低能N^+离子、紫外线和^(60)Coγ射线对绛红小单孢菌产庆大霉素的诱变效应初步研究

研究了以庆大霉素生产菌绛红小单孢菌为供试菌株,比较了低能N+离子、紫外线和60Co γ 射线对绛红小单孢菌的剂量存活效应和诱变效果。结果发现,N+离子注入的存活曲线与紫外线、60Co γ 射线辐照不同,即紫外线,60Co γ 射线照射绛红小单孢菌的剂量存活曲线均是指数曲线,而N+离子注入呈复杂下降、上升、再下降的趋势,而且3种辐射在诱变效应上也有很大的差异。在相同死亡率条件下,紫外线诱变率低,但正变多于负变,而 γ 射线诱变率高,负变远远多于正变。适当剂量的N+离子注入表现出诱变率高、正变率高及正变幅度大的特点,效果更像紫外+LiCL的复合诱变。并确定了N+离子注入绛红小单孢菌的适宜诱变剂量是在存活率高峰处附近。

绛红色小单孢菌G1008接合转移体系的构建

目的构建绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)的接合转移体系,并对该体系进行优化。方法以绛红色小单孢菌G1008染色体DNA为模板,经PCR扩增甲基化酶基因gntK的上下游序列各2000bp左右作为同源交换臂,并将红霉素抗性基因作为筛选标记插入两交换臂之间。以温敏型质粒pKC1139作为基本载体,构建重组质粒pFD306。借助接合转移技术,将该质粒导入绛红色小单孢菌G1008。结果经抗性筛选,得到一株阳性菌株,命名为GK1008,经PCR鉴定和测序,验证了重组质粒已整合到染色体上。GK1008菌株对红霉素和安普霉素的抗性均超过500μg/mL。结论绛红色小单孢菌接合转移体系的构建达到了预期目的,并实现了对该体系的优化,这为其它小单孢菌的分子遗传学操作提供了借鉴。

庆大霉素高产菌株的抗性方法选育

以生产菌株绛红小单孢菌为出发株,应用N+离子注入及紫外线诱变技术,利用高浓度的庆大霉素梯度平板筛选,或配合含有高浓度庆大霉素的液体培养基的生态驯化,筛选到摇瓶效价分别比出发株提高75.2%和70.1%的N08和Wt63两个高产菌株,10 L发酵罐发酵产量分别达2 118 u/mL和1 843 u/mL,C组分含量符合中国药典2000版的规定.

一株产庆大霉素B的绛红小单孢菌的分类鉴定

通过对一株自行筛选的野生稀有放线菌菌株的分类地位进行了研究,鉴定其分类地位。采用常规方法进行分离培养,以形态学特征、培养特性、生理生化特征及分子生物学等方法对其进行分类鉴定。将所分离的菌株进行摇瓶发酵,将发酵液上清液采用HPLC进行组分检测。该菌株菌落微黄色或浅棕色;产红色色素,气生菌丝不发达,基内菌丝直径平均0.4~0.8μm,产单孢子,生理生化特征与绛红小单孢菌相似,16 S rDNA测定结果与Micromonsopora sp.（EU214948）序列同源性达97%,与M.purpurea（X92595）最为接近。其发酵产物中含有庆大霉素B、小诺霉素和庆大霉素。鉴定该菌株为产庆大霉素B的小单孢菌属绛红小单孢菌（Micromonos-pora purpurea）。

N^+诱变绛红小单孢菌提高其庆大霉素生产能力及条件优化

庆大霉素产生菌绛红小单孢菌（ＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｐｕｒｐｕｒｅａＫＲ９６０７９６）（开封制药厂提供）经３０ｋｅＶＮ＋注入诱变处理，筛选到Ｂ００２０等四株高产菌株．它们的产量较出发菌株提高的幅度分别是Ｂ００２０３０．２％，Ｂ００３０２２．１％，Ｂ００１７１６．７％，Ｂ００１３１５．１％．Ｂ００１７通过条件优化，总产量提高４６％．在对Ｂ００１７进行发酵条件优化中确定了正效应因子为：料液浓度＞ｐＨ＞葡萄糖＞青霉素；负效应因子为：１１８小时，酵母汁＞ＣｏＣｌ２＞ＮＨ＋４；１２５小时，ＮＨ＋４＞酵母汁，ＣｏＣｌ２几乎无负效应．说明游离ＮＨ＋４对产量有强烈的抑制作用．

N-乙酰氨基葡萄糖对绛红小单孢菌合成庆大霉素的影响

研究了N-乙酰氨基葡萄糖对绛红小单孢菌产素的影响,实验探索了N-乙酰氨基葡萄糖添加工艺,在250mL摇瓶发酵过程中培养48h,60h分别添加0.05%,0.15%N-乙酰氨基葡萄糖可使庆大霉素生测效价达2 030U/mL,较对照1 228U/mL提高了65%以上(三次平均基本一致);5L发酵罐试产三批次发酵终结,生测效价平均为1 727U/mL(厡工艺1 097U/mL)提高了57%,效果十分明显.同时测定了发酵过程中菌体代谢各种参数的变化,证明了N-乙酰氨基葡萄糖在绛红小单孢菌生物合成中的促进作用.本方法操作简单,基本不改变原工艺,生产成本低廉,对提高庆大霉素产量效果非常明显.

磁场在庆大霉素菌种选育中的应用

本文报道磁场对庆大霉素产生菌降红小单孢菌GB_5的孢子、发芽孢子和原生质体的磁致诱变效应。在所选用的九种磁场剂量处理后,三种状态的菌种的死亡率均在60％以上,其中原生质体的死亡率达96％以上,正变率12％以上,最高达49.1％,变异率在21％以上,摇瓶初筛获得抗生素产量提高10％以上的菌种占过筛菌株数的6.1％,其中产量提高30％以上的占1.5％.

一株主产庆大霉素C2a工程菌的构建

为更好生产单组分庆大霉素C2a,拟构建一株主产庆大霉素C2a的工程菌.通过序列比对分析,锁定genB2为构建该工程菌的关键基因.以绛红小单孢菌G1008基因组为模板,PCR扩增genB2的上下游序列为同源交换臂,构建同源重组质粒pZB303.通过接合转移,将质粒pZB303导入绛红小单孢菌G1008,安普抗性及PCR扩增筛选得到一株genB2框内缺失工程菌GB102.发酵并提取代谢产物,再经TLC,HPLC,MS分析.结果表明,工程菌GB102主要积累庆大霉素C2a.有望用于生产单组分庆大霉素C2a.

庆大霉素生物合成基因genD2的研究

以绛红小单孢菌G1008基因组为模板,PCR扩增genD2的上下游序列作为同源交换臂,在温敏型穿梭质粒pKC1139的基础上,构建同源重组质粒pDB303;通过接合转移,将质粒pDB303导入绛红小单孢菌G1008,经影印筛选得到一株genD2框内缺失的工程菌GD238。发酵并提取代谢产物,质谱分析表明,工程菌GD238只积累庆大霉素A2和A2e,证明genD2参与了庆大霉素加洛糖胺上C-3″位氨甲基化,可能是编码脱氢酶基因。

庆大霉素生物合成基因genD1的研究

为研究genD1基因功能,在绛红色小单孢菌GK1101(Δgen K)上构建genD1基因缺失工程菌并分析其代谢产物组分变化。首先构建用于genD1基因框内敲除的同源重组质粒pGD14,经接合转移导入绛红色小单孢菌GK1101,经影印筛选获得genD1缺失工程菌GD1989。再发酵并提取其代谢产物,采用质谱法等检测代谢产物。结果表明,工程菌GD1989不再合成庆大霉素C1a和C2b,主要积累庆大霉素A。对工程菌GD1989喂养庆大霉素X2的发酵产物经检测含有庆大霉素C1a、C2b和JI-20A。genD1基因失活导致庆大霉素生物合成代谢流中断,说明genD1基因负责加洛糖胺C-4″位的甲基化。

绛红色小单孢菌发酵过程中细胞形态结构变化

对庆大霉素产生菌──绛红色小单孢菌发酵中细胞形态、结构变化进行了研究。扫描电镜观察，发现生长期细胞表面布满微小颗粒，生产期则形成较大突起。透射电镜观察到不同培养期细胞膜、细胞壁、细胞质、核区等超微结构都有明显变化。生长期细胞膜弯曲，胞壁薄厚不匀，核区、核糖体等清晰；生产期细胞膜与胞壁平行，胞壁变薄，出现横隔和间体。发现绛红色小单孢菌在生长期、生产期均形成横隔，提出在液体培养基中该菌以横隔方式进行繁殖。

绛红色小单孢菌烈性噬菌体Mph1的分离及其特性

从庆大霉素产生菌——绛红色小单孢72~#异常发酵液中分离到一株烈性噬菌体,能裂解绛红色小单孢菌,形成清晰的噬菌斑,直径2mm左右,侵染指示菌的潜伏期为2小时,增殖期为1.5小时,当pH小于3或大于10及温度高于60℃时明显失活.用限制性内切酶酶解噬菌体发现有EcoRⅠ、HindⅡ、BamHⅠ、SaIⅠ切割位点,DNA分子量约为30kb,电镜观察表明该噬菌体有一六角形头部和一短尾部。

绛红色小单孢菌噬菌体启动子在大肠杆菌中的克隆和表达

绛红色小单孢菌是氨基糖苷类庆大霉素、小诺霉素的产生菌。长期以来,人们对微生物的次级代谢作用进行了大量的研究,对小单孢菌也进行了细胞融合、质粒抽提及感染噬菌体等方面的研究。

绛红色小单孢噬菌体MPh1在大肠杆菌中有启动子功能的DNA片段的克隆及顺序测定

从绛红色小单孢噬菌体Ｍｐｈ１ＤＮＡ中，用大肠杆菌启动子探测质粒ｐＧＡ４６克隆到在大肠杆菌中具有启动子功能的ＤＮＡ片段，筛选到的启动子功能片段具有抗四环素能力达１００μｇ／ｍｌ以上。对这些活性片段进行分子杂交，证明确实来自绛红色小单孢噬菌体Ｍｎｈ１。在此基础上，对其中一个２５０ｂｐ长的片段从克隆位点的一端进行了ＤＮＡ序列分析，其结构类似于大肠杆菌启动子。并进行了Ｇ＋Ｃ百分比的统计和限制性内切酶位点分析。

同工异源酶基因forp与genp异源表达的研究

来自绛红色小单孢菌G1008的genp与来自橄榄星小单孢菌FOM808的forp,均参与3’,4’-双脱羟基,2个基因属于同工异源酶基因.应用同源重组原理,实现forp替换genp,探索同工异源酶基因异源表达的可能性.以温敏型穿梭质粒pKC1139为载体,构建同源重组质粒pFP4.经接合转移将载体导入到G1008基因组中,利用影印筛选和PCR验证的方法,获得基因重组工程菌FTP2.提取工程菌次级代谢产物,经TLC和MS分析.结果表明,工程菌仍然可以产生庆大霉素C组分.forp基因的功能得到了体现,外源基因forp实现了异源表达,进一步证实forp是负责参与3’,4’-双脱羟基的功能基因.

庆大霉素生物合成基因genY的研究

以绛红色小单孢菌G1008基因组为模板,构建genY基因缺失的同源重组质粒pFY103,经接合转移导入绛红色小单孢菌G1008和GK1101(△genK),筛选获得genY基因缺失工程菌GY105(△genY)和工程菌GKY205(△genK+genY),发酵、提取并经质谱检测分析代谢产物.结果表明,工程菌GY105和GKY205主要积累西索米星、庆大霉素C1a和C2b.证明genY基因缺失阻断了庆大霉素X2到G418的转化,说明genY基因参与庆大霉素生物合成过程中绛红糖胺C-6’位甲基化.

绛红色小单孢菌噬菌体防治办法的评价

庆大霉素产生菌—绛红色小单孢在工业生产时污染了噬菌体，采取综合防治的办法，能制服噬菌体，可以不停产或转产，至今已保持4年没有发生污染，表明此办法行之有效。

庆大霉素产生菌原生质体融合高产株与发酵罐试产的研究

对庆大霉素产生菌绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)原生质体分别用硫酸二乙酯(DES)和紫外线(uv)进行诱变、融合,用庆大霉素进行抗性筛选、再生后得到高产菌株;经摇瓶连续10批次发酵考查,平均发酵单位在2200±U/ml;又经5L发酵罐连续发酵考查7批次,产量平均1900±U/ml。产品质量符合药典。

小单孢菌叠加诱变与发酵过程的研究

采用庆大霉素产生菌—绛红小单孢菌(M.purpurea)在培养36h时添加15μg/ml的青霉素,对培养至48h对数生长期的菌体进行紫外线照射+亚硝基胍复合处理,置培养箱中37℃培养5～8d待长出菌落后再用紫外线照射叠加处理,获得一高产菌株N-14。试管发酵生测效价1913u/ml(对照625u/ml);摇瓶发酵培养120h达2178(u/ml),比对照(1243u/ml)提高75.2%;并进行了5L发酵罐发酵培养,发酵过程中测定了发酵液还原糖、总糖、氨基氮、pH、菌体浓度等代谢参数,探索了适合N-14的培养条件,连续5批次生测效价平均1967u/ml,较对照1171u/ml提高了68%,效果明显。

庆大霉素生物合成基因genA的功能

【目的】在绛红色小单孢菌G1008(Micromonospora purpurea G1008)上构建genA基因缺失工程菌,通过分析其次级代谢产物的变化,推测genA基因功能。【方法】构建用于gen A基因框内敲除的质粒pAB103,经接合转移导入绛红色小单孢菌G1008,安普抗性及PCR扩增筛选获得genA缺失工程菌GA1048。【结果】与出发菌G1008相比,工程菌GA1048不再合成庆大霉素C族组分,主要积累中间代谢产物庆大霉素A2。【结论】genA基因失活导致庆大霉素生物合成代谢流中断,暗示gen A基因参与加洛糖胺C-3″位的氨甲基化。