Use of Ultrastructuke and DNA Hybridization to Detect Replication of the Nuclear Polyhedrosis Virus in Midgut Cells of Homologous Host

It was controversial issue if nuclear polyhedrosis virus(NPV) could replicate in midgut cells of host larvae from Lepidoptera by now.The replication of Mythimna separata NPV(MsNPV) in M.separata larvae midgut cells was studied by ultrastructural and DNA hybridized techniques.The paper demonstrated that the MsNPV could neither infect midgut cell nor replicate in midgut cell of homologous host.Therefore MsNPV virions released from the virial occlusion bodies were considered as direct penetration though the intercellular spaces of midgut cells to hemocoel of the host larvae.

没食子酸对棉铃虫生长发育的影响及作用机理

为明确没食子酸(GA)对棉铃虫生长发育的影响和作用机理,用叶碟法对比了没食子酸等21个酚类化合物对棉铃虫幼虫的拒食活性,并从中选择了没食子酸等3种化合物测定了其对棉铃虫1龄末幼虫的拒食中浓度(AFC50),随后采用饲料混毒法检测了没食子酸对棉铃虫生长发育的影响,进一步测定了2龄幼虫中肠病理变化和生长发育相关基因的表达变化。结果表明:所测21种酚类化合物中,没食子酸对1龄末幼虫的拒食活性最显著,拒食中浓度为50.21 mg/L。以含10μg/g没食子酸的饲料饲喂棉铃虫幼虫后发现其显著抑制幼虫体重、化蛹率、羽化率和卵孵化率。苏木精—伊红染色法检测到没食子酸可诱导中肠细胞大量凋亡、杯状细胞和消化细胞膨大并呈现空泡化、围食膜消失等病理变化;qPCR分析发现没食子酸可诱导InR、p53、Atg8和G6Pase基因显著上调表达。综上,没食子酸可显著抑制棉铃虫的生长发育,同时损伤中肠,导致营养代谢紊乱,具备开发成为新型植物源杀虫剂的潜力。

苦皮藤素Ⅳ对粘虫中肠组织影响的超微结构观察

采用电子显微镜技术研究了苦皮藤素 对粘虫(Mythimnaseparata(Walker))中肠组织的影响。电镜观察结果表明,苦皮藤素 对粘虫中肠肠壁细胞的质膜和内膜系统有一定影响。在苦皮藤素 作用下,试虫的柱状细胞顶膜微绒毛扩张;线粒体肿胀;粗面内质网扩张,囊泡化;杯状细胞与柱状细胞之间间隙增大。这表明苦皮藤素 破坏了中肠细胞的结构,使中肠肠壁细胞损伤及细胞间隙增大,导致毒物易于穿过肠壁细胞间隙进入血淋巴,进而到达作用部位。

棉铃虫围食膜肠粘蛋白基因HM72的克隆、表达及其蛋白组织定位

围食膜是昆虫中肠上皮细胞分泌形成一层特有的非细胞性半透膜,肠粘蛋白是其重要的组成成分。本研究利用棉铃虫Helicoverpa armigera围食膜蛋白多克隆抗体免疫筛选棉铃虫中肠cDNA表达文库,共获得385个阳性克隆,经DNA测序和序列对比,确认其中之一为编码棉铃虫中肠围食膜肠粘蛋白的cDNA克隆HM72。序列分析显示,该cDNA全长为2888bp(GenBank登录号:HM017910),其中ORF长2469bp,编码823个氨基酸,包含起始密码子ATG和终止密码子TAA,在poly A末端上游19bp处有一个多聚腺苷酸信号序列AATTAA。氨基酸序列分析表明,其N-端含有16个氨基酸的信号肽,预测分子量为84.2kDa,等电点3.63,为酸性蛋白质。结构域分析表明,该蛋白具有5个几丁质结合功能域,一个粘蛋白结构域和两个甘氨酸-天冬氨酸富集区,该基因成功表达100kDa的目的蛋白。Western blot分析表明,HM72蛋白存在于棉铃虫中肠、围食膜、粪便及蜕中,并由整个中肠分泌,而在棉铃虫脂肪体、体壁、马氏管、唾腺、消化液、血淋巴中没有检测到HM72蛋白。

暗黑鳃金龟幼虫取食Bt后中肠细胞形态变化的初步研究

本研究利用透射电镜技术观察了暗黑鳃金龟幼虫取食Bt后不同时间其中肠细胞形态变化过程。结果表明:幼虫取食Bt后1～7d中肠不同的组织结构逐渐发生变化,第1天就出现了细胞膜溶解的现象,在第7天细胞膜完全溶解消失;其他器官出现如细胞核核膜溶解,细胞核消失,内质网消失等现象。经过中肠细胞一系列的病变,最终导致幼虫死亡。

菜青虫(Pieris rapae)感染苏云金杆菌晶体毒素后中肠上皮细胞的免疫酶标电镜观察

用双相法提纯青虫菌(Bacillus thuringiensis var.galleriae)的晶体,碱解后免疫家兔获晶体蛋白抗体,然后用纯化的晶体感染莱青虫,半小时至1小时取中肠上皮细胞作酶标电镜观察,结果表明仅在细胞膜上看到抗原的存在。

核多角体病毒侵染棉铃虫中肠细胞过程的电镜观察

本文应用电子显微镜技术观察了核多角体病毒入侵棉铃虫中肠细胞及其增殖和释放。经口接种后 3 0min ,有许多病毒粒子进入中肠后部柱状细胞的微绒毛间隙处 ,且以其粒子的一端与微绒毛接触并吸附在微绒毛表面上。接种后 1h,病毒粒子的囊膜与微绒毛的质膜以顶端对顶端、顶端对侧面发生融合 ,仅以核衣壳侵入细胞内 ,然后又继续移至微绒毛底部 ,从而进入中肠细胞内。此外 ,还发现有的病毒粒子直接与柱状细胞的质膜融合 。

中华绒螯蟹肠道肥大细胞的组织化学研究

目的应用2种染色方法对中华绒螯蟹肠道肥大细胞进行组织化学定位。方法甲苯胺蓝(TB)和阿尔新兰-藏红染色(AB/SO)对中肠,后肠和之间的肠球进行了染色。结果 TB和AB/SO两种染色均能不同程度的显示中华绒螯蟹肠道肥大细胞,且TB更为适合。肠道粘膜上皮肥大细胞的形态主要为椭圆形或者圆形。中肠的前段和中段的肥大细胞主要分布在粘膜层的上皮细胞、基膜及外膜的结缔组织中;后肠的肥大细胞主要分布在粘膜下层的结缔组织颗粒和肠腺中;肠球中肥大细胞主要分布在肠球边缘少数存在的嗜酸性颗粒和嗜碱性颗粒中。结论中华绒螯蟹肠道肥大细胞具有与其他动物有相似之处,但是也存在自身的特异性。

中华硬蜱叮咬免疫兔后中肠消化细胞形态测量分析

本文采用军事医学科学院生产的多功能系统，对叮咬经不同抗原免疫接种兔后的中华硬蜱中肠消化细胞进行形态学测量分析，以了解蜱中肠受损程度和各种抗原诱导免疫力产生的强弱。结果表明：蜱血餐后其中肠增粗，肠壁增厚：消化细胞数量增加，体积增大；而细胞核相对较小，核体密度、表面积密度变小。中华硬蜱叮咬免疫兔后上述各种吸血后的正常反应不如佐剂对照组，尤以纯化抗原接种组明显，其中肠也增粗，由于大量消化细胞受损伤而脱落，使得消化细胞数减少，由于大量消化细胞受损脱落使消化细胞数减小和消化细胞平均截面面积减小。由于核固缩、核碎裂、核溶解早于细胞碎裂脱落，使细胞核的体密度和表面积密度明显减小。与对照组相比，肠直径、肠壁面积、消化细胞截面数、数面密度、截面面积和消化细胞核的体密度及表面积密度均有显著性或非常显著性差异。受损程度依次为纯化抗原（ＰＡ）组、中肠抗原（ＭＡ）组、唾液腺抗原（ＳＧＡ）组和全虫抗原（ＷＴＡ）组。卵抗原（ＯＡ）组损伤最轻。本实验的五个免疫接种组中有四个组能有效诱导宿主产生免疫力，以１０５ＫＤ纯化抗原接种作用最强。

短稳杆菌对茶尺蠖中肠细胞形态与血淋巴解毒酶的影响

微生物农药短稳杆菌Empedobacter brevis在防治茶园茶尺蠖Ectropis obliqua Prout中得到了广泛的应用,本研究旨在了解该生物农药对茶尺蠖中肠细胞结构及血淋巴酶活性的影响,为日后更好防治该虫提供理论基础。通过毒力测定方法测定了该生物农药对5龄茶尺蠖幼虫的半数致死浓度LC50值,使用透射电子显微镜(TEM)检测了该药对茶尺蠖中肠细胞结构的影响。最后,利用酶标仪检测了该生物农药对茶尺蠖血淋巴解毒酶酶活的影响。药效毒力测定结果表明,短稳杆菌对5龄茶尺蠖幼虫的LC50值为每毫升3.077×105个孢子。透射扫描结果显示,该生物农药具有破坏5龄茶尺蠖幼虫中肠细胞结构及细胞器结构的功能;酶活性检测结果表明,该药对5龄茶尺蠖血淋巴内解毒酶(AchE、CarE和GSTs)的酶活性呈现先升高(12 h)后降低(24 h)的趋势。推测,短稳杆菌对茶尺蠖幼虫的毒杀作用可能与血淋巴解毒酶的活性及中肠细胞结构的破坏有关。

感染暴发性流行病病原的中国对虾形态学研究 2.病虾中肠的显微和亚微结构

在非生物环境因子对暴发性流行病病原实验感染的中国对虾发病影响的基础上 ,用光镜和电镜观察对虾中肠组织 .观察结果表明 :中肠上皮细胞水样变性 ,少量的上皮细胞被感染 ,肠腔内致病菌继发性感染 ,中肠肌细胞发生凋亡 .大颗粒细胞。

意大利蜜蜂胚后发育过程中中肠上皮组织细胞的更替

中肠是昆虫消化、吸收营养物质的主要部位。本研究通过形态解剖、BrdU免疫组织化学和原位末端转移酶标记(TUNEL)细胞凋亡检测等技术,对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica中肠胚后发育过程中细胞的增殖和凋亡模式进行了比较研究。结果表明:意大利蜜蜂幼虫发育早期,中肠的增加主要来自于上皮细胞的分裂以及再生细胞的增殖。在变态发育期间,中肠上皮经历了广泛的重组,由再生细胞重新形成的蛹上皮替代了幼虫上皮。再生细胞在蜜蜂中肠的整个发育阶段始终存在,为中肠的生长和更替提供了主要的细胞来源。本研究为昆虫组织细胞自噬和凋亡机制的研究提供一定的证据。

埃及伊蚊中肠上皮细胞的原代培养和细胞的持续培养(英文)

目的 探讨蚊虫中肠上皮细胞的培养 ,建立细胞的原代培养和细胞持续培养。 方法 用含抗生素的 10 %蔗糖水喂养新羽化出的埃及伊蚊成蚊 ,3d后 ,在无菌的条件下解剖中肠 ,用含抗生素的平衡盐溶液洗 3次 ,放入Grace’s培养基中 (含有 7%小牛血清 ,0 .5 %庆大霉素 ,1mg/ml抗酵母菌素和 6μl/ml复合维生素 ) ,2 5℃培养箱中培养。 结果 培养 3d后 ,95 %的细胞生长良好 ,7d后 ,大约 2 5 %的细胞死亡。第 3d的细胞死亡率明显低于以后的任何时间 (P <0 .0 5 ) ,从第 7d到 3 5d细胞死亡率差异无显著性 (P >0 .0 5 )。成功地建立起中肠上皮细胞的原代培养并能持续存活 40多天 ,保持细胞的连续培养。 结论 所发展的埃及伊蚊中肠上皮细胞的原代培养和细胞的持续培养的方法是成功的。

高浓度组织胺促进中华绒螯蟹肠道组织胺及PCNA免疫反应性

目的探讨外源组织胺对中华绒螯蟹肠道组织胺及增殖细胞核抗原(PCNA)的组织分布和表达的影响。方法用免疫组织化学方法,对组织胺处理前后中华绒螯蟹肠球,中肠和后肠进行染色。结果组织胺和PCNA阳性物质在肠球、中肠及后肠中均有分布,且不同浓度组织胺对肠道内组织胺及PCNA阳性物质数量及分布影响存在差异,高浓度组织胺组其肠球组织胺及PCNA阳性物质较对照组增多,低浓度组织胺对肠道的组织胺及PCNA的阳性物质影响无明显影响。结论外源组织胺能够影响中华绒螯蟹肠道内组织胺及PCNA的表达。

褐飞虱中肠两种氨肽酶N的鉴定及蛋白特性分析

【目的】氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是昆虫消化系统中重要的蛋白酶。本研究旨在对在褐飞虱Nilaparvata lugens中肠中两个具有较高转录水平的apn基因(nlapn1和nlapn4)在中肠上皮细胞上的表达及其蛋白功能特性进行鉴定与分析。【方法】利用最大似然法进行褐飞虱NLAPN1和NLAPN4的系统进化分析;利用Western blot分析NLAPN1及NLAPN4在中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,BBMVs)中的定位;利用LC-ESI-MS/MS技术对Western blot定位的NLAPN1及NLAPN4进行鉴定。在果蝇Drosophila S2细胞内分别表达两个NLAPN蛋白,并利用Western blot及免疫荧光定位技术对NLAPN1与NLAPN4进行S2细胞内的定位;分别以L-亮氨酸对硝基苯胺(leucine-p-NA)、L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(Ala-p-NA)、L-甲硫氨酸对硝基苯胺盐酸盐(Met-p-NA)和L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐(Lys-p-NA)为底物测定NLAPN1和NLAPN4的酶活性。【结果】系统进化树分析结果显示,褐飞虱NLAPN1及NLAPN4与其他半翅目昆虫肠道中高表达的APN分在了同一分支中。Western blot及LC-ESI-MS/MS质谱分析结果证明NLAPN1与NLAPN4均存在于褐飞虱中肠刷状缘膜囊泡中,分子量约为160 kD。Western blot及免疫荧光定位结果显示,两个NLAPN蛋白均位于S2细胞膜上,而C端缺失糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定位点的NLAPN4lackG蛋白分布在细胞质中。酶活性测定结果显示,以L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐及L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐为底物时NLAPN1和NLAPN4都具有一定的酶活性,而以L-亮氨酸对硝基苯胺为底物时NLAPN1有极高的酶活性(>60 U/mg)。【结论】NLAPN1与NLAPN4是褐飞虱中肠上皮细胞膜上高表达的两个膜结合APN蛋白,且都通过C端的GPI锚定附着在细胞膜上。NLAPN1与NLAPN4与鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫中肠膜结合APN有着近似的蛋白结构与酶学特性。膜结合APN在褐飞虱中肠中的生理生化功能及其与外源病原物的互作机制还有待进一步深入研究。

斑节对虾体长与中肠腺细胞数相关性研究

通过现场测定养殖日龄为１６～１８ｄ的斑节对虾的体长、体重和全长，并应用石蜡切片技术对被测虾的中肠腺中部进行细胞计数，研究了斑节对虾体长与中肠腺细胞数的相关性。结果表明，对虾体长与中肠腺中部每个高倍视野的平均细胞数呈密切负相关（ｒ＝－０．９４７），公式为：Ｃ＝３３０．３６２３２３ｅ－０．０８７３８４Ｌ。对虾体长与体重密切相关（ｒ＝０．９４８），可用对数回归方程描述：ｌｇＷ＝－１．９２３５７８＋３．０８２８３２ｌｇＬ。对虾体长与全长密切相关（ｒ＝０．９９５），其线性回归方程为：Ｙ＝－０．１８７１３７＋１．３１６７０５Ｘ。通过这些公式，中肠腺中部每个高倍视野的平均细胞数可由体长直接推算出或由体重和全长间接算出，使斑节对虾杆状病毒感染度的计算更加简单和准确。

中华硬蜱再次叮咬宿主后中肠消化细胞的形态测量学研究

本文用图像分析仪对初次和再次叮咬宿主兔后的中华硬蜱中肠消化细胞进行了ＤＮＡ和形态测量学分析。结果表明；蜱血餐后其中肠消化细胞ＤＮＡ增加，约第５天达高峰。初次叮咬组吸血后ＤＮＡ倍体数增加显著，第五天ＤＮＡ平均倍体数达７０６，峰值达１２Ｃ，≥５Ｃ细胞达４４２％。且随叮咬吸血时间延长，中肠增粗，直径增大；肠壁增厚，肠壁横截面面积增大；消化细胞增多，消化细胞截面数增加；消化细胞增大，消化细胞平均截面面积增大；而消化细胞数面密度下降，消化细胞核的体密度和表面积密度下降。这些结果均是对吸入血液进行消化和储存营养物质的正常反应。当中华硬蜱叮咬经初次感染后的宿主兔时，ＤＮＡ倍体数、横切面肠壁面积、消化细胞截面数、消化细胞平均截面面积等增加的幅度不如初次叮咬组，而消化细胞核的体密度和表面积密度下降更显著，提示由于初次叮咬使宿主产生了较强的免疫力而使中肠消化细胞破坏、脱落或抑制增殖而出现吸血量下降。

中国对虾体内一种结缔组织颗粒细胞的电镜观察和组化研究

运用半薄切片、超薄切片和组织细胞化学技术 ,在光镜和电镜下 ,观察研究中国对虾中肠结缔组织中的 1种颗粒细胞 ,该细胞 2 8～ 3 2 μm大小 ,细胞核小 ,胞质颗粒呈多样性。亚甲基兰染色显示 ,细胞内颗粒具异染性 ,提示这些颗粒中含有肝素类成分 ;磷钨酸乙醇法染色显示 ,该细胞内有嗜铬颗粒并具有肥大细胞颗粒的染色性质 ;焦锑酸甲法显示 ,细胞中富含Ca2 + ;酚氧化酶孵育反应显示 ,酶活性出现在受病毒感染对虾肠壁结缔组织中的这种颗粒细胞中。研究表明 :1.存在于中肠背侧结缔组织中的颗粒细胞 ,在分布位置、细胞形态和相关染色反应结果等方面不同于已往报道的血细胞 ,这是 1种具有某些肥大细胞特征的结缔组织颗粒细胞 ;2 .结缔组织颗粒细胞具有储存Ca2 + 的功能 ;3 .病毒感染 ,可使结缔组织颗粒细胞中的酚氧化酶原转化成有活性的酚氧化酶 ,提示这种细胞参与对虾的免疫防御反应。

白纹伊蚊中肠组织和C6/36细胞与登革病毒相互作用蛋白的筛选

目的筛选登革Ⅱ型病毒与白纹伊蚊中肠组织和C6/36细胞中的连接分子。方法富集纯化登革Ⅱ型病毒,用12%SDS-PAGE分析提取的C6/36细胞膜蛋白和白纹伊蚊中肠组织总蛋白,将分离胶上的蛋白转于硝酸纤维素膜(PVDF)上,应用病毒覆盖蛋白结合试验(VOPBA)方法筛选白纹伊蚊中肠组织和C6/36细胞中表达连接登革Ⅱ型病毒的分子。结果白纹伊蚊中肠组织总蛋白经12%SDS-PAGE分离后转膜,分别与纯化的病毒液和阴性对照液孵育,用抗登革病毒单克隆抗体检测,结果显示病毒孵育组在分子量30kDa的位置有特异性的条带出现,而阴性对照组无此条带;用同样的方法筛选C6/36细胞上表达蛋白,病毒孵育组在分子量30kDa和40kDa的位置出现特异条带,而阴性对照组无。结论 VOPBA结果显示分子量为30kDa的分子在中肠组织与C6/36细胞中都能表达,具有连接登革Ⅱ型病毒的作用,对其氨基酸序列的鉴定和功能分析工作正在进行中。

昆虫中肠细胞的离体培养

中肠在昆虫生命活动中起着重要作用,同时是多种生物防治微生物作用的靶标,昆虫中肠细胞的离体培养一直受到国际上的广泛关注。本文对昆虫中肠细胞的类型、中肠细胞的分离方法、离体培养所需的培养基、细胞培养方法和条件以及中肠细胞的鉴定等方面进行了综述,为昆虫中肠生物学功能的研究提供启示。