碱性蛋白酶酶解蛋白制备活性肽的质控研究

以胶原蛋白和大豆分离蛋白为主要研究对象,应用体积排阻色谱(SEC)结合多角度激光光散射(MALLS)及示差折光(RI)联用技术对碱性蛋白酶酶解蛋白制备肽段的过程进行了详细分析。在酶解过程中,不同来源的胶原蛋白(牛、鸡)和大豆分离蛋白在分子量分布、体系的分散度及粒径变化规律上表现出了典型的差异。结果表明,牛胶原蛋白在酶解开始时就迅速被降解产生了大量小分子肽段,鸡胶原蛋白相对于牛胶原蛋白在相同的酶解条件下更难产生小分子肽段,大豆分离蛋白随着酶的加入则是表现出了先聚集再降解的特性。SEC-MALLS技术可以有效把控蛋白酶解的过程以及体系中肽段分子量分布,该技术可以为活性肽产品的开发及品质检测提供依据。

海鲜菇美拉德肽的制备及其风味特性研究

以海鲜菇(Hypsizygus marmoreus)蛋白肽为原料,采用响应面法分析优化海鲜菇美拉德肽制备工艺,并通过褐变程度、产物分子量分布、感官评价、电子舌及超滤等特征性指标和评价手段,明确美拉德反应对海鲜菇蛋白肽风味特性的影响。结果表明,海鲜菇美拉德肽的最佳制备条件为葡萄糖与D-木糖质量比4∶1、反应温度110℃和反应时间56 min。与海鲜菇蛋白肽相比,制备的海鲜菇美拉德肽咸味强烈,并伴有鲜味产生,整体接受度好,在294 nm和420 nm下吸光值显著增加,并推测分子量大于180~500 Da的组分可能为美拉德反应的主要活性肽段。超滤结果表示,海鲜菇美拉德肽呈咸鲜味的肽分子量主要集中在500 Da以下。该研究结果证明美拉德反应可有效提升海鲜菇蛋白肽的咸鲜味,使其风味层次更加丰富,可为扩展可替代钠盐的新型食用菌调味领域的研究和应用提供理论基础。

响应面法优化金鲳鱼皮抗氧化肽制备工艺及其组成分析

为促进金鲳鱼皮资源的综合利用,本研究以金鲳鱼皮为原料,探究其抗氧化肽的最佳制备工艺。以水解度和DPPH自由基清除率为考察指标,在单因素实验的基础上,结合响应面试验对金鲳鱼皮的酶解条件包括蛋白酶种类、酶解时间、加酶量、酶解温度以及酶解pH进行优化,得到金鲳鱼皮抗氧化肽的最佳酶解条件,并测定最佳条件下得到的酶解产物的分子量分布及氨基酸组成。结果表明,制备金鲳鱼皮抗氧化肽酶解效果最优的酶为碱性蛋白酶,其最佳酶解工艺为:酶解温度52.3℃、酶解pH10.0、酶解时间8.4 h、加酶量15409 U/g。通过最佳酶解条件制备得到的酶解产物的DPPH自由基清除率为81.59%±2.96%,其分子量主要分布在3000 Da以下,占比高达79.20%,其含有17种氨基酸,甘氨酸为主要氨基酸,疏水性氨基酸占比35.28%。本研究结果为金鲳鱼皮的高值化利用与抗氧化肽的筛选提供了一定的理论依据。

仿刺参不同部位ACE抑制活性分析及活性肽制备工艺优化

本文对仿刺参具有高降血压活性部位进行筛选并优化其活性肽制备工艺。采用酶解法对仿刺参不同部位(体壁、肠、卵)进行水解,以血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制率为指标筛选最适蛋白酶,通过对各酶解物ACE抑制率的半数抑制浓度(IC_(50))测定比较筛选出最优抑制活性部位。经单因素实验与响应面试验优化确定活性肽最佳酶解制备条件,对蛋白酶解物进行分子量测定确定其分布范围,经超滤膜分离后对不同组分的ACE抑制活性分析。结果显示,选用碱性蛋白酶为最适水解酶,体壁、肠、卵各蛋白酶解物的ACE抑制率的IC50分别为1.11、4.02、0.65 mg/mL,仿刺参卵具有更好的ACE抑制效果,为最优抑制活性部位。其最佳的酶解制备工艺参数为:酶解时间5 h,加酶量3.5 U/mg,酶解温度65.26℃,底物浓度3.51%,酶解pH9.02,在该条件下仿刺参卵酶解产物的ACE抑制率为80.65%±0.52%,与预测值接近。蛋白酶解产物的分子量集中分布在3000 Da以下,占总含量的98.37%,其中1000~3000 Da占比9.50%,小于1000 Da占比88.87%。超滤膜分离所得低聚肽组分ACE抑制活性(IC_(50)=0.30 mg/mL)显著(P<0.05)强于经工艺优化后酶解物及截留液组分。本研究结果为仿刺参副产物高值化利用提供理论依据,可作为分离纯化制备降血压肽的优质资源。

鮰鱼蛋白ACE抑制肽的酶法制备及分离纯化

以脱脂后的鮰鱼肉为原料,采用分步酶解法制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,通过正交试验优化酶解条件。最佳酶解工艺:调节pH为8,温度为37℃,底物浓度为0.17 g/mL,先加胰蛋白酶,酶活/底物量为6 U/mg,水解1 h后再调节pH为9,温度为55℃,再加入碱性蛋白酶,酶活/底物量为6 U/mg,水解4 h。在此条件下,鮰鱼肉蛋白水解度为12.63%,酶解液ACE抑制率为18.7%。分子量分布分析发现酶解产物分子量主要分布在500 Da以下,占多肽的98.23%。酶解产物经超滤(3 000 Da)分离后ACE抑制率提高至35.4%,再用DA201-C大孔吸附树脂脱盐后ACE抑制率为56.6%,最后用葡聚糖凝胶G-15柱层析进行纯化后得到3个组分,组分G2的ACE抑制率为66.9%。经过分离纯化后的ACE抑制肽活性相比原酶解液提高了3.6倍。

鸡骨架和鸡胸肉复合底物酶解工艺优化及产物呈味特性研究

为了提升鸡骨架和鸡胸肉复合底物酶解产物的风味,利用生物酶解技术对鸡骨架和鸡胸肉复合底物进行酶解,通过单因素实验与正交试验优化了酶解工艺,并分析了酶解物中的游离氨基酸含量及肽分子量分布情况。结果表明:复合蛋白酶与风味蛋白酶以3:1复配比同步酶解时风味最佳,最佳酶解条件是:鸡骨架与鸡胸肉比例9:1,料液比1:2 g/mL,温度50℃,pH7.5,酶添加量0.6%,酶解时间3 h。该条件下水解度达13.60%,感官评分4.7,制得的酶解物具有突出的鲜味和肉香味,呈味效果良好。随着酶解时间的延长,产物中游离氨基酸总量和小分子肽含量不断增加。最优工艺条件下,酶解产物中苦味氨基酸含量为2.74 mg/mL,占总游离氨基酸的71.73%,是主要的氨基酸;相对分子质量小于3 kDa的肽含量为93.26%。该研究结果为低值鸡骨架的综合开发和应用提供了参考。

小麦低聚肽营养成分和特征功能肽段研究

以谷阮粉为原料,利用复合蛋白酶酶解、分离、纯化、浓缩、喷雾干燥获得小麦低聚肽,并研究了小麦低聚肽的理化指标、氨基酸组成、分子质量分布以及具有功能活性特征肽段成分。结果表明,小麦低聚肽的总蛋白含量(干基)为93.27%,肽含量(干基)为79.77%,分子质量主要分布在1000 u以下,占比92.60%;小麦低聚肽的氨基酸总量为91.56%,尤其是谷氨酸含量占比最高,为37.13%;通过超快速液相色谱串联三重四极杆质谱从小麦低聚肽中鉴定出5条具有功能活性的特征肽段成分,分别为焦谷氨酰谷氨酰胺酰脯氨酸三肽(pyroglutamyl glutamyl proline tripeptide,pEQP)、缬氨酰谷氨酰胺酰谷氨酰胺三肽(valyl glutamyl glutamine tripeptide,VQQ)、丙氨酰谷氨酰胺二肽(alanyl glutamine dipeptide,AQ)、丝氨酰谷氨酰胺二肽(sericyl glutamine dipeptide,SQ)、异亮氨酰谷氨酰胺二肽(isoleucyl glutamine dipeptide,IQ),其含量分别为0.464%、0.046%、0.191%、0.446%和0.145%,小麦低聚肽批次间含量稳定。研究结果为小麦低聚肽在营养保健食品中的应用奠定了基础。

乌鸡肽中潜在功能活性肽段的研究

研究考察了乌鸡肽的总蛋白、肽含量、氨基酸组成、分子质量分布以及潜在的功能活性肽段。结果表明,乌鸡肽的总蛋白含量(干基)为94.88%,肽含量(干基)为78.93%,氨基酸组成丰富,分子质量主要分布在1000 Da以下,占比91.04%,此外,基于超快速液相色谱串联三重四极杆质谱方法,从乌鸡肽中鉴定出5条潜在功能活性的特征肽段序列,分别为谷氨酰精氨酸二肽、异亮氨酰精氨酸二肽、天冬酰胺酰精氨酸二肽、脯氨酰天冬氨酰精氨酸三肽、丙氨酰丙氨酰精氨酸三肽,其含量为0.14~4.28 mg/g,研究结果为乌鸡肽应用于营养保健食品奠定了物质基础。

挤压膨化玉米黄粉酶解制备生物活性肽

采用挤压膨化的方法预处理玉米黄粉,可提高Alcalase酶解玉米黄粉的水解度。确定了Alcalase酶解玉米黄粉的适宜条件,即60℃,pH8.5,底物浓度5%,加酶量3%,反应60min。该条件下玉米黄粉水解度为39.54%,水解物的分子量主要分布在3819～663Da之间。Alcalase酶解玉米黄粉的水解产物具有抗氧化活性。

乌骨鸡活性肽组成成分及体外抗氧化活性研究

本实验对乌骨鸡活性肽的蛋白质含量、多肽含量、游离氨基酸含量和多肽的分子量分布进行了研究,并通过测定乌骨鸡活性肽对Fenton反应产生的羟自由基、邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子的清除率,考察乌骨鸡活性肽的体外抗氧化能力。乌骨鸡活性肽组成分析表明:活性肽中蛋白质含量为90.53%,其中主要成分为小分子多肽(51.46%)和氨基酸(36.17%)。乌骨鸡活性肽分子量分布的凝胶色谱法测定结果显示其分子量集中在1900Da以下,其中小肽所占相对比例较大。体外抗氧化实验结果表明:乌骨鸡活性肽具有较强的清除羟自由基的能力,其清除率与浓度呈剂量关系;并能明显降低邻苯三酚自氧化速率,抑制率与浓度呈正相关,但与肌肽比较,乌骨鸡活性肽的体外抗氧化能力相对要弱。

大豆多肽分子质量分布与苦味的确定

利用葡聚糖凝胶 (Sephadex G 2 5)柱层析和高压液相色谱 (HPLC)测定大豆多肽分子质量与水解度以及分子质量与苦味之间的关系。试验结果表明 ,随着水解度的增加 ,大豆蛋白水解物分子质量变小 ,当水解度约为 2 5时 ,其分子质量绝大多数在 50 0～ 1 0 0 0 u之间。分子质量为 50 0～ 1 0 0 0

不同酶水解泥鳅蛋白的特性研究

采用Alcalase 2.4 L、Protamex、Papain、PTN6.0 S、Flavorzyme500 MG水解泥鳅蛋白,探讨了各种酶的酶解特性、产物营养组成和清除DPPH.活性的差异。结果表明,PTN6.0 S和Papain酶解产物的蛋白质利用率、肽得率和水解度均较高。各酶解产物的谷氨酸、色氨酸、天冬氨酸的含量都很高;酶解产物中的氨基酸组成较原料泥鳅蛋白更接近FAO/WHO推荐的成人模式。各种酶均能降解泥鳅蛋白中分子量大于3000 Da的片断,产物中以分子量小于500 Da的肽段为主。Alacalase 2.4 L的酶解产物清除DPPH.的能力最强,其次为PTN6.0 S酶解产物、Protamex酶解产物,而Flavorzyme 500 MG酶解产物清除DPPH.的能力最弱。

高盐稀态酱油酿造过程中蛋白质降解规律的研究

以高盐稀态酱油为研究对象,分析酿造过程中酱液的全氮、氨基酸态氮、肽分子量分布的变化情况,结合其与pH值、总酸、盐含量以及酱醪蛋白酶活力变化的相关性,探讨其蛋白质降解规律。结果表明:环境温度30℃左右,盐水浓度24°Bé/20℃条件下,在发酵前15天各指标均发生显著变化。中性和酸性蛋白酶活力与全氮和氨基酸态氮的变化均具有极显著负相关性(P<0.01)。不同发酵阶段样品肽分子量以3～10ku为主,约占60%～70%。在发酵前15天,各肽段所占总肽量比例变化显著,之后基本保持动态平衡或略有变化。在整个酿造过程中酱液肽分子量分布整体上呈现一种复杂的动态变化规律。

罗非鱼鱼皮鱼鳞蛋白的酶解及超滤分离

采用Alcalase2.4L、Protamex、Papain、PTN6.0S和Neutrase酶解罗非鱼鱼皮鱼鳞蛋白,探讨了超滤对酶解液分子质量分布和氨基酸组成的影响。结果表明,Alcalase2.4L、PTN6.0S酶解产物的蛋白质回收率、肽得率和水解度均较高,Alcalase2.4L∶PTN6.0S为1∶2添加时酶解效果最好,蛋白回收率为96.37%,水解度为13.24%,肽得率为83.13%。经超滤处理后,3000 u以下分子质量的肽段达到97.73%,比超滤前增加了5.37%,总氨基酸含量由84076.12 mg/100 g增加到97234.79 mg/100 g。

高效凝胶过滤色谱法测定玉米蛋白酶解产物寡肽的分子量分布

利用高效凝胶过滤色谱法（ＧＦＣ）测定玉米蛋白酶解产物寡肽混合物的分子量分布。并利用二极管阵列检测寡肽样品中芳香族氨基酸是否被去除。

海洋胶原低聚肽中抗氧化肽的分离及鉴定

为了考察海洋胶原低聚肽中抗氧化肽的活性和结构,本文以三文鱼皮为原料,采用两步酶解法制备出海洋胶原低聚肽(MCOP),在对其分子量分布进行分析的基础上,以DPPH自由基清除能力为指标对其抗氧化活性进行了评价。结果表明,海洋胶原低聚肽中分子量小于1000 u的组分高达90.79%,主要分布在132~576 u范围内,其DPPH自由基清除活性的IC_(50)值约为8.0 mg/m L。然后利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对海洋胶原低聚肽进行分离纯化,收集11个组分峰,对其DPPH自由基清除能力进行了测定。结果表明,11个组分的活性均比海洋胶原低聚肽高。最后利用Q-TOF质谱仪对收集的11个组分进行了结构鉴定,并测定了15个肽段的DPPH自由基清除活性。结果表明,15个肽段均有一定的DPPH自由基清除能力,其中Gly-Arg(GR)、Arg-Glu-Arg(RER)、Ala-Pro(AP)的清除率比海洋胶原低聚肽高,是具有较高抗氧化活性的肽段。本研究为海洋胶原低聚肽的开发利用提供了一定的理论基础。

不同蛋白酶酶解产物活性大豆肽分子量分布状态的研究

研究不同蛋白酶的酶解产物活性大豆肽的分子量分布状态.用6种单一酶和6种复合酶对大豆分离蛋白进行酶解,采用高效液相色谱分析,计算分子量,界定出分子量分布范围.据此考核大豆肽含量及分子量分布状态,判定不同蛋白酶的水解效果.结果表明,6种单一蛋白酶水解生成的蛋白和肽分子量范围差异很大,大豆蛋白改性酶水解效果最好,酶解后分子量分布范围在6 441~144 Dalton之间,MW≤1 000 Dalton的组分占97.42%,符合肽的标准.6种复合蛋白酶水解生成的蛋白和肽分子量范围差异也很大,以大豆蛋白改性酶与蛋白液化剂组合最好,其分子量范围在4 560~141 Dalton之间,MW≤1 000 Dalton的组分占99.52%.

鱼鳞抗氧化肽的酶法制备工艺及特性

采用碱性蛋白酶(alcalase)水解草鱼鱼鳞制备鱼鳞抗氧化肽。用单因素及正交试验考察温度、加酶量、底物水平、酶解时间等因素对酶解反应的影响,确定最适条件。以肽得率、水解度和对羟自由基清除率为考察指标,得出酶解草鱼鱼鳞的较佳工艺条件为温度55℃、底物水平10%、加酶量3%、时间5h、pH9.0;此时酶解液中鱼鳞肽得率为55.2%,羟自由基清除率为98.86%;高效液相色谱法测定鱼鳞抗氧化肽的相对分子质量排布,分子质量在1000D以下的占91.8%,等电点为2.6左右,在pH2～12的条件下溶解度均在98%以上,可广泛应用于食品中。

酶法制备大豆多肽的分子量分布和抑瘤实验观察

目的观察复合酶法制备的大豆多肽,其分子量分布和体内外的抑瘤作用。方法Flavourzyme、Alealase和中性蛋白酶,pH7.0,50～55℃酶解,经分离、离心、喷雾干燥等工艺制成多肽干粉;样品以0.1mol/L Tris-HCl缓冲液为洗脱液,流速0.5ml/min过SephadexG25凝胶柱,分别收集,紫外分光仪280nm波长测定各管的吸收值,并用高效液相排阻色谱法对比同样品测定,计算确定分子量分布;小鼠脑胶质瘤G422体内抑瘤实验,给药剂量1.25、2.50、5.00g/kgbw,人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞体外抑瘤实验,分5个样品浓度mg/ml。结果复合酶法生产制备大豆多肽3批,各批干基肽含量分别54.6%、51.9%、51.8%;Mr≤1000U占总量50%以上。小鼠脑胶质瘤G422体内实验,剂量5g/kgbw组与对照相比多肽有41.2%的抑瘤率(P<0.05),人喉癌Hep-2体外实验结果多肽无直接细胞毒作用。结论紫外分光法与高效液相色谱法测定大豆多肽分子量分布结果基本相同。小鼠G422实验在高剂量组观察到有抑瘤作用。

不同酶水解马氏珍珠贝蛋白的特性研究

本研究采用Alcalase 2.4L、Protamex、Papain、PTN6.0S、Flavorzyme 500MG、Neutrase和内源酶水解马氏珍珠贝肉蛋白,探讨了各种酶的酶解特性、产物的氨基酸组成及肽相对分子质量分布规律和呈味特征的差异。结果表明,PTN6.0S酶解产物的蛋白质利用率、肽得率和水解度均较高,而内源酶均最低。各酶解产物中,谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量均较高。同一氨基酸在不同酶解产物中回收率存在较大差异,色氨酸、苏氨酸、脯氨酸和天冬氨酸在马氏珍珠贝蛋白酶解产物中主要以多肽的形式存在,各酶解产物中氨基酸的回收率和释放率较高的氨基酸与各酶的主要作用位点有很好的对应关系;各种酶均能不同程度地降解马氏珍珠贝肉蛋白和相对分子质量大于5000Da的肽断。各酶水解产物肽相对分子质量分布差异主要体现在3000以下。在各酶解产物中,Papain酶解产物风味最佳,鲜味最高,苦味和腥味最低。