Mechanism Prediction of Monotropein for the Treatment of Colorectal Cancer by Network Pharmacology Analysis

Objective To discover the pharmacological mechanisms of monotropein in colorectal cancer by network pharmacology methods.Methods The main-candidate-target network was constructed by the prediction of targets of monotropein, collection of therapeutic targets of colorectal cancer drugs, and construction of the target network and layers of screening. The data were interpreted by pathway enrichment and target score calculation.Results This study:(1) Demonstrated the potential of monotropein to be a multi-target drug against colorectal cancer using a computational approach;(2) Discovered 10 candidate targets of monotropein, among which protein kinase B(AKT1)exhibited the highest relevance and importance to colorectal cancer and proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src(SRC),Bruton’s tyrosine kinase(BTK), and heat shock protein HSP 90-alpha(HSP90 AA1) also exhibited high relevance;(3) Observed 32 possible pathways related to the effects of monotropein on colorectal cancer, which might explain the mechanism of its action;and(4) Established a method to assess the importance of targets in the network.Conclusions This study offered clues for the mechanism of the bioactivities of monotropein against colorectal cancer by network analysis. Monotropein has the potential to be a multi-target drug against colorectal cancer, which lays the foundation for its clinical applications and further study.

Monotropein Induced Apoptosis and Suppressed Cell Cycle Progression in Colorectal Cancer Cells

Objective: To determine whether monotropein has an anticancer effect and explore its potential mechanisms against colorectal cancer(CRC) through network pharmacology and molecular docking combined with experimental verification. Methods: Network pharmacology and molecular docking were used to predict potential targets of monotropein against CRC. Cell counting kit assay, plate monoclonal assay and microscopic observation were used to investigate the antiproliferative effects of monotropein on CRC cells HCT116, HT29 and LoVo. Flow cytometry and scratch assay were used to analyze apoptosis and cell cycle, as well as cell migration, respectively in HCT116, HT29, and LoVo cells. Western blotting was used to detect the expression of proteins related to apoptosis, cell cycle, and cell migration, and the expression of proteins key to the Akt pathway. Results: The Gene Ontology and Reactome enrichment analyses indicated that the anticancer potential of monotropein against CRC might be involved in multiple cancer-related signaling pathways. Among these pathways, RAC-beta serine/threonine-protein kinase(Akt1, Akt2), cyclin-dependent kinase 6(CDK6), matrix metalloproteinase-9(MMP9), epidermal growth factor receptor(EGFR), cell division control protein 42 homolog(CDC42) were shown as the potential anticancer targets of monotropein against CRC. Molecular docking suggested that monotropein may interact with the 6 targets(Akt1, Akt2, CDK6, MMP9, EGFR, CDC42). Subsequently, cell activity of HCT116, HT29 and LoVo cell lines were significantly suppressed by monotropein(P<0.05). Furthermore, our research revealed that monotropein induced cell apoptosis by inhibiting Bcl-2 and increasing Bax, induced G_1–S cycle arrest in colorectal cancer by decreasing the expressions of CyclinD1, CDK4 and CDK6, inhibited cell migration by suppressing the expressions of CDC42 and MMP9(P<0.05), and might play an anticancer role through Akt signaling pathway. Conclusions: Monotropein exerts its antitumor effects primarily by arresting the cell cycle, causing cell apoptosis, and inhibiting cell migration. This indicates a high potential for developing novel medication for treating CRC.

水晶兰苷调控巨噬细胞极化减少THP-1源性泡沫细胞形成

目的:探讨水晶兰苷(MON)对巨噬细胞极化和THP-1源性泡沫细胞形成的影响。方法:THP-1细胞与100 ng/mL佛波酯(PMA)共孵育48 h诱导M0巨噬细胞,采用流式细胞术进行鉴定;采用不同浓度的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)(0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL)、不同的ox-LDL干预时间(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h)处理巨噬细胞以诱导泡沫细胞;采用ox-LDL或MON干预巨噬细胞,CCK-8检测细胞活力;设置分组:control组、ox-LDL组和ox-LDL+MON组,采用油红O染色观察各组细胞脂质吞噬情况,采用western blotting、荧光定量PCR(RT-qPCR)评估巨噬细胞极化表现及其与铁死亡相关信号通路的结果。结果:ox-LDL呈浓度和时间依赖性增加iNOS、TNF-α蛋白表达;ox-LDL能显著降低细胞活力,200μmol/L MON可显著恢复细胞活力,单纯MON浓度高达1000μmol/L时,细胞活力下降;经ox-LDL诱导可观察到细胞内大量明显红色脂滴,加入MON处理,细胞内的脂滴可见明显减少;与对照组比较,ox-LDL诱导的巨噬细胞CD86 mRNA、iNOS蛋白表达水平升高,CD206 mRNA、Arg-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低,而经过MON干预后,CD86 mRNA、iNOS蛋白表达水平降低,Arg-1、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:MON通过减少巨噬细胞M1极化,促进M2极化,从而抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞形成、增强细胞活力,这可能与抑制铁死亡相关。

基于国家药品评价性抽检的巴戟天饮片质量分析与研究

目的:通过国家药品评价性抽检工作,了解市场上的巴戟天饮片质量及存在的问题,为巴戟天的质量标准提高和市场监管提供数据支持。方法:从全国24个省级行政区抽取巴戟天饮片,按照《中华人民共和国药典》2015年版(一部)巴戟天性状项和薄层鉴别项方法开展检验工作,并进行DNA条形码技术、指纹图谱、环烯醚萜含量测定、真菌毒素残留量共4项探索性研究,分析检验结果以评价巴戟天饮片的市场情况。结果:本次抽检的88家企业的巴戟天饮片共计108批,按照国家法定标准检验的合格率为100%。DNA条形码技术可以有效区分巴戟天及其混伪品。指纹图谱研究结果显示,正品巴戟天指纹图谱相似度均超过95%,混伪品相似度均低于70%。含量测定结果显示,不同巴戟天炮制品中环烯醚萜从种类和含量上具有显著性差别。真菌毒素筛查试验结果显示,有1批样品的黄曲霉毒素G1超出药典限度。结论:按标检验结果显示,市场上巴戟天饮片质量基本合格。根据探索性研究结果,建议标准增加环烯醚萜含量测定和黄曲霉毒素限量检查。

《中国药典》鹿衔草质量标准修订的研究

目的:针对《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版中鹿衔草药材标准存在的问题和局限性,对其质量标准进行改进和完善,为《中国药典》 2020年版鹿衔草药材质量标准的修订提供参考。方法:采用显微鉴别法与薄层色谱法对鹿衔草的鉴别项进行研究,增加了粉末显微鉴别,修订了薄层鉴别中的薄层板和展开剂;增加了鹿衔草质量标准中有关杂质的检查项;采用高效液相色谱法对鹿衔草中的水晶兰苷含量测定方法进行了改进,修订了供试品溶液制备方法。通过直观分析和主成分分析(PCA)对14批鹿衔草样品部分检验项目的测定结果进行分析与评价。结果:粉末显微鉴别法使标准控制更为完善;与原标准的薄层鉴别项比较,新建方法通用性好,斑点清晰;建立的含量测定方法准确、简便、快速、重复性好,对不同仪器和不同色谱柱的适应性好;直观分析和PCA的结果均显示杂质是影响鹿衔草质量的重要因素。结论:增加和修订的检测项目简便可行、重复性好,可用于鹿衔草药材的质量控制。

炮制方法对巴戟天有效成分水晶兰苷含量的影响

目的:测定巴戟天炮制品中水晶兰苷的含量。方法:采用HPLC法。色谱条件:Krom alsil C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm);甲醇-0.4%磷酸水溶液(5∶95→28.8∶71.2,15 min)为流动相;流速1 ml/min;检测波长231 nm;柱温25℃。结果:巴戟天不同炮制品中水晶兰苷含量与生品比较有较大差异,生巴戟天、巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天中水晶兰苷的平均含量分别为13.92 mg/g、9.10 mg/g、9.21 mg/g、12.86 mg/g。结论:不同炮制方法使巴戟天炮制前后水晶兰苷的含量发生改变。

巴戟天不同炮制品中水晶兰苷的大鼠体内血药浓度及组织分布研究

目的探讨炮制对巴戟天中水晶兰苷在大鼠体内血药浓度及组织分布的影响。方法分别给予SD大鼠灌胃巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天的正丁醇萃取物,采用HPLC,Venusil MP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-0.4%磷酸溶液为流动相,梯度洗脱,柱温25℃,检测波长235 nm,测定血浆及各组织中水晶兰苷的含量。结果巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天中水晶兰苷高、中、低剂量(0.177、1.77、17.7μg/m L)的药代动力学特征符合二室模型,在所研究的剂量范围内,AUC与给药剂量呈现良好的线性相关性,符合线性动力学特征。灌胃给药60 min后,水晶兰苷在肾、肺、肝、脾的浓度达到最大,在肾组织和肝组织中的浓度分布为盐巴戟天>巴戟肉>制巴戟天,在脾组织中浓度分布为制巴戟天>盐巴戟天>巴戟肉。结论不同炮制方法对巴戟天在大鼠体内血药浓度及组织分布有一定影响。

HPLC测定巴戟天中的水晶兰苷

目的以水晶兰苷为指标,评价商品巴戟天的质量。方法采用HPLC法,色谱柱为Kromalsil C18柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液(5:95→28.8:71.2,15min),流速为1ml·min-1;检测波长为231nm;柱温为25℃。结果商品巴戟天中水晶兰苷的含量差异较大,仅广东省德庆县高良镇巴戟天规范化种植基地的4.5年生样品中水晶兰苷的含量较为稳定。结论商品巴戟天的质量参差不齐,应从源头上控制巴戟天的质量。

不同炮制去心法对巴戟天水晶兰苷含量的影响

目的:比较不同炮制去心方法炮制的巴戟天中水晶兰苷的含量。方法:采用HPLC法,色谱柱为Kromalsil C18(200mm×4.6 mm,5μm);流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液(90∶10),流速为1.0 ml·min-1,柱温为30℃,检测波长232 nm,进样量为5μl。结果:巴戟天各去心炮制品中水晶兰苷含量以润法最高,其次为煮法,泡后蒸法,泡法,清蒸法,最低为盐蒸法。结论:润法去心对巴戟天中水晶兰苷的含量影响最小,其炮制品中水晶兰苷含量最高。

巴戟天中水晶兰苷的提取分离及其含量测定

目的提取分离巴戟天茎中的水晶兰苷并测定巴戟天不同部位中水晶兰苷含量。方法巴戟天茎用80%的乙醇提取,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,正丁醇萃取物上D101大孔树脂富集环烯醚萜类成分,反复常压正相及反相柱层析,分离得水晶兰苷。采用高效液相色谱法测定巴戟天茎、根、叶中水晶兰苷含量。结果从巴戟天茎中分离得到水晶兰苷。水晶兰苷在巴戟天茎、根、叶的含量分别为18.11、12.22及11.03 mg.g-1。结论巴戟天茎中可以分离得到水晶兰苷,含量比巴戟天根和叶高。

巴戟天不同部位及混伪品中水晶兰苷的含量测定

目的测定巴戟天及其混伪品中水晶兰苷的含量。方法采用HPLC法,色谱条件为KromasilC18柱(150mm×4.6mm,5μm),甲醇-0.4%磷酸水溶液(5:95→28.8:71.2,15min)为流动相,流速1mL/min;检测波长231nm,柱温25℃。结果除海巴戟果和羊角藤外,其他样品均含水晶兰苷,且以巴戟天和广东鸡眼藤的根、叶含量较高。结论可用巴戟天叶及其混伪品广东鸡眼藤替代巴戟天根,进行水晶兰苷的提取。

巴戟天炮制工艺的优化及有效成分变化分析

研究了巴戟天的炮制工艺以及利用该工艺炮制样品前后水晶兰苷和总蒽醌含量的变化情况。以巴戟天的多糖含量为评价指标,通过对氯化钠质量浓度、浸渍时间和蒸制时间3个因素进行单因素试验,根据其结果,每个因素选择3个水平进行正交试验,得到巴戟天炮制的最佳工艺为:用4%的氯化钠浸渍50 min,加热蒸制95 min,趁热除去木心。分别检测了利用该工艺得到的炮制样品和未炮制样品中的水晶兰苷和总蒽醌的含量,与原样相比,水晶兰苷的含量降低了7.18%,总蒽醌的含量降低了10.54%。试验获得了优化后的巴戟天炮制工艺,并为其炮制机制的解析提供了一定的依据。

抑乳调经颗粒含量测定方法的研究

目的通过定量测定抑乳调经颗粒中多种指标成分,公式评分法综合评价制剂的质量,进一步完善其质量标准。方法采用高效液相色谱法(HPLC)对抑乳调经颗粒中君药成分水晶兰苷,臣药成分苔黑粉葡萄糖苷,佐药成分芍药苷,使药成分甘草苷,进行含量测定。结果 4种成分分别在2.156~53.9μg·mL^(-1)(r=0.9999),2.03~50.75μg·mL^(-1)(r=0.9998),3.26~81.5μg·mL^(-1)(r=0.9999),1.42~35.5μg·mL^(-1)(r=0.9999)范围内线性关系良好,加样回收率分别为100.32%,99.43%,101.61%,98.96%。结论该方法准确可靠,能全面控制该颗粒的内在质量,可作为该颗粒的含量测定标准。

星点设计-效应面法优化盐巴戟炮制工艺

目的优化盐巴戟的炮制工艺。方法在单因素试验基础上,以加水量、闷润时间、蒸制时间为自变量,耐斯糖、甲基异茜草素-1-甲醚、水晶兰苷的综合评分为评价指标,通过星点设计-效应面法优选盐巴戟的炮制工艺。结果最佳炮制工艺为加水1.05倍,闷润5.48 h,蒸制2.90 h(100 g巴戟肉加盐1.5 g),测量值和预测值之间的相对误差为3.04%。结论该方法得到的炮制参数准确,重复性好,有一定实际意义。

基于水晶兰苷含量优选制巴戟天炮制工艺

目的:以制巴戟天中水晶兰苷含量为指标,优选制巴戟天炮制工艺。方法:以甘草用量、拌炒时间和煮制锅温为考察因素进行正交试验设计,采用HPLC法测定各样品中水晶兰苷含量:色谱柱为Kromalsil C18(200 mm×4.6 mm,5μm);流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液(90∶10);柱温为30℃;流速为1 ml·min^(-1);检测波长为233 nm;进样量为5μl。结果:制巴戟天经不同工艺炮制后,各试验号水晶兰苷平均含量分别为0.535 6,0.582 4,0.523 4,0.589 1,0.578 6,0.587 8,0.575 2,0.609 1,0.558 7 mg·g^(-1),说明制巴戟天炮制工艺的改变对水晶兰苷的含量有影响。结论:基于水晶兰苷含量的制巴戟天最佳炮制工艺为:甘草用量为6%,拌炒时间为10 min,煮制锅温为100℃。

水晶兰苷对破骨细胞生成的抑制作用

目的探讨巴戟天提取物水晶兰苷对破骨细胞生成的抑制作用。方法将RAW264.7细胞系接种于含有10%胎牛血清的杜贝克改良伊格尔培养基(DMEM)中,分为A组、B组、C组、D组,均加入核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF),B组、C组、D组分别加入水晶兰苷药液(浓度分别为10,20,50μmol/L),连续培养3 d。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法测定不同浓度水晶兰苷药液对破骨细胞生成的毒性影响,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法测定不同浓度水晶兰苷药液对破骨细胞生成的影响,采用实时荧光定量(RT-qPCR)法、蛋白质印迹(WB)法测定破骨细胞关键转录因子活化T细胞核因子1(NFATc1)的mRNA和蛋白表达水平。结果MTT结果显示,各组光密度值(OD值)均在1.25~1.28之间,组间无明显差异(P>0.05);B组、C组、D组TRAP染色细胞数分别为(87.88±8.52)个、(50.38±11.78)个、(25.88±7.81)个,均明显低于A组的(132.10±11.28)个(P<0.05),且在限定浓度范围内与剂量呈正相关;B组、C组、D组NFATc1的mRNA表达水平随水晶兰苷浓度的升高而降低,与A组比较,C组和D组有显著差异(P<0.05);WB试验结果与mRNA表达水平相符。结论水晶兰苷在体外试验中可能是通过降低NFATc1的表达水平来抑制破骨细胞的生成。

复方鹿角霜片的质量控制

目的建立复方鹿角霜片的质量控制方法。方法采用薄层色谱法对制剂中鹿衔草、忍冬藤进行定性鉴别,采用高效液相色谱法测定忍冬藤中的马钱苷、当药苷,鹿衔草中的水晶兰苷的含量。结果定性鉴别薄层色谱斑点清晰,特征明显,专属性强;高效液相色谱法测定含量,专属性强,在范围内水晶兰苷、马钱苷、当药苷进样浓度与色谱峰面积均呈良好的线性关系(r>0.999),平均回收率分别为97.2%,98.4%,96.0%,RSD分别为1.4%,0.8%,0.8%。结论利用薄层色谱法定性、高效液相色谱法定量,方法简便准确,重复性好,可有效控制复方鹿角霜片的质量。

恩施巴戟环烯醚萜苷类成分提取工艺优选及抗氧化活性研究

目的优化恩施巴戟中主要环烯醚萜苷类成分提取工艺,评价恩施巴戟体外抗氧化活性。方法选择经典的加热回流提取法,以乙醇体积分数、溶剂倍量、提取时间为考察因素,以浸膏得率和水晶兰苷含量的综合评分为评判指标,设计正交试验筛选最佳提取工艺条件;测定总还原能力、DPPH清除率、羟自由基清除率,检测其体外抗氧化活性。结果最佳提取工艺条件为6倍量的60%的乙醇加热回流2 h;恩施巴戟具有一定的抗氧化能力,乙酸乙酯部位活性最佳。结论优化的提取工艺稳定可行,可用于提取恩施巴戟的环烯醚萜苷类成分,该研究初步证明了恩施巴戟具有一定的抗氧化活性。

巴戟天中有效成分在Caco-2细胞模型中的吸收转运

目的:研究巴戟天中的有效成分水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸和耐斯糖在人源结肠癌细胞Caco-2单层模型中的吸收特性。方法:通过细胞培养技术建立Caco-2细胞单层模型,以细胞形态学特征、细胞跨膜电阻等指标验证和筛选模型。考察不同pH、不同质量浓度的水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸和耐斯糖对Caco-2细胞活力的影响,以确定给药pH和质量浓度。通过Caco-2细胞转运实验探究药物质量浓度、作用时间与P-糖蛋白抑制剂维拉帕米对水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸和耐斯糖吸收转运的影响。采用高效液相色谱法(HPLC)测定水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸和耐斯糖的累积转运量。结果:水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸和耐斯糖在Caco-2细胞单层模型中吸收良好,三者低质量浓度的双侧表观渗透系数(P_(app))明显大于中、高质量浓度;加入盐酸维拉帕米后,三者的P_(app)变化不大,说明这3个成分的小肠吸收不需要载体。去乙酰车叶草苷酸的液相色谱图中存在少量水晶兰苷,说明去乙酰车叶草苷酸存在首过效应。结论:巴戟天中水晶兰苷、去乙酰车叶草苷酸和耐斯糖3个特征性成分在跨膜转运过程中均以被动转运为主,且3个成分都存在自身质量浓度抑制现象。

一测多评法测定固本统血颗粒中7种成分的含量

目的建立能同时测定固本统血颗粒中水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸、车叶草苷酸、朝藿定A、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ和东莨菪苷含量的一测多评法(QAMS)。方法采用Agilent Zorbax SB-C 18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温:30℃;乙腈-2 mL·L^(-1)磷酸为流动相,梯度洗脱;流速:1.0 mL·min-1;检测波长:235 nm检测水晶兰苷、去乙酰基车叶草苷酸和车叶草苷酸,270 nm检测朝藿定A、淫羊藿苷和宝藿苷Ⅰ,346 nm检测东莨菪苷。以淫羊藿苷为内参物,建立其他6种成分的相对校正因子(RCFs),计算各成分含量。结果7种成分分别在7.49~187.25(r 1=0.9996)、3.37~84.25(r 2=0.9992)、0.78~19.50(r 3=0.9998)、3.09~77.25(r 4=0.9994)、8.97~224.25(r 5=0.9996)、4.66~116.50(r 6=0.9997)、0.59~14.75μg·mL^(-1)(r 7=0.9991)范围内线性关系良好。平均回收率(RSD值)分别为99.67%(0.72%)、98.73%(1.06%)、96.98%(1.18%)、97.94%(1.25%)、100.14%(0.69%)、99.10%(0.75%)、97.37%(1.47%)。QAMS法测得的7种成分含量与外标法实测值无明显差异。结论所建立的QAMS法结果准确,操作便捷,可作为固本统血颗粒多指标成分的质量控制方法。