神经母细胞瘤动物模型研究进展与应用

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见的实体恶性肿瘤,居我国儿童肿瘤发病率第四位,占儿童肿瘤死亡人数的15%,高危患者存活率低。目前对于NB的发病及药物治疗机制知之甚少。NB动物模型可以表征NB发展特征,是研究预防和治疗NB的重要工具,然而尚未有一种动物模型可以模拟人类NB的所有特征。本文介绍了当前研究较多的几种NB动物模型(小鼠模型、鸡胚绒毛尿囊膜模型和斑马鱼模型),并对每种NB动物模型的种类、构建方法、特征、优缺点及研究进展做了详细阐述,同时对NB的应用方向及前景进行概括,以期为NB动物模型构建和NB治疗等提供理论依据。

昆明鼠胚胎干细胞的分离培养与鉴定

目的:从昆明系小鼠的早期胚胎分离和培养胚胎干细胞(ES细胞).方法:收集小鼠3.5 d胚龄的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,5-6d后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养,观察集落的生长情况并通过碱性磷酸酶染色、原位杂交、细胞核型分析等对细胞集落进行鉴定.结果:ES细胞集落性生长,符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性.结论:昆明系小鼠囊胚在胚胎成纤堆细胞饲养层上可以发育成ES细胞,并能进行传代培养.

表皮生长因子对小鼠早期胚胎体外发育影响的研究

目的:探讨表皮生长因子对小鼠植入前胚胎体外发育的影响。方法:用添加不同浓度EGF(epidermal growth factor)的CZB培养液对小鼠早胚进行体外培养,观察囊胚发育率和胚胎细胞数的变化。结果:HCG(human chorionic gonadotropin)注射后138 h,0.1ng/ml EGF添加组扩张囊胚率、孵化囊胚率显著高于其他各组。100.0ng/ml EGF添加组扩张囊胚率和孵化囊胚率显著低于其余各组,且囊胚细胞死亡较多。结论:EGF通过刺激囊胚期细胞分化而促进胚胎体外发育。但高浓度EGF抑制胚胎体外发育并使早期胚胎受损。

重组白细胞介素－1β对小鼠胚胎着床的影响

本文报道了重组白细胞介素－１β（ｒＩＬ－１β）对小鼠胚胎着床的影响，并对其作用机理进行初步的探讨。研究证实，ｒＩＬ－１β能够有效地阻断妊娠第３、４天小鼠胚胎着床的发生，此外，ｒＩＬ－１β能致小鼠早期胚胎发育异常，运行滞缓，并改变小鼠胚泡植入阶段受卵巢激素调控的子宫内膜有丝分裂模式，还诱发着床前子宫腔白细胞浸润现象。上述结果表明，ｒＩＬ－１β对抗着床效应是多因素的协同作用。

锌缺乏及补锌对小鼠胚胎HOX3.5基因表达的影响

为研究锌缺乏及补锌对小鼠胚胎HOX3 5基因表达的影响 ,将昆明种雌性小鼠随机分为缺锌组(ZD)、缺锌后补锌组 (ZR)和常锌对照组 (ZN)。ZD组及ZR组喂饲含锌量为 (3 0± 0 5 )mg kg的缺锌饲料 ,但ZR组小鼠从孕第 7天开始改喂含锌量为 30mg kg的常锌饲料。ZN组小鼠一直食用常锌饲料。经 2 5天喂养后 ,与同系成年雄鼠交配。于妊娠第 12天时处死动物 ,并立刻剖腹取出胎鼠。用地高辛标记的探针 ,采用原位杂交方法检测小鼠胚胎HOXC4(3 5 )基因mRNA在鼠胚冰冻切片上的表达量。结果发现 :ZD、ZR组HOX3 5基因阳性表达的面密度及其平均光密度明显低于ZN组 (P <0 0 5 )。提示 :锌缺乏时可导致HOX3 5基因表达量下降 ,这种调控作用乃发生在胚胎发育的早期 ,从孕早期 (孕 7天 )

胎鼠性别决定区蛋白基因快速检测(英文)

目的 :为了将雄性胎鼠组织细胞移植进入雌性受体鼠 ,Y染色体特异的性别决定区蛋白基因 (sexde terminingregionprotein ,Sry)作为常用的遗传标志需要在细胞分离前快速检测 ;为了检测孕 14d胎鼠的Sry基因 ,我们建立了一种快速的PCR方法。基于C5 7BL/ 6J小鼠Sry基因序列 ,我们设计了特异检测引物 ,并优化了PCR的反应条件包括引物和循环参数等。方法和结果 :模板的制备时间约 30min。取约 1mg胚胎组织 ,以 10mmol/LTris10mmol/LEDTApH 8 0缓冲液洗涤 2次 ,然后以 2 0 0 μL裂解液 ( 2 0mg/LproteinaseK ,0 5 %NP - 4 0 ,and 0 0 5 %Tween 4 0 )悬浮 ,再在 6 0℃孵育 15min以消化蛋白 ,95℃以上 5min灭活蛋白酶K。取 5 - 10 μL作为模板。PCR反应总体积为 5 0μL ,使用两套引物同时扩增 ,一套扩增Sry目的基因片段 ,另一套扩增IL - 3基因片段作为内对照。扩增时间为 1 5h。扩增产物 10 - 15 μL采用 2 5 % - 3%的琼脂糖凝胶在 12 - 15V/cm的电压下电泳。 10min即可观察电泳结果。根据引物设计判断结果 ,Sry目的基因片段为 4 4 4bp、IL - 3基因片段为 6 4 9bp。操作约 10个胚胎总时间小于 3 5h。PCR扩增的特异性与特异探针荧光原位杂交结果一致。结论 :该PCR方法为检测胎鼠性别决定区蛋白基因的快速、简单?

平皿-微滴法玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

目的 :使用平皿 微滴法玻璃化冷冻小鼠 8～ 12细胞胚胎 ,检验该方法对胚胎的冻存效果。方法 :胚胎在EG2 0 中平衡 3min ,EFS4 0 中平衡 1min ,将含有胚胎的小于 0 .5 μl的EFS4 0 微滴吹于 35mm平皿上并立即直接浸入液氮保存。结果 :解冻后胚胎回收率达到 98.1% ,透明带无破损 ,冷冻后存活率为 95 .2 %。冻融胚胎体外发育和体内发育能力与对照组胚胎比较差异无显著性 (84 .3%对 90 .1% ,12 .1%对 13.5 % ,P >0 .0 5 )。结论 :小鼠 8～ 12细胞胚胎可以用平皿 微滴法有效地进行玻璃化冻存。

维生素A缺乏及补充对小鼠子代发育的影响

目的 通过建立小鼠维生素A缺乏模型 ,研究维生素A对小鼠胎仔发育的影响。方法 对维生素A缺乏之孕鼠分不同阶段补充维生素A ,观察胎鼠发育情况。结果 维生素A缺乏使胎鼠的体重、身长、尾长明显小于正常对照组 (P <0 0 5 ) ,囟门矢义冠内 0 2 6 8cm× 0 2 2 8cm ,明显大于对照组的 0 2 0 6cm× 0 0 78cm ;骨异常率为33 33% ,对照组仅为 7 32 % ,胸骨异常率为 48 72 % ,对照组为 2 44 % ,差异均有显著性明显大于正常对照组 ,胎仔骨骼发育异常 ,神经反射发育迟缓 ,且出现脑膨出及细小肾等畸形。交配后第 7天补充组明显好于缺乏组 ,但与正常对照组相比仍有差异。交配后第 0天补充组与正常对照组无差异。结论 揭示维生素A对胚胎的生长发育十分重要。

下调蛋白激酶Wee1B表达对小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的促进作用

目的:利用特异性发夹结构Wee1BshRNA,探讨蛋白激酶Wee1B对小鼠受精卵早期发育的影响。方法:超排卵方法获得小鼠1-细胞期受精卵并显微注射质粒,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、Control shRNA注射组和Wee1BshRNA注射组,收集各组卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1B shRNA的干涉效能;荧光显微镜观察受精卵的形态变化、计数卵裂率;放射自显影测定Wee1B活性。结果:与TE缓冲液和Control shRNA注射组比较,Wee1BshRNA注射组小鼠1-细胞期受精卵Wee1BmRNA水平和蛋白表达显著降低;与其他3组比较,Wee1BshRNA注射组Wee1B的激酶活性明显降低;未注射组、TE缓冲液注射组和Control shRNA注射组在hCG注射33h后1-细胞期受精卵的卵裂率分别为71.91%±1.74%、72.90%±2.25%和72.28%±2.06%,3组间比较差异无统计学意义(P>0.05);而Wee1BshRNA注射组的卵裂率提高18.00%,为90.00%±0.77%,与其他3组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:Wee1B表达沉默可提高小鼠1-细胞期受精卵的卵裂率,说明Wee1B负调控小鼠受精卵有丝分裂的进程。

小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究

目的 为扩大胚胎来源并获取特定胚龄胚胎 ,建立小鼠冷冻胚胎库。方法 运用超数排卵、体外受精与胚胎培养及胚胎冷冻技术系统研究了小鼠受精卵的体内发育与运行规律。卵母细胞的体外成熟与受精、单细胞胚胎培养及胚胎快速冷冻。结果 (1)注射hCG后 12～ 2 0h受精卵发育至原核期 ,4 2～ 4 8h为 2 细胞期 ,4 8～ 6 0h为 4 细胞期 ,6 0～ 6 8h为 8 细胞期 ,以上各期受精卵均处于输卵管中 ;75～ 78h为桑椹胚 ,78～ 80h为致密桑椹胚 ,90～ 92h为早期囊胚 ,92～ 96h为囊胚 ,以上各期均处于子宫角中。 (2 )培养液中添加促性腺激素 (FSH与hCG) ,能显著提高卵母细胞的体外受精率 ,添加FCS和激素组的体外受精率又显著高于单独添加激素组 ,FCS还能显著提高胚胎发育。 (3)在培养液中添加EDTA ,能有效克服小鼠胚胎的 2 细胞阻断 ,其 2 细胞胚的发育率达 10 0 % ,8 细胞胚发育率达 5 5 %以上 ;牛、羊上皮细胞培养液上清也能有效克服 2 细胞阻断。添加乳酸钠和丙酮酸钠可使 2细胞与 8细胞期胚的发育率显著提高。 (4)以D PBS +甘油 +蔗糖为冷冻液 ,以D PBS +蔗糖为稀释液 ,对小鼠胚胎进行快速冷冻 ,桑椹胚的存活率为 6 9 3% ,早期囊胚的存活率为 6 0 4 %。结论 研究为将生物技术应用于小鼠 。

罗比卡因和利多卡因对小鼠体外受精和早期胚胎发育的影响

目的 :应用昆明小鼠胚胎体外培养模式和小鼠体外受精模型探讨罗比卡因与利多卡因对体外受精和早期胚胎发育的影响。方法 :( 1 ) 2 -细胞期胚胎培养 :取 4～ 6周昆明雌鼠 ,下午 4～ 6时腹腔注射孕马血清 ( PMSG) 5IU,48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素 ( h CG) 5IU超排卵 ,随即雌雄合笼。次日早上 9时检查阴栓 ,阳性者于注射 h CG42h后取 2 -细胞期胚胎 ,分别放入含 1、1 0及 1 0 0μg/ ml不同浓度的罗比卡因和利多卡因的M1 6培养液中培养 ,培养液中加入输卵管上皮 ,72 h后观察桑椹胚或囊胚形成率。 ( 2 )体外受精 :从 F1代 ( C57× CBA)杂交雄鼠附睾和输精管取精子 ,从昆明雌鼠取卵母细胞 ,卵母细胞体外受精前暴露于不同浓度的利多卡因和罗比卡因 3 0 min,统计体外受精率。结果 :罗比卡因只在高浓度 1 0 0 μg/ ml时对 2 -细胞至囊胚期的胚胎发育产生明显抑制影响。利多卡因则在 1μg/ ml的浓度即对 2 -细胞期胚胎发育产生明显抑制。而 1 0和 1 0 0μg/ ml的利多卡因和罗比卡因均未对体外受精率有明显影响。结论 :提示罗比卡因可能用于体外受精技术中有关配子和合子取出或植入时的麻醉。

谷氨酰胺诱导小鼠热休克蛋白70表达的研究

【目的】研究谷氨酰胺(Gln)对小鼠肝脏、子宫、卵巢组织热休克蛋白70(Hsp70)表达以及对小鼠早期胚胎体外发育的影响。【方法】选取24只8w健康的雌性昆明小白鼠并随机分成4组,Ⅰ组为对照组,尾静脉注射生理盐水,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别注射不同剂量的Gln,注射后4h处死,取肝脏、子宫和卵巢,采用RT-PCR和WesternBlot法检测HSP70mRNA和HSP70的表达;用添加不同浓度Gln的葡萄糖-CZB培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养,观察囊胚发育率和孵出率,用WesternBlot方法检测小鼠囊胚Hsp70的表达。【结果】Gln注射组鼠组织中Hsp70表达量均高于对照组,且Hsp70表达量随着Gln注射量的增加而增加。Ⅱ组鼠肝脏、子宫和卵巢组织中Hsp70蛋白表达量比对照组分别增加了9.49%、5.49%和4.84%(P>0.05);Ⅲ组鼠各组织中Hsp70比对照组分别显著(P<0.05)增加了23.56%、21.10%和14.30%;Ⅳ组肝脏组织中HSP70比对照组显著增加了35.33%(P<0.05),子宫和卵巢比对照组分别极显著(P<0.01)增加了33.94%和33.77%;Gln为6和10mmol·L-1的胚胎培养液中小鼠囊胚孵出率分别为73.21%和76.41%,显著(P<0.05)高于对照组(61.88%)。【结论】Gln能诱导小鼠肝脏、子宫、卵巢组织和囊胚Hsp70的表达,并且Hsp70表达量随着Gln剂量的加大而增加;Gln对体外培养的小鼠早期胚胎的发育有明显促进作用。

移植方法和培养液对显微注射生产转基因小鼠的影响

研究了移植方法和培养液对显微注射法生产转基因小鼠的影响。结果表明 ,小鼠受精卵显微注射外源基因后 ,进行单、双侧输卵管移植 ,受体的妊娠率分别为 34.4 %和 37.5 % (P>0 .0 5 ) ,差异不显著 ;但仔鼠成活率分别为 83.6 %和 97.2 % (P<0 .0 5 ) ,差异显著。用 M2和改良的 M2培养液作为显微注射及移植工作液 ,体外培养的囊胚率分别为 17%和 35 % (P<0 .0 1) ,差异极显著 ,体内发育的情况也与这一结果相似 ,妊娠率分别为 35 .9%和 6 2 .5 % (P<0 .0 5 )。表明改良的 M2培养液的成分结构更适合小鼠胚胎发育的要求。

系统低温生物学技术在实验小鼠资源保存中的建立与应用

目的建立小鼠胚胎与配子冷冻库，以安全、有效地保存小鼠资源。方法选择不同遗传背景（近交系、远交群、免疫缺陷、疾病模型和基因改变等）的实验小鼠，系统进行了超数排卵、体外受精（IVF）率、胚胎与精子的冷冻复苏效果、卵巢冷冻与移植、辅助体外受精等比较研究。结果①小鼠年龄和遗传背景的不同，其超数排卵的结果也不同（P〈0．01）。三个日龄段中，28日龄最好，其次为112日龄，56日龄最差；不同遗传背景小鼠的超数排卵结果显示，封闭群和大部分近交系小鼠优于转基因小鼠（P〈0．05），自发性疾病小鼠和基因剔除小鼠的结果最差；②不同品系小鼠的新鲜精子和冻融精子的体外受精率差异有显著性（P〈0．05），特别是C57BL／6J小鼠冻融精子的IVF率（10．3±4．2％）与新鲜精子（89．8±4.8％）相比，差异极显著（P〈0．01）；③不同品系小鼠的胚胎复苏率，除MRL／mp小鼠的复苏率略低外，其他小鼠品系均有较高的冷冻胚胎复苏率（58．2％～83．9％），表明，不同遗传背景小鼠之间差异有显著性（P〈0．05），但均可以达到有效保存小鼠资源的目的。④小鼠的遗传背景、年龄等对小鼠精子的冷冻效果都有影响，采用改良的FERTIUP冷冻保护剂和细胞质内单精注射（ICSI）技术可有效提高以C57BL／6J为背景的基因改变小鼠的精子冷冻复苏率。⑤卵巢冷冻保存可以改善雌性小鼠的繁殖困难或不孕。结论小鼠资源的安全保存，除了长期连续繁殖保种外，最好的或最保险的方法是低温保存。通过将胚胎、配子、卵巢等长期保存在液氮（-196℃）中避免遗传性状的改变，并在将来复苏后获得正常的小鼠后代，以用于生物学和医学等研究。

不同波段红外线对小鼠胚胎发育作用的实验研究

目的:研究不同波段红外线对小鼠胚胎的作用。方法:采用不同波段的红外线对正常孕鼠及环磷酰胺(CP)致毒孕鼠的照射,观察了受孕母鼠的体重变化,活胎率、死胎率、吸收胎率以及胎鼠的身长、尾长、体重等指标。结果:单纯红外线照射各组孕鼠的体重、胎鼠的体重、身长、尾长都有增加。其中中波红外线组与正常对照组相比有显著性差异(P<0.01)。阳性对照组(CP组)与正常对照组比较活胎率、死胎率、吸收胎率、胎鼠的体重、身长、尾长均有显著性的差异(P<0.01),CP可明显抑制胎鼠的发育及降低胎鼠的活胎率。红外线+CP各组与阳性对照组比较,活胎率、吸收胎率、死胎率、胎鼠的体重、身长、尾长均有显著性差异。结论:红外线特别是中波红外线能促进胚胎的生长并对CP引起的胚胎发育障碍有一定的缓解作用。

绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种

目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型,并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法,把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠,经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。

小鼠胚胎徒手分割技术的研究

目的 研究不同分割液和分割前胚胎去致密化与否对昆明白系小鼠的桑椹胚和囊胚的徒手分割以及分割后胚胎移植的影响。方法 在mPBS、1 2 5 %蔗糖液和进口分割液三种不同分割液中对桑椹胚和囊胚进行徒手分割。结果和结论 在蔗糖液与进口分割液中分割桑椹胚 ,成功率显著高于mPBS处理组 (6 9 5 3%、77 4 0 %vs5 6 82 % ) (P <0 0 5 ) ,而半胚的囊胚发育率及囊胚细胞数三组差异均无显著性 (P >0 0 5 ) ;在蔗糖液与进口分割液中分割囊胚 ,分割后半胚培养的囊胚发育率显著高于mPBS处理组 (72 38%、74 2 9%vs 5 6 2 0 % ) (P <0 0 1 ) ,而分割成功率及囊胚细胞数三组差异均无显著性 (P >0 0 5 ) ;各处理组半胚的囊胚发育率及囊胚细胞数都显著低于对照组体外培养桑椹胚的囊胚发育率 (98 70 % )和囊胚细胞数 (6 3 6 7± 5 78) (P <0 0 1 ) ;桑椹胚经去致密化处理后分割 ,其分割成功率显著高于未处理组 (82 90 %vs 5 6 6 0 % ) (P <0 0 1 ) ,处理组半胚培养的囊胚发育率也显著高于未处理组 (73 80 %vs 4 6 80 % ) (P <0 0 1 ) ;共移植 1 4 2枚 2分胚形成的囊胚移植于 1 1只受体 ,其中 3只妊娠 ,分别产仔 2只、3只和

小鼠雌性和雄性胚胎原始生殖细胞发育的比较研究

目的观察研究小鼠雄性和雌性胚胎中原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCs)发育的差异,为进一步深入研究PGCs以及生殖细胞发育的基因调控提供实验依据。方法在本研究采用C57BL/6J小鼠胚胎为实验材料,通过石蜡切片、免疫荧光组织化学染色方法,检测C57BL/6J小鼠胚胎在11至13.5d之间生殖嵴发育的形态学改变,比较雌性和雄性胚胎中原始生殖细胞数量与增殖的变化。结果发现雄性和雌性胚胎中PGCs的数量在13.5d最多,而处于增殖期的PGCs在13d时最多;在13d的雄性胚胎中,PGCs数量上显著高于雌性,并且其中增殖期的PGCs也较雌性的多。结论在胚胎发育早期(11至13.5d),小鼠PGCs的发育存在性别差异。

小鼠胚胎神经系统发育过程中mBD-4的表达

目的观察β-防御素4(mouseβdefensin 4,mBD-4)在小鼠胚胎神经系统发育不同时期的基因表达及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导孕鼠后mBD-4在胚鼠神经系统的的表达情况。方法孕鼠分为LPS组(n=10)和正常对照组(n=10),取不同时期(5.5、8.5、11.5、17.5天)小鼠胚胎,LPS组于胚胎提取1天前母鼠腹腔注射LPS,正常对照组同时间注射同量的生理盐水,胚胎取出后石蜡包埋切片,免疫组化方法和RT-PCR技术检测mBD-4的阳性表达。结果 mBD-4在小鼠胚胎早期第5.5天的神经组织中未见固有表达,到胚胎第8.5天开始有少量固有表达,到胚胎中晚期,固有表达含量增多;LPS组中胚胎神经组织中自5.5天有阳性表达,且随着胚胎的发育其阳性表达越强。结论①mBD-4在小鼠胚胎神经系统中固有表达,在胚胎第8.5天有少量表达,且随着神经系统的发育成熟,mBD-4在其神经组织中表达含量越多。③mBD-4在LPS的诱导下,其在神经组织中表达明显增高。