新疆地区尤其是新疆南部维吾尔族高发肿瘤,发病机制尚不清楚。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类具有重要调控作用的非编码小分子RNA,其表达及功能失调与肿瘤的发生、发展密切相关。本研究筛选并初步研究新疆南部维吾尔族宫颈鳞癌差异表达的miRNA,预测并分析靶基因功能。方法:采用miRNA微阵列芯片技术对5例人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16阳性的新疆南部维吾尔族宫颈鳞癌进行miRNA筛选,应用实时定量RT-PCR方法对筛选出差异表达的miRNA进行初步验证,并检测及分析在83例宫颈癌中的表达结果,应用targetscan、miRwalk、miRanda及Pictar四种软件预测其靶基因。结果:新疆南部维吾尔族HPV16阳性宫颈鳞癌差异表达基因18个,对差异表达显著的miRNA-138和miRNA-720进行了初步验证并预测靶基因,预测两者共同的靶基因是EZH2;与40例正常对照相比,miRNA-138、miRNA-720在83例宫颈鳞癌组织中均表达下调(P<0.05);下调的miRNA-138、miRNA-720与淋巴结转移、脉管浸润有关(P<0.05),但与年龄、宫颈壁累及范围及HPV16感染无明显关系(P>0.05);miRNA-720与临床分期、肿瘤体积有关(P<0.05)。结论:miRNA-138、miRNA-720在新疆南部维吾尔族宫颈鳞癌组织中均表达下调,两者共同的靶基因是EZH2,可能与宫颈癌的侵润和转移有关。

G6PD表达敲减对人宫颈癌细胞miRNAs表达谱的影响

目的比较G6PD表达敲减后人宫颈癌细胞HPV-C33A与HPV16+Siha以及HPV18+Hela中mi RNAs的表达差异,进一步了解G6PD致瘤的分子机制。方法构建G6PD表达敲减的人宫颈癌细胞株,运用mi RNAs芯片对各细胞株中mi RNAs进行对比分析,q RT-PCR对结果进行验证。结果 (1)成功获得G6PD表达敲减的人宫颈癌细胞株C33A、Siha和Hela;(2)与HPV-C33A相比,G6PD表达干扰后高危型HPV16+/18+人宫颈癌细胞株中出现多种mi RNAs差异表达的情况(P<0.05)。结论 G6PD在高危型HPV+人宫颈癌中的致瘤性与多种mi RNAs的差异表达相关。

人参皂苷Rh2对肺癌A549细胞miR-16和Bcl-2表达与生长的影响研究

目的探讨人参皂苷Rh2(G-Rh2)诱导人肺癌细胞A549凋亡作用及机制研究。方法采用2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L的G-Rh2处理A549细胞,MTT法于不同时间点测定G-Rh2对A549的生长抑制作用;倒置显微镜观察G-Rh2对A549细胞作用后的形态改变;Annexin-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况;Real-time PCR和Western-blot法分别检测G-Rh2对A549细胞中miR-16和Bcl-2蛋白表达的影响。结果与阴性对照组相比,不同浓度G-Rh2能够抑制A549肺癌细胞增殖并呈时间-浓度依赖性;GRh2作用后,A549细胞凋亡率明显增加,miR-16的表达显著增加,而Bcl-2蛋白表达显著降低。结论G-Rh2能够显著抑制A549肺癌细胞增殖并通过上调miRNA-16,下调Bcl-2的表达发挥治疗肺癌的作用。

HBx下调miR-16家族表达促进肝癌细胞恶性转化

目的乙型肝炎病毒X(hepatitis B virus X protein,HBx)蛋白通过调控蛋白编码基因表达而广泛参与人原发性肝细胞癌(简称肝癌)的发生和进展。本研究将HBx的调控功能拓展到非编码RNA领域,探讨HBx能否调控宿主肝癌细胞内microRNA(miRNA)的表达,进而参与肝癌细胞生长及恶性转化。方法利用高通量芯片分析及实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)鉴定HBx在肝癌细胞内诱发的miRNA表达变化。通过系列蛋白和mRNA表达分析,细胞周期及凋亡实验以及萤光素酶报告实验来检测miR-16家族表达抑制后HepG2肝癌细胞的生物学变化。结果芯片分析结果显示,HBx在HepG2细胞内诱发了大量的miRNAs表达变化,其中miR-16家族的低表达能在HepG2、SK-HEP-1及Huh7肝癌细胞中得到重复。同时,HBx显著上调miR-16家族的靶基因CCND1的表达。c-myc介导了HBx相关miR-16家族沉默,外源表达的miR-16/15a能通过阻滞细胞周期进展和诱导凋亡而抑制HepG2-hbx(稳定表达HBx)细胞的增殖、克隆形成及非贴壁生长能力。反之,沉默miR-16表达能促进HepG2细胞的周期进展和生长。结论 HBx能在体外改变肝癌细胞的miRNA表达谱,尤其是沉默miR-16家族表达。c-myc高表达介导了HBx下调miR-15a/16的过程且是HBx促进HepG2细胞恶性转化所必须的。因此,miR-16家族可能成为HBV相关肝细胞癌的治疗靶点。

大鼠微小RNA miR-16的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的克隆微小RNArno—miR-一16，构建其慢病毒表达载体pLV—miR-16并包装成慢病毒颗粒，为进一步研究miR一16的功能奠定了实验基础。方法从大鼠细胞基因组中用PCR的方法扩增miR-16的前体，构建了miR-16的重组表达载体pLV—miR-16，脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物（pPACK—GAG、pPACK—REV和pVSV）共转染包装细胞293TN细胞，包装产生慢病毒，以293TN细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达水平测定病毒滴度。结果经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实，成功构建携带大鼠miR-16基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光，并测得10^8〉ifu／ml。结论成功构建大鼠慢病毒载体pLV—miR-16，为深入研究rno—miR-16的生物学功能奠定了基础。