小反刍兽疫病毒原核表达体外转录系统的建立

构建了小反刍兽疫病毒(PPRV)辅助质粒和微型复制子(minireplicon)并进行功能学研究。RT-PCR克隆PPRV疫苗株N75/1N、P和L基因,亚克隆至有T7启动子的原核表达载体pGEM3Z构建完成3个辅助质粒,分别命名为pGEM3Z-N、pGEM3Z-P和pGEM3Z-L,并通过全基因合成构建含PPRV病毒5′端启动子序列(AGP)、3′端启动子序列(GP)、T7转录终止信号、丁型肝炎病毒核酶序列HamRZ及氯霉素乙酰转移酶(CAT),获得PPRV微型复制子重组质粒pGEM3Z-CAT。构建完成的微型复制子及辅助质粒在表达T7RNA多聚酶(T7RNP)感染痘病毒VTF7-3后,通过脂质体法优化4种质粒配比,并将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光分析CAT的表达情况,荧光显微镜观察到荧光的表达,并通过免疫印迹分析CAT蛋白的表达,表明构建的PPRV微型复制子具有转录和复制功能,这将有助于进一步开展以PPRV反向遗传操作为基础的免疫学及蛋白功能研究。

乙型脑炎病毒表达载体的研究

用RT-PCR方法分段扩增了乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株5′、3′NCR,利用融合PCR技术在5′、3′NCR之间引入BamHⅠ酶切位点,将5′NCR置于T7启动子控制之下,构建乙脑病毒微复制子表达载体pMR。分别将绿色荧光蛋白(GFP)和汉滩病毒核蛋白编码区基因插入到pMR中,构建两种表达外源基因的乙脑病毒微复制子表达载体:pMR-GFP和pMR-84FliS。经荧光显微镜直接观察、Westernblot、ELISA等方法检测,证实外源基因能够在辅助病毒SA14-14-2感染的BHK-21细胞中表达。

肠道病毒71型微复制子的构建

目的 构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系,研究微复制子的复制及表达情况。方法聚合酶链式反应扩增绿色荧光蛋白（EGFP）,利用特定酶切位点及连接酶,将目的基因片段连接至p MD19-T载体,分别构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系。荧光显微镜下观察微复制子表达情况,实时荧光定量PCR观察微复制子复制情况。结果 EV71非结构蛋白微复制子及EV71 3C蛋白酶微复制子表达后,均可观察到特异性绿色荧光,荧光强度有明显差异;转染后12~72 h取样所测RNA含量几乎不变。结论 非结构蛋白全长及3C蛋白酶启动微复制子转录强度不同,所构建微复制子不具备复制功能,提示结构蛋白编码区对病毒RNA复制有重要意义。

人呼吸道合胞病毒微型复制子的构建

【目的】构建RSV微型复制子(minireplicon)并进行功能学研究。【方法】构建含RSV病毒前导序列(Leader,genomic promoter,Le)、转录起始信号(gene start,GS)、多克隆酶切位点、转录终止信号(gene end,GE)和尾随序列(Trailer,antigenomic promoter,Tr)的基因片段GSGE,通过引入T7RNA多聚酶(T7RNApolymerase,T7RNP)启动子、克隆入载体px8δT和插入增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)等多步操作,获得RSV微型复制子重组质粒px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP。同时构建可表达大蛋白(large protein,L)的质粒pcDNA3.1/L及表达转录延长/转录终止抑制因子(M2ORF1protein,M2-1)的质粒pcDNA3.1/M2-1。通过脂质体法共转染RSV微型复制子质粒及四种RSV核壳体蛋白质粒至可表达T7RNP的BSRT7/5细胞系,倒置荧光显微镜及流式细胞仪分析EGFP的表达情况。【结果】成功构建了px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP及pcDNA3.1/L和pcDNA3.1/M2-1,五质粒共转染BSR T7/5细胞,倒置荧光显微镜及流式细胞仪均观察到绿色荧光的表达。【结论】构建的RSV微型复制子具有转录和复制功能,将有助于进一步开展以RSV反向遗传操作为基础的RSV疫苗研发及药物筛选。

人肠道病毒D68型微复制子的建立

建立人肠道病毒D68型（EV-D68）微复制子体系。利用增强绿色荧光蛋白（EGFP）或萤火虫荧光素酶（FLuc）报告基因替换病毒编码区,通过酶切连接,构建EV-D68 T7和PolⅠ系统微复制子体系,获得重组质粒pT7-miniEGFP、pT7-miniFLuc、pHH21-miniEGFP、pHH21-miniFLuc和pHH21-miniFLucΔpolyC。微复制子转染RD细胞,48h后荧光显微镜观察EGFP表达情况或用双报告系统检测荧光素酶表达水平。T7和PolⅠ系统微复制子均可表达报告基因,但PolⅠ系统荧光素酶表达水平是T7系统的5倍。并且病毒非编码区的PolyC区域对于病毒蛋白的表达起着重要的作用。本研究成功构建了EV-D68微复制子体系,为EV-D68非编码区功能研究提供工具。