靶向人多药耐药基因mrp1特异性小分子干扰RNA有效序列筛选

目的:筛选靶向人多药耐药相关蛋白基因(mrp1)特异性小分子干扰RNA(siRNA)的有效序列。方法:设计并体外转录合成靶向mrp1的4条siRNA(mrp1-si251,mrp1-si480,mrp1-si795,mrp1-si1016和空白对照si-阴性),转染转基因单因素肝癌多药耐药细胞Hep G2/mrp1。用RT-PCR检测mrp1 mRNA表达,流式细胞仪检测多药耐药相关蛋白表达、细胞内柔红霉素(DNR)蓄积,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞对阿霉素(ADM)的敏感性。结果:4条siRNA均能不同程度逆转Hep G2/mrp1细胞由mrp1介导的多药耐药。转染72h后,mrp1-si795组和mrp1-si1016组的mrp1 mRNA表达水平分别分别下调了(86.36±2.26)%和(85.54±1.04)%,较mrp1-si251组和mrp1-si480组明显下降(P<0.05);细胞内柔红霉素蓄积由多到少依次为mrp1-si795组最多,mrp1-si1016组次之,mrp1-si480组较少,mrp1-si251组最少(P<0.05);mrp1-si795组对ADR耐药的相对逆转率(86.36%)最高,mrp1-si1016组(85.54%)次之,较mrp1-si251组(60.93%)和mrp1-si480组(70.29%)有明显差异(P<0.05);mrp1-si1016组和mrp1-si795组多药耐药相关蛋白表达明显下调。结论:实验设计的靶向mrp1 mRNA的siRNA序列能够不同程度逆转多药耐药相关蛋白介导的人肝癌耐药细胞HepG 2/mrp1的多药耐药性,mrp1-si1016和mrp1-si795效果最好,mrp1-si480较差,mrp1-si251最差。mrp1-si1016和mrp1-si795可以作为进一步实验的靶序列。

多药耐药相关蛋白基因在肺癌组织中的表达及意义

目的探讨多药耐药相关蛋白基因(MRP1)、肺耐药蛋白(LRP)基因和增值细胞抗原Ki-67在肺癌中的表达及相关性。方法应用免疫组织化学方法,检测110例肺癌组织和22例其他恶性肿瘤(食管癌、胃癌、膀胱癌等)组织中LRP、MRP1及Ki-67的表达情况,并以其中的23例癌旁组织作比较。结果非小细胞肺癌(NSCLC)中MRP1、LRP表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05),小细胞肺癌(SCLC)与癌旁组织无显著性差异(P>0.05)。其他恶性肿瘤组织中其表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。Ki-67在各种肿瘤组织中均呈阳性表达,与LRP、MRP1表达无相关性。结论NSCLC存在广泛的原发性多药耐药现象,耐药基因LRP、MRP1参与了肺癌多药耐药的形成,LRP的表达率最高,可作为一项独立的预警指标,耐药与肿瘤细胞增殖无明显相关性。

松材线虫耐药基因克隆及其功能

为探究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)耐药的分子机理,对松材线虫耐药基因Bx-mrp1进行鉴定并对其蛋白结构及功能进行了研究。在松材线虫基因组数据中得到松材线虫与秀丽线虫(Caenorhabditis elegans) mrp1具有同源性的基因,命名为Bx-mrp1,并比较了松材线虫Bx-mrp1与相近线虫属之间的mrp基因差异。对松材线虫Bx-mrp1完整蛋白编码区(CDS)进行PCR扩增后,运用RNAi技术对该基因进行基因沉默,分析沉默该基因后对松材线虫死亡率的影响。通过PyM OL软件对Bx-MRP1蛋白质进行三维结构预测。结果表明:在NCBI中,通过BLAST比对,Bx-mrp1与秀丽线虫mrp1同源性为43%。Bx-MRP1蛋白质包含32个α螺旋和18个β折叠,以及含有3个TMD和2个NBD结构,具有多个跨膜结构域,表明Bx-mrp1具有跨膜运输的功能。通过PCR得到松材线虫Bx-mrp1基因CDS区全长为4 659 bp。在对Bx-mrp1基因沉默后,发现RNAi处理组的松材线虫在同质量浓度的苦参碱药剂胁迫下的死亡率有所增加,在多药耐药生理过程中起正向调控作用。

siRNA介导多药耐药相关蛋白(MRP的表达沉默(英文)

利用pSIREN-RetroQ载体构建了3个沉默多药耐药相关蛋白(MRP1)基因表达质粒pSIREN-siRNAs.并通过限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序鉴定,将截断的MRP1和全长MRP1cDNA分别克隆到真核表达载体pEGFP-N2和pcDNA3.1中,产生了pEGFP-MRP1T和pcDNA-MRP1表达质粒.质粒pEGFP-MRP1T分别与3个pSIREN-siRNAs共转染HEK293细胞沉默MRP1T-GFP靶基因,pSIREN-siRNA1作为阴性对照.荧光显微镜下显示结果表明,与pSIREN-siRNA1相比,pSIREN-siRNA2和pSIREN-siRNA3产生的siRNA能够有效沉默MRP1T-GFP融合蛋白的表达.为了沉默全长MRP1基因的表达,pcDNA-MRP1分别与3个pSIREN-siRNAs共转染HEK293细胞.Western印迹和MTT分析表明,pSIREN-siRNA2和pSIREN-siRNA3能有效抑制190kDMRP1在HEK293细胞中的表达,而pSIREN-siRNA1则不能.pSIREN-siRNA2和pSIREN-siRNA3能逆转MRP1转染HEK293细胞产生的多药耐药性.RNA二级结构预测结果分析表明,siRNA1靶序列mRNA局部自由能热动力参数ΔG低于siRNA2和siRNA3靶序列mRNA局部自由能热动力参数,siRNA1的GC含量和Tm值高于siRNA2和siRNA3.这些数据提示,siRNA和局部靶结构可能影响siRNA对MRP1 mRNA表达的沉默作用.

多药耐药相关蛋白在乳腺癌组织中的表达及其与预后关系

目的:研究多药耐药相关蛋白（Multidrug resistance-associated protein 1,MRP1）在乳腺癌组织中的表达,评估其在乳腺癌预后中的作用。方法:采用免疫组织化学方法（IHC）检测47例手术切除的乳腺癌组织中MRP1的表达,并分析其与临床、病理特征的关系及对预后的影响。结果:（1）MRP1在乳腺癌组织中的阳性表达率为85.1％（40/47例）,其中高表达者占53.2％（25/47例）;（2）腋淋巴结阳性者MRP1表达水平明显高于腋淋巴结阴性者（P<0.05）,MRP1表达与月经状况、肿瘤大小、组织分级和激素受体状况均无关（P>0.05）;（3）Kaplan-Meier生存分析结果表明MRP1表达与无病生存期明显相关（P<0.05）,但和总生存期无关（P>0.05）;（4）Cox单因素分析显示肿瘤大小和MRP1表达与无病生存期明显相关（P<0.05）,但仅有肿瘤大小和总生存期明显相关（P<0.05）;而多因素分析却显示只有腋淋巴结转移和无病生存期（P<0.01）和总生存期（P<0.05）明显相关。结论:MRP1在乳腺癌组织中具有较高的表达水平,与乳腺癌患者的无病生存期有关,而与总生存期无关。

多药耐药相关蛋白在乳腺癌组织中的表达及预后关系

目的研究多药耐药相关蛋白(Multidrug resistance-associated protein 1,MRP1)在乳腺癌组织中的表达,评估其在乳腺癌预后中的作用。方法采用免疫组织化学方法(lmmunohistochemistry,IHC)检测60例手术切除的乳腺癌组织中MRP1的表达,并分析其与临床、病理特征的关系及对预后的影响。结果(1)MRP1在乳腺癌组织中的阳性表达率为85.0%(51/60例),其中高表达者32例(53.3%);(2)腋淋巴结转移阳性者MRP1表达水平明显高于腋淋巴结转移阴性者(P<0.05),MRP1表达与月经状况、肿瘤大小、组织分级和激素受体状况均无关(P>0.05);(3)Kaplan-Meier生存分析结果表明:MRP1表达与无病生存期明显相关(P<0.05),但和总生存期无关(P>0.05);(4)COX多因素分析显示肿瘤大小、腋淋巴结转移和雌激素受体状况仍是影响无病生存期和总生存期的重要因素(P<0.05),同时MRP1表达与和无病生存期和总生存期均无关(P>0.05)。结论MRP1在乳腺癌组织中具有较高的表达水平,但与乳腺癌患者预后无关。

腺病毒载体介导的发夹状RNA抑制三氧化二砷耐药的K562/AS2细胞MRP1基因表达的实验研究

目的 构建MRP1特异性发夹状RNA（shRNA）重组腺病毒载体,并研究其对耐三氧化二砷（ATO）的白血病K562/AS2细胞MRP1基因表达的抑制作用.方法 构建MRP1特异性shRNA重组腺病毒,并感染K562/AS2细胞;用荧光实时定量PCR法分析MRP1 mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRP1蛋白表达;MTT法检测该细胞对ATO及依托泊苷（VP16）的细胞毒作用.结果 pAd-EGFP-U6.MRP1.shRNA重组腺病毒感染前后,K562/AS2细胞中MRP1 mRNA和蛋白表达水平分别为（34.70±0.28）、（4.19±0.03）（P〈0.05）和（26.40±0.16）、（10.85±0.37）（P〈0.05）;感染前后K562/AS2细胞对ATO及VP16耐药倍数分别为（11.4078±0.3183）、（1.6126±0.3015）和（5.9141±0.0149）、（1.7664±0.1038）,逆转倍数分别为（7.2409±1.3668）和（3.3555±0.1886）（P〈0.05）.结论 成功构建了pAd-EGFP-U6-MRP1-shRNA重组腺病毒载体,该载体感染K562/AS2细胞后可抑制细胞MRP1基因表达以及逆转该细胞对ATO和VP16的耐药.

短发夹RNA抑制三氧化二砷耐药的白血病K562／AS2细胞MRP1基因表达的实验研究

目的研究短发夹RNA（shRNA）对耐三氧化二砷（As2O3）的白血病K562／AS2细胞MRP1基因表达的抑制作用。方法设计并合成3条针对MRP1基因的shRNA序列，在脂质体的介导下转染K562／AS2细胞；用荧光实时定量PCR分析MRP1 mRNA的表达水平；流式细胞术检测MRP1蛋白表达和细胞内柔红霉素蓄积量。结果经MRP1 shRNA作用24h后，K562／AS2细胞株中MRP1 mRNA和蛋白表达水平明显下降，最大下调幅度分别为（79．1±0．07）％和（62．48±0．86）％（P〈0．05），同时细胞内柔红霉素蓄积量显著增加（P〈0．05）。结论MRP1 shRNA可抑制As2O3，耐药的白血病细胞株K562／AS2细胞MRP1基因的表达。

多药耐药及相关蛋白基因抗砷作用

目的研究多药耐药基因(MDRI)、多药耐药相关蛋白基因(MRP1)在长期砷暴露的细胞获得对砷的耐受过程中的作用,为抗砷机制的研究提供基础依据。方法采用抑制剂维拉帕米(Verapamil)、MK571,在单一水平和联合水平上阻断MDR1和MRP1基因发挥作用,通过四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞的生存率及半数致死量(IC50);通过原子荧光法(AFS)分别检测给予Verapamil、MK571的实验组和对照组在不同时间点抗砷细胞内砷的含量。结果在2,4,8,16,32,64μmol/L砷浓度下,给予抑制剂的抗砷细胞生存率分别为(73.5±0.02)%,(54.6±0.07)%,(44.2±0.05)%,(20.5±0.09)%,(13.5±0.1)%,(7.6±0.05)%,明显低于同步对照组的生存率(93.5±0.05)%,(71.5±0.02)%,(49.2±0.03)%,(38.8±0.08)%,(37.6±0.06)%,(19.5±0.04)%。Verapamil作用下IC50为8.8μmol/L,MK571作用下IC50为6.22μmol/L;同时给于2种抑制剂时,逆转作用更为明显,IC50为5.23μmol/L;MK571作用下,抗砷细胞内砷含量增加明显,至10 h时砷含量达到最大值1.62 ng,明显高出Verapmil组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论MDR1、MRP1基因在抗砷细胞获得耐药性过程中起重要作用。