microRNA146a在干眼中的表达及作用

目的研究microRNA146a在干眼小鼠模型中的表达及作用。方法5周龄BALB/c雄性小鼠20只,左眼为正常对照组(20眼),右眼为干眼组(20眼)。用2 g·L^(-1)苯扎氯铵诱导小鼠建立中重度干眼模型。造模完成3 d后,采用泪膜破裂时间(break-up time,BUT)和角膜荧光素钠染色(fluorescein staining,FLS)对小鼠进行眼表相关检查;随后随机选取10只小鼠,采用HE染色观察正常对照组和干眼组角膜和结膜的组织结构差异,结膜PAS染色后计数杯状细胞的量并对比;剩余10只小鼠分别提取角膜与结膜组织的总RNA,采用实时荧光定量PCR检测microRNA146a、白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、IL-8以及IL-1受体相关激酶1(IL-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor-6,TRAF6)的相对表达量。结果完成干眼造模3 d后,干眼组BUT为(3.640±0.493)s,明显低于正常对照组的(10.645±0.583)s,差异有统计学意义(P<0.05);干眼组角膜FLS评分为(14.650±0.860)分,明显高于正常对照组的(1.233±0.927)分,差异有统计学意义(P<0.05)。小鼠角膜和结膜组织HE染色结果显示:与正常对照组相比,干眼组角膜上皮欠平整,细胞数量增多,角膜基质层胶原纤维排列紊乱,成纤维细胞活化;干眼组小鼠结膜上皮细胞数量增多,排列欠规整,并伴有缺损。小鼠结膜PAS染色结果显示:干眼组结膜杯状细胞数量为(9.500±4.506)个,相较于正常对照组的[(29.667±8.756)个]明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示:干眼组角膜和结膜中microRNA146a、IL-1、IL-6、IL-8的相对表达量相较于正常对照组均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。相较于正常对照组,干眼组角膜中I-RAK1的相对表达量降低,TRAF6的相对表达量升高,而干眼组结膜中IRAK1的相对表达量升高,TRAF6的相对表达量降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论干眼时机体可通过增加microRNA146a的表达,以及其对炎症中靶点的调控作用,从而形成对干眼炎症反应的负反馈调节机制。

microRNA146a在自身免疫性疾病中作用的研究进展

小分子RNA(microRNA)是一类内源基因非编码单链小RNA分子,可通过转录后抑制调节细胞的增殖、分化、凋亡及免疫应答等重要生命过程。microRNA146a(mi R146a)是最早被发现参与调节免疫反应的miRNA,它的异常表达与自身免疫性疾病的发生与发展密切相关,在自身免疫性疾病的研究中受到广泛关注,研究miR146a在自身免疫性疾病的作用机制有助于其诊断与治疗。该文对mi R146a在自身免疫性疾病中作用的研究进展作一综述。

LncRNA MALAT1通过靶向miR-146a调节PI3K/Akt信号通路影响胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的 探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)肺腺癌转移相关转录子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)通过调节miR-146a对胃癌(gastric cancer, GC)细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法 收集GC组织和配对正常胃上皮组织,将GC细胞MNK-45分为空白对照(blank control, BC)组(未转染)、MALAT1 siRNA-NC组(转染MALAT1 siRNA-NC)、MALAT1 siRNA组(转染MALAT1 siRNA)、miR-146a mimics-NC组(转染miR-146a mimics-NC)、miR-146a mimics组(转染miR-146a mimics)、MALAT1 siRNA+miR-146a inhibitor-NC组(共转染MALAT1 siRNA+miR-146a inhibitor-NC)、MALAT1 siRNA+miR-146a inhibitor组(共转染MALAT1 siRNA+miR-146a inhibitor)。定量荧光PCR(qRT-PCR)检测胃组织或细胞中MALAT1、miR-146a表达量;CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖能力;Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力;RNA pull down实验、双荧光素酶报告实验分析MALAT1和miR-146a的结合情况;Western blot检测磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路蛋白及c-Myc、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)蛋白表达量。结果 转染MALAT1 siRNA可明显降低MNK-45细胞的MALAT1表达量,敲低MALAT1或过表达miR-146a可降低细胞活力、克隆能力、迁移和侵袭,增加miR-146a表达,降低PI3Kp85α、PI3Kp85β、c-Myc、MMP9蛋白表达量及p-Akt/Akt水平;MALAT1可结合并靶向下调miR-146a表达;低表达miR-146a可逆转敲低MALAT1对MNK-45细胞增殖、迁移和侵袭的抑制效应。结论 MALAT1可能作为ceRNA吸附并降解miR-146a,敲低MALAT1可上调miR-146a表达,并通过PI3K/Akt通路抑制GC细胞增殖、迁移和侵袭。

三参通脉合剂对慢性心力衰竭大鼠的作用机制观察

目的探讨三参通脉合剂对慢性心力衰竭(CHF)大鼠的治疗作用及其机制。方法共104只大鼠,随机取8只大鼠作为正常对照组,灌服生理盐水1 mL/100 g体质量,1次/d。将其余96只大鼠随机分为模型组、microRNA146a(miR146a)mimic组、miR146a inhibitor组、药物高剂量组、药物中剂量组、药物低剂量组、miR146a mimic+药物高剂量组、miR146a mimic+药物中剂量组、miR146a mimic+药物低剂量组、miR146a inhibitor+药物高剂量组、miR146a inhibitor+药物中剂量组、miR146a inhibitor+药物低剂量组,每组8只。各miR146a mimic组先行在大鼠心肌中注射miR146a mimic0.2μL/g,各miR146a inhibitor组先行在大鼠心肌中注射miR146a inhibitor 0.2μL/g,24 h后再制作CHF模型,模型组、miR146a mimic组、miR146a inhibitor组、药物各剂量组、miR146a mimic+药物各剂量组、miR146a inhibitor+药物各剂量组均在同一天造模。造模成功后,药物高、中、低剂量组分别灌服三参通脉合剂药液3、2、1 mL/100 g体质量,连续灌服6周。对比各组一般情况,超声心动图指标[左心室收缩末期内径(LVIDs)、左心室舒张末期内径(LVIDd)、收缩末期室间隔厚度(IVSs)、舒张期室间隔厚度(IVSd)、左室射血分数(LVEF)及左室轴缩短率(LVFS)],心肌组织病理变化,大鼠血清N端脑钠肽前体(Nt-proBNP)、超敏C反应蛋白(Hs-CRP)、血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ)水平,心肌组织NF-κB(核转录因子κB)、TRAF6(肿瘤坏死因子受体相关因子)mRNA表达。结果与正常对照组相比,模型组及miR146a inhibitor组一般情况较差,心肌炎症反应以及心功能损伤程度较重,心肌细胞变性、坏死、纤维增生较重。与模型组相比,药物组、miR146a mimic组、miR146a mimic+药物组对Nt-proBNP、NO、Hs-CRP、AngiotensinⅡ水平均有正向干预作用(P<0.05),超声心动指标均改善(P<0.05)。而miR146a inhibitor组与正常对照组及模型组比较,对Nt-proBNP、NO、HsCRP、AngiotensinⅡ水平均有负向干预作用(P<0.05)。但miR146a inhibitor+药物高剂量组与模型组对比,Nt-proBNP及AngiotensinⅡ水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。同时,与模型组相比,miR146a mimic组和高剂量三参通脉药物组NF-κB、TRAF6 mRNA表达降低。结论三参通脉合剂能有效改善CHF大鼠的心功能和心肌活性,该作用可能与激活miR146a表达,从而下调NF-κB、TRAF6表达有关。

糖尿病周围神经病变合并睡眠呼吸暂停综合征相关机制探讨

糖尿病周围神经病变(Diabetic peripheral neuropathy,DPN)是2型糖尿病(diabetes mellitus,DM)慢性并发症之一,炎症及氧化应激在DPN发挥关键作用,其中NF-κB途径是主要通路,其下游重要的趋化因子MCP-1水平与糖尿病神经病理性疼痛相关,而NF-κB途径受microRNA146a的调控。近年来发现DPN合并OSAHS患者并不少见,氧化应激和炎症是两者的共同发病机制,探讨NF-κB通路及其下游的炎性介质在其中的作用机制,有助于发现潜在的抗炎方法,以更好地延缓DPN合并OSAHS患者的进展。

用于鉴定microRNA靶基因的新型双萤光素酶报告基因系统的构建及应用

目的:构建用于鉴定microRNA靶基因的报告基因系统。方法:在pGL3-Basic载体的luc基因上游插入CMV启动子,下游插入用于克隆靶基因3'UTR的多克隆位点,构建报告基因载体pMIR-luciferase;将pMIR-lu-ciferase载体的luc基因替换成Rluc基因,构建内参载体pMIR-control;将补体因子H(CFH)的3'UTR插入pMIR-luciferase载体的多克隆位点处,构建含有CFH 3'UTR的报告基因载体;用pIRES2-EGFP载体构建microRNA146a真核表达载体;将含有CFH 3'UTR的报告基因载体、microRNA146a真核表达载体及内参载体共转染HepG2细胞,进行报告基因的活性检测。结果:构建了报告基因载体、内参载体和microRNA146a真核表达载体,经酶切和测序鉴定正确;microRNA146a真核表达载体转染细胞72 h后,经荧光显微镜观察确认载体转染及表达;用实时定量PCR检测,microRNA146a的表达水平显著上调(P<0.01);用构建的报告基因系统检测,结果表明microRNA146a显著地抑制了含CFH 3'UTR的报告基因的活性(P<0.05)。结论:构建了一种新型的报告基因载体系统,该系统可用于miRNA靶基因的鉴定。

格列卫对K562细胞中miR-146a、miR-29b及3种甲基化酶表达的影响

目的观察BCR/ABL抑制剂格列卫作用后K562细胞中microRNA(miR)-146a及miR-29b的表达水平变化及DNMT1、DNMT3a、DNMT3b3种甲基化酶水平的改变。方法 MTT法检测格列卫作用于K562细胞时的IC50浓度。通过茎环引物法及荧光定量PCR的方法检测miRNAs以及甲基化酶基因的水平。结果格列卫作用于K562细胞时的IC50浓度为40.85μmol/L。格列卫作用后miR-29b表达出现了上升的趋势而3种甲基化酶基因表达水平均有所降低,miR-146a的水平显著升高(P<0.05)。结论格列卫能影响K562细胞中miR-146a、miR-29b和3种甲基化酶的表达水平。

电针对睡眠剥夺大鼠脾脏TLR4信号通路以及miR146a的影响

目的:观察电针对睡眠剥夺大鼠脾脏TLR4/NF-κβ信号通路上关键因子Toll样受体4(TLR4)、核因子-κβ(NF-κβ)、白细胞介素1受体相关激酶1(IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)和微小核糖核酸146a(miR146a)表达的影响。方法:将32只雄性SPF级Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、安定组和电针组,每组8只。对照组未做任何处理,其余3组注射对氯苯丙氨酸(PCPA)进行睡眠剥夺后,安定组腹腔注射安定注射液,电针组给予电针百会、神庭,每组每天治疗1次,连续5天后采用RT-PCR检测大鼠脾脏TLR4、NF-κβ、IRAK1、TRAF6和miR146a的表达情况。结果:与对照组比较,模型组大鼠脾脏TLR4、NF-κβ、IRAK1、TRAF6的mRNA表达量明显升高,脾脏miR146a的表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,安定组和电针组大鼠脾脏TLR4、NF-κβ、IRAK1、TRAF6的mRNA表达量显著降低,安定组大鼠脾脏miR146a的表达量显著降低,电针组大鼠脾脏miR146a的表达量明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:电针百会、神庭可以提高睡眠剥夺大鼠体内miR146a的表达,进而负性调节TLR4信号通路,最终达到对固有免疫应答的调控作用,减轻睡眠剥夺对机体的损害。