肺缺血-再灌注核心基因介导的竞争性内源性RNA网络的构建

目的分析肺缺血-再灌注损伤发生的核心基因并构建竞争性内源性RNA(ceRNA)网络。方法从基因表达综合(GEO)数据库下载GSE145989的原始数据当作训练集,GSE172222和GSE9634数据集作为验证集,并鉴定差异表达基因(DEG)。进行基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,筛选核心基因并分析核心基因的诊断价值、免疫细胞的免疫浸润水平。构建并验证ceRNA网络。分析基于ceRNA网络的靶向药物。结果共检测到179个DEG,其中61个下调基因,118个上调基因。GO分析结果显示,DEG与细胞迁移、分化和调节等生物学过程有关;与内吞囊泡膜、浆膜和膜筏等细胞成分有关;与趋化因子受体、G蛋白偶联受体、免疫受体活性和抗原结合等分子功能有关。KEGG分析显示DEG参与肿瘤坏死因子(TNF)、Wnt、白细胞介素(IL)-17和核因子(NF)-κB等信号通路。PPI网络提示CD8A、IL2RG、STAT1、CD3G和SYK是肺缺血-再灌注损伤的核心基因。ceRNA网络提示miR-146a-3p、miR-28-5p和miR-593-3p与CD3G的表达相关;miR-149-3p、miR-342-5p、miR-873-5p和miR-491-5p与IL2RG表达相关;miR-194-3p、miR-512-3p、miR-377-3p和miR-590-3p与SYK表达相关;miR-590-3p和miR-875-3p与CD8A表达相关;miR-143-5p、miR-1231、miR-590-3p、miR-875-3p与STAT1表达相关。CD3G有13种靶向药物,IL2RG有4种靶向药物,SYK有28种靶向药物,lncRNA MUC2有3种靶向药物,未发现CD8A、STAT1和其他ceRNA网络基因的靶向药物。结论CD8A、IL2RG、STAT1、CD3G和SYK是肺缺血-再灌注损伤的核心基因,对核心基因进行研究分析可能有助于肺缺血-再灌注损伤的诊断,并提供新的研究思路和治疗靶点。

HMGB1小干扰RNA对鼻黏膜上皮细胞HMGB1/TLR4信号通路的影响

目的研究采用小干扰RNA(si-RNA)沉默高迁移率族蛋白1(HMGB1)对人鼻黏膜上皮细胞(HNECs)Toll样受体4(TLR4)及其下游信号通路的影响。方法体外培养人鼻黏膜上皮细胞,分为空白对照组、si-HMGB1组、脂多糖(LPS)组和LPS+si-HMGB1组。RT-PCR检测HNECs中HMGB1 mRNA的表达。Western blot检测4组细胞HMGB1、TLR4表达以及通路下游核因子-κB(NF-κB)和白介素1β(IL-1β)的表达水平。观察siRNA干扰HMGB1蛋白表达后鼻黏膜上皮细胞的相应变化。结果RT-PCR结果显示,LPS组细胞中HMGB1的转录水平显著高于空白对照组(P<0.05)。LPS+si-HMGB1组HMGB1的mRNA转录水平显著低于LPS组(P<0.05)。Western blot检测结果显示,LPS+si-HMGB1组的TLR4,HMGB1蛋白表达水平明显低于LPS组,结果具有统计学意义(P<0.05)。LPS+si-HMGB1组细胞的NF-κB以及IL-1β水平明显低于LPS组(P<0.05)。结论鼻黏膜上皮细胞表达HMGB1蛋白,通过siRNA沉默手段可以下调HMGB1的表达。LPS可以激活炎症性的HMGB1,TLR4,通路下游信号NF-κB及IL-1β。siRNA可以下调HMGB1蛋白表达水平,进而抑制TLR4-NF-κB以及IL-1β信号传导通路。

植物中RNA分子系统运输的研究进展

RNA分子主要以单链的形式存在于生物体内,既担负着贮存及转移遗传信息的作用,又能作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能. 在植物中RNA也可作为活跃的信号分子调控基因表达和发育. 介绍了包括病毒RNA、RNA沉默信号、特异内源RNA等RNA分子,在植物体内的系统运输及其在植物基因表达调控中所起作用的研究进展.

应用RNA干扰沉默猪内源性反转录病毒

目的:尝试应用RNA干扰(RNAi)沉默猪源PK-15细胞中的猪内源性反转录病毒(PERV),并通过反转录酶活性及pol基因相对荧光定量PCR检测沉默效果。方法:依据GenBank公布的PERV pol基因序列,采用Invitro-gen公司的BLOCK-iT RNAi Designer软件设计Stealth小干扰RNA(siRNA)序列;将合成的siRNA转染PK-15细胞,72 h后检测细胞上清PERV反转录酶活性及细胞内pol基因拷贝数并评价沉默效果。结果:反转录酶活性及pol基因拷贝数检测结果表明,设计的3条Stealth siRNA序列中,位于pol基因3272～3296 bp的序列能有效沉默PERV。结论:RNAi方法可有效使猪源PK-15细胞中的PERV沉默,为进一步研究天然抗病毒分子与PERV的相互作用提供了实验基础,同时也为猪源异种移植研究中去除PERV提供了一种可供尝试的方法。

长链非编码RNA在宫颈癌中的作用

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,我国的发病率和死亡率一直居高不下。人乳头瘤病毒的持续感染是宫颈癌的主要危险因素,但并非唯一因素,遗传和表观遗传因素与宫颈癌的关系不容忽视。近年有研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)与宫颈癌的发生、发展有关。许多lncRNA可以作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)广泛参与调控一些关键的信号通路,如Wnt/β-catenin依赖性途径、丝裂原活化蛋白激酶通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路和Notch信号通路等,从而在宫颈癌的发生、发展中发挥致癌或抑癌作用,因此许多lncRNA已成为宫颈癌新的诊断和预后生物标志物。综述lncRNA的结构与功能,以及lncRNA在宫颈癌中的作用机制。

植物非细胞自主性小RNA分子研究进展

非细胞自主性是RNA干扰的主要特点之一,表现为沉默效应可以在细胞、组织和生物个体间传递和扩散,可移动的小RNA分子在这种非细胞自主性的沉默扩散中发挥了核心作用。近年来的研究表明小RNA分子可以与转录因子、多肽和植物激素一样传递胞间信息,并以其特有的方式调控发育模式、响应环境胁迫、增强病毒抗性和维持转座子的沉默。综述了近年来在植物非细胞自主性RNAi研究中取得的主要进展,主要介绍了通过韧皮部和胞间连丝途径传递沉默信号的各种小RNA分子及其生物学作用、非细胞自主性小RNA的分子特征和运输效率的调控,并对存在的问题及其研究前景进行了展望。

RNA沉默信号分子研究进展

RNA沉默是一种由21-26nt RNA分子介导的真核生物体内普遍存在的以序列特定性行为 抑制基因表达的保守途径。RNA沉默最显著的特征在于它是一种非细胞自发的过程,即在植物 和小杆线虫(Caenorhabditis elegans)中RNA沉默均能被局部诱导,随后将沉默状态传导至整个生 物体。RNA沉默的系统传导特性表明,RNA沉默途径中存在着可移动的信号分子。就RNA沉默 信号传导的特征和可能的信号分子等做一综述。

植物内源小RNA及其介导的基因沉默途径

阐述了植物内源小RNA的种类及其介导的多种RNA基因沉默途径,RNA沉默途径中的主要效应蛋白及复合物的组成和功能,重点介绍了miRNA介导的基因沉默途径和siRNA介导的基因沉默途径的异同及其功能,为便于了解植物基因表达调控的多层次性和复杂性,进一步挖掘和利用植物内源信号途径提供一定的参考。

LncRNA-UCA1、HMGB1/RAGE在非小细胞肺癌中的表达和意义

目的:明确长链非编码RNA-尿路上皮癌胚抗原1(long non-coding RNA-human urothelial carcinoma associated 1,LncRNA-UCA)、高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-B1,HMGB1)、晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end-products,RAGE)、核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)p65在人体非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织及癌旁正常组织中的表达,探究其与NSCLC临床特点、病理类型等的关系。方法:选取2018年5月至2018年8月青岛大学附属医院收治的40例NSCLC患者,采集肺癌组织及癌旁正常组织标本各40例。应用免疫组化法检测10例患者肺癌组织及正常组织中的HMGB1、RAGE定位及表达量。应用Western blot检测12例NSCLC患者的肺癌组织及正常组织中HMGB1、RAGE、NF-κB p65蛋白的表达情况。采用qRT-PCR测定40例NSCLC患者肺癌组织及正常组织中lncRNA-UCA1、HMGB1、RAGE、NF-κB p65的mRNA表达量。结果:①免疫组化及Western blot检测显示,HMGB1(1459.72±366.67)、NF-κB p65(479.52±265.07)在NSCLC中的表达量较正常组织(847.60±313.66、135.53±109.61)明显升高(t=5.470,P=0.000;t=4.063,P=0.002),RAGE(127.49±43.91)在NSCLC中的表达较正常组织(257.61±64.84)明显降低(t=-11.461,P=0.000)。②qRTPCR检测显示,LncRNA-UCA1(4.85±2.31)、HMGB1(4.64±2.10)、NF-κB p65(4.22±2.10)在NSCLC中的表达较正常组织(1.00±0.00、1.00±0.00、1.00±0.00)明显升高(t=10.521,P=0.000;t=10.949,P=0.000;t=8.273,P=0.000),RAGE(0.41±0.19)在NSCLC中的表达较正常组织(1.00±0.00)降低(t=-19.754,P=0.000)。③LncRNA-UCA1、HMGB1、NF-κB p65的表达量在腺癌组织(2.93±1.40、3.06±1.36、2.17±0.87)高于鳞癌组织(6.77±2.22、6.16±2.20、5.96±2.90)(t=3.722,P=0.001;t=3.114,P=0.004;t=3.348,P=0.002),大于3 cm肿瘤组织(6.70±2.14、6.28±1.80、6.07±2.17)高于不足3 cm肿瘤组织(3.11±1.40、3.21±1.43、2.28±0.86)(t=-5.367,P=0.000;t=-5.181,P=0.000;t=-5.623,P=0.000),有淋巴结转移癌组织(6.38±2.25、6.04±2.25、5.72±2.81)高于无淋巴结转移癌组织(2.70±1.30、3.23±1.38、2.24±0.92)(t=2.377,P=0.023;t=2.404,P=0.021;t=2.410,P=0.021),而RAGE的表达量在腺癌组织(0.54±0.18)低于鳞癌组织(0.28±0.12)(t=-3.049,P=0.004),大于3 cm肿瘤组织(0.28±0.11)低于不足3 cm肿瘤组织(0.54±0.18)(t=3.870,P=0.000),有淋巴结转移癌组织(0.27±0.11)低于无淋巴结转移癌组织(0.52±0.18)(t=-2.541,P=0.015)。④Pearson相关性分析表明,在NSCLC患者的癌组织中,HMGB1与lncRNA-UCA1、NF-κB p65表达呈正相关(r=0.754,P=0.000;r=0.704,P=0.000),RAGE与HMGB1、NF-κB p65表达呈负相关(r=-0.689,P=0.000;r=0.704,P=0.000)。结论:lncRNA-UCA1的高表达与NSCLC的发生发展有关;lncRNA-UCA1可能在影响HMGB1/RAGE表达及NF-κB通路中发挥作用。

RNA干扰及其技术的应用

RNA干扰(RNAi)是细胞内由双链RNA诱导降解与其配对的特定mRNA的过程。细胞内双链RNA在酶的作用下,形成20-25碱基大小的小干扰RNA(si RNAs),由si RNAs进一步掺入多组分核酸酶并使其激活,从而精确降解与si RNAs序列相同的mRNA,抑制该基因在细胞内的翻译表达。介绍了RNA干扰的分子机制、制备方法、以及RNA干扰技术在功能基因组学、微生物学、基因治疗和信号转导等研究领域里的应用。

基于高通量测序研究清润方改善2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素抵抗的作用机制

目的:基于高通量转录组测序(RNA-seq)研究清润方改善2型糖尿病(T2DM)大鼠肝脏胰岛素抵抗的作用机制。方法:采用高脂饲料喂养联合链脲佐菌素腹腔注射构建T2DM大鼠模型,将成模大鼠采用随机数字表随机分为模型组,二甲双胍组(150 mg/kg),清润方大(11.2 g/kg)、中(5.6 g/kg)、小(2.8 g/kg)剂量组,另设正常组,灌胃干预8周。观察空腹血糖(FBG)、胰岛素抵抗指数(IRI)、胰岛素敏感指数(ISI)变化,利用RNA-seq结合生物信息学分析筛选差异表达的长链非编码RNA(lncRNA)、微RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA),对差异基因进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析及qPCR验证,构建竞争性内源性RNA(ceRNA)调控网络。结果:与模型组比较,干预第6、8周清润方大剂量组FBG明显降低(P<0.05);第8周清润方各剂量组IRI降低(P<0.01),清润方大、小剂量组ISI升高(P<0.01,P<0.05)。通过差异表达筛选得到85个关键mRNA、12个miRNA、37个lncRNA,通过蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络得到12个核心基因,并构建lncRNA-miRNA-mRNA网络。KEGG富集分析显示,差异基因主要涉及Janus激酶/信号转导及转录活化因子(JAK-STAT)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、氨基酸代谢、脂质代谢等通路。结论:清润方可能通过lncRNA-miRNA-mRNA网络调控CYP2、Acer2等基因,并影响Lpin1、Insig1等基因和PPAR、JAK-STAT、氨基酸代谢、脂质代谢等信号通路,改善2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素抵抗。

肝癌环状RNA-100338/微小RNA-141-3p轴与磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的关系

目的探讨肝癌(HCC)环状RNA(circRNA)竞争性内源RNA(ceRNA)分子机制及其关联信号通路。方法共收集10对HCC及癌旁组织,应用circRNA芯片检测其中4对HCC及癌旁组织,对circRNA芯片数据进行聚类分析,结合生物信息分析的结果筛选出目标circRNA并用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)验证;基于公开的同类型测序数据库,采用Cytoscape软件构建微小RNA(miRNA,miR)-Target-Network、miRNA-Gene-Act-Network,分析与目标circRNA关联密切的信号通路;通过免疫组织化学方法验证信号通路的关键蛋白。结果肝癌及癌旁组织RNA提取及质检合格,环状RNA芯片检测肝癌及癌旁组织circRNA,图像清晰可见、扫描数据可靠;通过聚类分析及RT-qPCR验证结果获得circRNA_100338为候选靶标,吸附miR-141-3p,HCC中circRNA_100338水平(0.012±0.007)高于癌旁circRNA_100338水平(0.005±0.003)(P<0.05),HCC中miR-141-3p水平(0.885±0.354)低于癌旁miR-141-3p水平(4.066±1.628)(P<0.01);基于我们的芯片数据,联合同类型测序数据库(GSE25599、GSE77276)分析结果显示,miR-141-3p与RHEB的mRNA表达水平的负相关性值为-0.602,circRNA_100338与RHEB显著正相关(Correlation test,P<0.05),推断circRNA_100338/miR-141-3p调控PI3K/AKT/mTOR信号通路;免疫组化结果显示该信号通路关键蛋白RHEB在circRNA_100338高表达(circRNA_100338/GAPDH > 0.05)的HCC组织中表达增强(评分≥ 3),与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论肝癌circRNA_100338/miR-141-3p轴参与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路,RHEB蛋白表达强度与circRNA_100338水平明显相关。

植物中转录后基因沉默的启动、传导与抑制

转录后基因沉默 (post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)首次在转基因植物中被发现 ,后来在自然植物和其他生物中如动物、线虫、真菌等都有相关的报道 ,这表明PTGS是生物界中普遍存在的现象 .由于PTGS与植物中RNA介导的病毒抗性具有相似性 ,以及PTGS在植物基因组功能分析中的应用 ,因此 ,近年来PTGS在植物中特别是在转基因植物中得到了广泛的研究 .为了深入对PTGS进行研究 ,就植物中PTGS启动的因子、启动的机制 ,PTGS系统传导的信号物质。

沉默干扰HMGA2对胃癌细胞Wnt/β-Catenin信号转导通路的影响

目的:观察小分子RNA沉默HMGA2在胃癌细胞株MKN-45的表达,研究HMGA2对Wnt/β-Catenin通路中主要分子β-Catenin以及下游靶分子c-myc、CyclinD1的表达量及转录活性的影响,探讨HMGA2对Wnt/β-Catenin信号转导通路的影响.方法:构建针对人HMGA2基因的shRNA真核表达载体,瞬时转染人胃癌细胞株MKN-45,用RT-PCR、Western blot分别检测转染后shHMGA2组、scrambled组和空白对照组细胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表达情况,评估抑制效应;分别检测转染后3组细胞中的β-Catenin、c-myc、Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达水平.结果:转染48h后shHMGA2-1组的HMGA2 mRNA相对表达量(0.58±0.07),与shHMGA2-2组(0.92±0.13)、shHMGA2-3组(0.90±0.16)、scrambled组(1.07±0.14)及空白对照组(1.19±0.09)相比有统计学意义(P<0.05),其他4组相比无统计学意义(P>0.05);转染48h后shHMGA2-1组的HMGA2沉默效果最好,HMGA2 mRNA表达明显下降,抑制率51.3%;故选用质粒shHMGA2-1继续后续实验;Westernblot结果显示转染72h后shHMGA2-1组HMGA2蛋白相对表达量为(0.11±0.03),与scrambled组(0.48±0.12)及空白对照组(0.55±0.08)相比有统计学意义(P<0.05),HMGA2蛋白表达明显下降,抑制率80%;沉默干扰HMGA248h和72h后,β-Caten in mRNA和蛋白表达水平在空白对照组(1.07±0.02,0.69±0.04)与scrambled组(0.91±0.02,0.67±0.10)中无明显差异(P>0.05),而shHMGA2-1组(0.53±0.04,0.44±0.05)较之两组有明显的下降(P<0.05);shHMGA2-1组中c-myc mRNA和蛋白相对表达量为(0.39±0.04,0.25±0.07)较之空白对照组(0.88±0.05,0.75±0.09)、scrambled组(0.84±0.03,0.66±0.10)有明显下降(P<0.05),后两组相比较无统计学意义(P>0.05);shHMGA2-1组中Cyclin D1 mRNA和蛋白相对表达量为(0.31±0.02,0.12±0.01)较之空白对照组(0.52±0.03,0.73±0.12)、scrambled组(0.51±0.01,0.63±0.07)有明显下降(P<0.05),后两组相比较无统计学意义(P>0.05).结论:RNAi载体能有效地抑制HMGA2在胃癌细胞株MKN-45中的表达,沉默干扰HMGA2抑制了Wnt/β-Catenin通路中的主要分子β-Catenin以及下游靶分子c-myc、Cyclin D1的表达,HMGA2基因可能是通过调控Wnt/β-Catenin通路对胃癌细胞生长和凋亡发挥作用的.

植物基因沉默信号分子的研究进展

RNA沉默是广泛存在于真核生物中作用于特定RNA的降解机制,其在植物中的系统性传播主要依靠可移动的沉默信号分子.信号在植株中能进行双向性的远距离传播,但向上比向下传播更有效率.目前对这方面的研究主要在嫁接、农杆菌侵染和基因枪轰击三个体系中进行.此信号分子的成分可能是siRNA、异常RNA及dsRNA中的一种.

RNA沉默——植物基因组免疫的安全防线

在植物中,起始于双链RNA的长度为21-24个核苷酸的小RNA,能够诱发两种形式的表观遗传学基因沉默。转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing,PTGS),可以介导细胞质中同源mRNA的降解;转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS),则主要通过小RNA介导同源启动子区的DNA甲基化,从而抑制基因转录。文中针对PTGS和TGS通路的区别与联系、沉默传递研究的现状及内源与外源基因沉默的异同点等问题进行探讨。

ceRNA调控机制与TLR4/NF-κB通路在RA炎症中的研究进展

miRNA与长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)都属于非编码RNA,其表达水平与众多疾病的发生与发展相关。竞争内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控机制是lncRNA竞争性地结合miRNA并调控相关基因表达的过程。众多研究提示,ceRNA调控机制参与了类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的发生与发展过程。同时,TLR4/NF-κB信号通路在RA中异常表达,可调控RA炎症反应,是RA炎症级联反应的核心之一。该文总结并探讨miRNA、lncRNA与RA的关系并围绕ceRNA调控机制在RA疾病中的作用。基于TLR4/NF-κB信号通路,探讨ceRNA调控机制在RA炎症中的研究进展,可为RA临床寻找新的治疗靶点提供参考。

高迁移率族蛋白B1在白细胞介素-2转录表达信号调控中的作用

目的探讨高迁移率族蛋白B1（HMGB1）在白细胞介素-2（IL2）转录表达信号调控机制中的可能作用。方法首先将HMGB1和NFAT2质粒共同转染Hela细胞，同时转染IL-2报告基因，逐步增加HMGB1的转染剂量，检测IL-2报告基因的表达活性。观察HMGB1质粒用量对IL-2报告基因活性的影响；然后应用SRNAi质粒对内源性及外源性HMGB1表达进行特异性抑制，观察对IL-2报告基因活性的影响，以期从反面论证HMGB1可促进IL-2转录表达。结果在Hela细胞中，随着HMGB1质粒转染剂量增加，IL-2报告基因活性增加了2．12倍（P〈0．01）。应用sRNAi抑制293T细胞中外源性以及Hela细胞中内源性HMGB1表达水平后，IL-2报告基因活性分别下降1．7倍和4．76倍（P〈0．05或P〈0．01）。结论HMGB1在NFAT2介导IL-2报告基因转录表达的信号调控过程中发挥重要作用。