五味子乙素对MDR1介导的人骨肉瘤细胞U-2 OS/ADR所致多药耐药性的逆转研究

目的研究五味子乙素(schisandrin B,SchB)对人骨肉瘤细胞阿霉素耐药株U-2 OS/ADR多药耐药的逆转效果及逆转机制。方法采用浓度梯度递增法构建U-2 OS阿霉素耐药株U-2 OS/ADR;使用MTT法测定Sch B对于U-2 OS多药耐药逆转的影响,实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测SchB对MDR1基因转录的影响,流式细胞术检测细胞膜表面MDR1蛋白的表达,流式细胞术检测五味子乙素对罗丹明123外排和蓄积的影响,Western Blotting检测五味子乙素对PI3K/AKT通路的影响。结果五味子乙素能逆转U-2 OS/ADR细胞的多药耐药,并且能抑制MDR1基因的转录,降低膜表面MDR1蛋白的表达,增加细胞内罗丹明123的蓄积、减少外排,抑制U-2 OS/ADR细胞中PI3K/AKT通路的激活。结论五味子乙素具有强大的逆转人骨肉瘤细胞U-2 OS多药耐药的效果,其机制和下调耐药株的MDR1基因和蛋白水平,抑制PI3K/AKT通路激活有关。

环孢素A对THP-1细胞的增敏作用及与多药耐药相关蛋白-1的关系

目的:观察环孢素A(CsA)处理急性单核细胞白血病细胞株THP-1后对柔红霉素(DNR)的耐药性及与多药耐药相关蛋白-1(MRP1)表达的关系,探讨CsA对THP-1细胞的化疗增敏作用及相关机制。方法:噻唑蓝(MTT)法、荧光分光光度法、共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)法分别检测CsA处理前后50% THP-1细胞生长受抑的DNR浓度(IC50)、THP-1细胞内DNR含量及分布的变化。免疫细胞化学法、Western blot法检测CsA处理前后THP-1细胞MRP1蛋白表达量的变化。结果:CsA处理后THP-1细胞的IC50明显下降(1.5364±0.1751 vs 0.5588±0.0547,P<0.01),细胞内DNR含量明显增加(21.40±1.71 vs 131.96±16.45,P<0.01),且胞浆内分布更加均匀;同时MRP1蛋白表达量增高(0.2665±0.0042 vs 0.3169±0.0062,P<0.01)。结论:CsA可增加THP-1细胞对DNR的敏感性,降低其耐药性,并提示CsA对THP-1细胞耐药性的改变不是通过降低其MRP1蛋白表达量来实现的。

姜黄素通过调控组蛋白乙酰化修饰上调乳腺癌MCF-7和MCF-7/DOX细胞中MDR1表达

目的:从组蛋白乙酰化修饰角度探讨姜黄素上调乳腺癌MCF-7和MCF-7/DOX细胞中多药耐药基因1(multidrug resistance protein 1,MDR1)表达水平的作用机制。方法:CCK-8(Cell Counting Kit-8)法观察姜黄素对MCF-7和MCF-7/DOX细胞生长增殖以及多柔比星敏感性的影响;Realtime PCR和Western blot方法检测姜黄素处理前后两种细胞中MDR1 mRNA和蛋白质表达水平的变化;染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,CHIP)检测姜黄素对两种细胞中MDR1启动子区相关组蛋白H3、H4乙酰化水平的影响。结果:不同浓度姜黄素处理72 h对MCF-7和MCF-7/DOX细胞的生长增殖有显著抑制作用,其IC50值分别为22.03μmol/L和27.46μmol/L;10μmol/L姜黄素处理72 h可显著提高两种细胞多柔比星敏感性,多柔比星IC50值分别下降了57.14%和54.52%(P<0.05);姜黄素处理MCF-7和MCF-7/DOX细胞后,MDR1在mRNA水平分别上调(32.90±0.96)和(5.70±0.55)倍(P<0.05),在蛋白质水平分别上调(2.26±0.18)与(2.90±0.21)倍(P<0.05);CHIP结果显示姜黄素对两种细胞中MDR1启动子区相关组蛋白H3、H4的乙酰化水平均有显著上调作用。结论:姜黄素在增强MCF-7和MCF-7/DOX细胞多柔比星敏感性的同时,可通过调控MDR1启动子区相关组蛋白H3、H4的乙酰化水平而上调MDR1的表达。

miR-133a/b和MRP1在耐药性癫痫患者外周血含量的观察

目的:探讨外周血中microRNA-133a/b(miR-133a/b)及多药耐药相关蛋白1(multidrug resistanceassociated protein 1,MRP1)的含量与癫痫患者耐药性的相关关系。方法:生物信息学预测靶向调控MRP1的miRNAs,构建MRP1野生型及突变型3’UTR报告基因载体,双萤光素酶报告基因技术验证预测的miRNAs对MRP1的靶向调控作用。此外,收集95例接受药物治疗的癫痫患者(其中耐药患者37例,非耐药患者58例)外周血,实时荧光定量PCR检测外周血中这些miRNAs的含量,ELISA检测外周血中MRP1蛋白的含量。最后分析这些miRNAs及MRP1含量与癫痫耐药的相关性。结果:Target Scan软件预测miR-133a/b可能靶向调控MRP1,双萤光素酶报告基因技术发现,实验组(共转入miR-133a/b mimics、p MIR-MRP1及pRLTK质粒)较对照组(共转入scramble mimic、p MIR-MRP1及pRLTK质粒)相比,萤光素酶活性分别下调76.9%和64.1%(P<0.01);突变组(共转入miR-133a/b mimics、p MIR-mut-MRP1及pRLTK质粒)较实验组的萤光素酶活性分别上调3.61倍和2.04倍(P<0.01)。实时荧光定量PCR和ELISA检测发现:用药前非耐药性癫痫患者中miR-133a/b的含量分别是耐药性癫痫患者含量的2.18倍和1.74倍(P<0.05),而MRP1在耐药性癫痫患者中的含量是非耐药性癫痫患者中的3.72倍(P<0.01);用药后非耐药性癫痫患者中miR-133a/b的含量分别是耐药性癫痫患者含量的2.76倍和2.95倍(P<0.05),而MRP1在耐药性癫痫患者中的含量是非耐药性癫痫患者中4.99倍(P<0.01)。结论:miR-133a/b可直接靶向调控MRP1,且在耐药性癫痫患者血清中,miR-133a/b呈现低水平,MRP1蛋白呈现高水平,miR-133a/b联合MRP1有望成为早期诊断癫痫药物敏感性的指标。

P-gp、MRP1、BCRP在晚期NSCLC中的表达及意义

[目的]探讨P-gp、MRP1、BCRP在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,及其与NSCLC患者临床病理特征及化疗效果的关系。[方法]采用免疫组化SP法检测32例晚期NSCLC患者治疗前肿瘤标本中P-gp、MRP1、BCRP的表达。所有患者接受以铂类为主的化疗方案2个周期,分析P-gp、MRP1、BCRP表达情况与患者临床病理特征及化疗效果的关系。[结果]NSCLC肿瘤中P-gp、MRP1和BCRP阳性表达率分别为46.88%、75.00%和46.88%。腺癌中P-gp表达高于鳞癌;MRP1的表达与年龄有关,60岁以上的患者显示了更高的MRP1表达率。BCRP的表达与化疗效果相关,但P-gp和MRP1的表达与疗效无显著性相关。[结论]BCRP可以作为判断晚期NSCLC患者化疗效果的预测因子。

脊索瘤细胞系CM-319中放化疗抵抗相关基因的表达及临床意义

[目的]探讨多药耐药相关基因如缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、多药耐药基因(MDR1)及多药耐药相关蛋白(MRP1)在脊索瘤细胞系CM-319中的表达及临床意义。[方法]用RT-PCR检测HIF-1α、MDR1、MRP1基因表达,间接免疫荧光及免疫细胞化学Envision法检测HIF-1α、MRP1蛋白在CM-319中的表达情况,并分析其与放化疗抵抗的关系。[结果]常氧条件下,在脊索瘤细胞系中能检测到HIF-1α及MRP1 mRNA的表达,但未检测到MDR1 mRNA的表达(P<0.01),间接免疫荧光及免疫细胞化学可以检测到HIF-1α表达在细胞浆及核中,而MRP1主要表达在细胞浆中。[结论]HIF-1α与MRP1的过度表达在脊索瘤的放化疗抵抗中可能具有重要作用,而MDR1表达未被检测到,提示脊索瘤的放化疗抵抗主要与HIF-1α和MRP1相关。

川西獐牙菜醇提物上调HepG2细胞膜转运蛋白MRP3、核转录因子SP1及核受体CPF、PXR表达

目的体外培养HepG2细胞观察川西獐牙菜醇提物(Swertia mussitii Franch)对多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance protein 3,MRP3)、核转录因子SP1(specificity protein 1 transcription factor,SP1)及核受体孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)、CYP7A启动子结合因子(CYP7A promoter-binding factor,CPF)表达的影响。方法用MTT比色法检测川西獐牙菜醇提物的最佳作用浓度,再分别于0、12、24、48、72h刺激HepG2细胞,抽提细胞的RNA、总蛋白和核蛋白,采用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测膜转运蛋白MRP3、转录因子SP1及核受体PXR、CPF在转录与蛋白水平的表达变化。每个时间点设立阴性对照DMSO组和阳性对照熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)组。结果川西獐牙菜醇提物可显著诱导HepG2细胞膜转运蛋白MRP3的mRNA和蛋白水平的高表达,其作用强于UDCA(P<0.05)。川西獐牙菜醇提物也可明显上调核转录因子SP1及核受体PXR的mRNA和蛋白表达水平,作用强于UDCA。对CPF表达的上调作用与UDCA相当(P<0.05)。结论川西獐牙菜醇提物可刺激HepG2细胞膜转运蛋白MRP3上调,且有可能是通过核转录因子SP1及核受体PXR、CPF上调其表达。

化痰降气方对人支气管上皮细胞多药耐药相关蛋白1的影响

目的:研究化痰降气方对人支气管上皮细胞上多药耐药相关蛋白1功能和表达的影响。方法:体外培养人支气管上皮细胞16HBE14o-,以5-羧基二乙酸荧光素(5-CFDA)为底物,采用流式细胞术检测给予化痰降气方后细胞内荧光强度的变化评价MRP1功能;real time RT-PCR测定给予化痰降气方后MRP1 mRNA的变化。结果:化痰降气方在一定浓度范围内能促进16HBE14o-增殖;与5-CFDA模型组比较,低、中、高浓度(100、1 000、2 000μg/mL)的化痰降气方对MRP1功能分别提高22.59%、47.14%、68.36%;化痰降气方能浓度依赖性诱导16HBE14o-细胞MRP1 mRNA表达的量,中、高浓度诱导作用有显著性差异(P<0.05)。结论:化痰降气方能提高16HBE14o-MRP1外排功能和mRNA的含量,且呈一定的浓度依赖性。

多药耐药相关蛋白1 mRNA在慢性癫痫大鼠脑中的表达

目的难治性癫痫(refractory epilepsy,RE)的发生机制尚不明确。现已明确多药耐药相关蛋白(multidrugresistance associated protein,MRP)1与某些肿瘤耐药有关。为了探讨该蛋白是否与癫痫的多药耐药相关,本研究利用大鼠癫痫模型观察癫痫发作对大鼠脑MRP1 mRNA表达的影响及左乙拉西坦(Levetiracetam,LEV)和托吡酯(Topiramate,TPM)的作用。方法通过脑立体定向技术,将海人酸(kainic acid,KA)1.5μg(3μl)注射至SD大鼠海马,制作癫痫模型。对照组大鼠海马注射3μl等渗盐水。建立模型3 d后,将癫痫组和对照组大鼠各15只随机分为LEV、TPM和NS亚组分别给予LEV(50 mg/kg)、TPM(40 mg/kg)和等体积NS灌胃,1次/d,共30 d。用荧光定量RT-PCR测定大鼠颞叶、海马MRP1 mRNA表达水平,并进行定量分析。结果各组癫痫大鼠颞叶、海马MRP1 mRNA表达与相应非癫痫组相比呈增高趋势,但差异无统计学意义。非癫痫或癫痫大鼠各处理组间颞叶或海马MRP1 mRNA表达水平总体差异均无统计学意义。结论病程为1个月的慢性癫痫大鼠脑内MRP1 mRNA表达无明显增加,TPM、LEV不影响正常和癫痫大鼠脑MRP1 mRNA的表达。

神经胶质瘤C6/VP16多药耐药细胞株的建立

目的建立神经胶质瘤C6细胞对依托泊苷(VP16)耐药细胞株C6/VP16,探讨其耐药的可能机制。方法采用浓度递增和短期大剂量药物诱导相结合的方法建立大鼠C6/VP16耐药细胞株;光镜下观察C6/VP16细胞株的形态学变化;细胞计数试剂盒-8检测C6/VP16细胞株对VP16、阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、环磷酰胺(CTX)、替莫唑胺(TMZ)的耐药敏感性;westernblot检测多药耐药相关蛋白1(MRP1)的表达量变化。结果经过65代诱导培养,成功建立可操作的、重复性好的C6/VP16耐药细胞株。C6亲代细胞形态规则、大小均一,生长迅速,紧密生长,每2～3d传代;C6/VP16细胞株,突起增多,生长周期受抑制,生长变缓,每10～12d传代。VP16、TMZ、CTX、ADM和VCR作用C6亲代细胞的半生长抑制浓度(IC50)分别为(0.105±0.043)、(27.284±0.529)、(5.800±0.317)、(6.636±0.315)和(19.146±0.526)μg/ml,而作用C6/VP16细胞株的IC50分别为(0.943±0.052)、(33.251±0.288)、(32.943±0.215)、(35.251±0.126)和(35.604±0.426)μg/ml;VP16、CTX和ADM作用C6/VP16细胞株IC50较C6亲代细胞差异显著(P<0.05)。C6/VP16细胞株MRP1的表达量较亲代C6细胞明显增加(P<0.05)。结论 C6/VP16细胞株对ADM和CTX存在明显交叉耐药,而对TMZ和VCR无明显交叉耐药;多药耐药性是多种机制相互作用的结果,MRP1可能参与其中。

MRP1与VEGF在儿童急性白血病的表达及临床相关研究

目的探讨儿童急性白血病患者多药耐药相关蛋白1(MRP1)与血管内皮生长因子(VEGF)的表达及其临床意义。方法应用免疫组织化学S-P方法检测46例儿童急性白血病患儿治疗前后MRP1及VEGF的表达,结合临床分析,观察MRP1与VEGF的表达与临床化疗疗效的关系。结果46例初治急性白血病患儿中MRP1阳性表达率为16/46(34.8%),VEGF为20/46(43.5%)。Person相关分析表明,MRP1与VEGF表达无明显相关(r=0.215,P>0.05)。MRP1表达阳性患者的完全缓解(CR)率(37.5%)低于表达阴性患者CR率(73.3%),两者差异显著(P<0.05);VEGF表达阳性者CR率为45%,表达阴性者CR率为69.2%,两者差异有显著性(P<0.05)。MRP1与VEGF均为阳性患儿9例中CR率为11.1%(1/9),表达均为阴性患儿19例中CR率为89.5%(17/19),两者比较有显著性差异(P<0.05)。结论检测MRP1与VEGF蛋白表达对判断急性白血病的疗效有良好的预测作用,MRP1与VEGF阳性高表达可能是影响急性白血病患儿CR率的重要危险因素。

小细胞肺癌化疗前后PXR和MDR1在外周血单个核细胞中的表达及意义

目的:研究孕烷受体(PXR)蛋白及多药耐药基因(MDR1)蛋白在小细胞肺癌化疗前后外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达,探讨两者的相关性及其临床意义。方法:选取43例小细胞肺癌患者为实验组,20例健康人群为对照组,采用液基薄层离心涂片法分离PBMCs,SP免疫组织化学化方法检测PBMCs中PXR及MDR1的蛋白表达水平,并比较小细胞肺癌患者化疗前后PBMCs中PXR及MDR1的表达变化。结果:化疗前小细胞肺癌患者PXR、MDR1的蛋白表达与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。化疗后小细胞肺癌患者PXR和MDR1的蛋白表达较化疗前增加,且两者的表达差异均具有显著性意义。化疗前后小细胞肺癌患者PBMCs中PXR和MDR1的表达均呈正相关。结论:PBMCs中PXR、MDR1的表达与小细胞肺癌耐药相关,外周血PXR高表达可能是诱导化疗相关的MDR1表达升高的原因,外周血的检测可为早期判断小细胞肺癌临床耐药提供一种更为简单易行的方法。

RNA干扰YB-1表达对阿霉素诱导性耐药的K562细胞mdr1基因表达的影响

目的探讨Y-盒结合蛋白1（YB-1）对白血病细胞系K562细胞药物诱导性mdrl基因表达的调控作用。方法阿霉素间歇性长期作用于K562细胞，剂量逐渐增加，诱导细胞耐药。RT-PCR检测mdrl和YB-1基因表达，流式细胞术检测mdrl基因编码的P-糖蛋白（P-gP）表达，蛋白质印迹法检测YB-1蛋白核易位程度。通过RNA干扰技术使K562细胞中YB-1基因表达沉默，再用阿霉素处理YB-1基因沉默细胞，诱导细胞耐药，用RT-PCR、流式细胞术分别检测mdrlmRNA和P-gp的表达。结果经阿霉素作用后K562细胞mdrl基因转录上调，P—gP表达增加，同时YB-1基因转录也增强，且出现明显的核易位。YB-1基因沉默后，mdrl基因诱导性表达明显减少，阿霉素浓度为0．03、0．05μg／ml时 mdr1 mRNA表达水平分别较未行shRNA干扰组降低（53．7±0．1）％和（64．3±0．0）％，P-gP表达呈同样趋势。结论阿霉素诱导K562细胞耐药形成的过程中，YB-1对于mdr1基因的转录活化起一定的作用。

MDRI的siRNA干扰口腔Tca8ll3/DDP细胞表达的研究

目的探讨小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)对口腔鳞癌多药耐药基因mdr1(MDRI)及其表达产物P-糖蛋白(permeability-glyco-protein,P-gp)的干扰作用。方法体外构建针对MDR1的小干扰RNA,将其转染至人舌癌耐药细胞系Tca8113/DDP,采用RT-PCR法检测转染前后MDR1 m RNA的表达;采用免疫细胞化学技术比较转染前后P-gp的表达;采用MTT法检测转染前后肿瘤耐药细胞对顺铂的敏感性。结果 Tca8113/DDP细胞经MDR1-si RNA转染后48 h的转染率达最高,为71.3%;转染后mdr1 m RNA表达较对照组显著降低,降低率为68.32%,转染48 h后P-gp的表达较对照组明显降低;si RNA可显著提高Tca8113/DDP细胞对DDP的敏感性,逆转其耐药性,耐药倍数为2.05。结论 si RNA可以明显干扰口腔鳞癌MDR1及相应蛋白P-gp的表达。

五味子甲素逆转多药耐药相关蛋白1多药耐药机制的研究

目的:探讨五味子甲素对表达多药耐药相关蛋白1的肿瘤耐药细胞株的逆转耐药作用及相关机制。方法:FCM测定不同浓度五味子甲素对柔红霉素抑制HL60/ADR生长及同一浓度五味子甲素对不同化疗药物抑制HL60/ADR和HL60/MRP细胞生长的影响;五味子甲素作用前后,HL60/ADR和HL60/MRP细胞内化疗药物柔红霉素和MRP1特异性底物二醋酸羧基荧光素积聚的变化。结果:25μmol/L五味子甲素可有效降低HL60/ADR、HL60/MRP对柔红霉素、长春新碱和依托泊甙的半数抑制浓度,逆转倍数分别是5,11,16和3,3,13倍;五味子甲素能够增加柔红霉素和MRP1特异性底物二醋酸羧基荧光素在细胞内的积聚。结论:五味子甲素可以逆转不同化疗药物对MRP1介导的耐药,其逆转机制与增加化疗药物的积聚能力有关。

甘草提取物对小鼠肝脏核因子E2相关因子2及其下游基因表达的影响

目的考察甘草提取物对核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路及其下游基因尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、γ谷氨酰半胱胺酸合成酶(γGCS)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和多药耐药相关蛋白2(MRP2)的影响。方法 12只小鼠随机分为对照组和甘草提取物组(150 mg·kg-1)。给药后24 h处死取肝组织,采用qRT-PCR技术检测小鼠肝中Nrf2、UGT1A1、γGCS、MRP1和MRP2 mRNA的表达;Western blot技术测定Nrf2蛋白的表达。结果与对照组比较,甘草提取物显著诱导了小鼠肝脏中Nrf2 mRNA和蛋白的表达,同时Nrf2下游基因UGT1A1、γGCS、MRP1和MRP2 mRNA的表达也显著提高(均P<0.05)。结论甘草提取物诱导了小鼠肝脏中II相解毒酶UGT1A1、γGCS及转运体MRP1、MRP2,其机制可能与上调Nrf2转录因子的表达,激活Nrf2细胞信号转导通路有关。

依维莫司和LBH589对耐药急性髓系白血病细胞增殖、凋亡及多药耐药相关蛋白表达的影响

目的探讨雷帕霉素衍生物依维莫司（RAD001）或联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对耐药急性髓系白血病细胞株HL-60／ADM细胞增殖、凋亡和逆转耐药的影响。方法采用不同浓度RAD001或联合LBH589处理HL-60／ADM细胞，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖活力，Hoechst33342染色法和AnnexinV—FITC／PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡、阿霉素摄取率和多药耐药相关蛋白1（MRP1）表达评估逆转耐药效应。进一步检测处理前后细胞信号通路蛋白变化，探讨其机制。结果10～50μmol／LRAD001均能够抑制HL-60／ADM细胞增殖、诱导凋亡，在作用48和72h时30μmol／L药物浓度达到最大抑制效果，进一步增加药物浓度细胞增殖抑制率并没有明显增加（P〈0．05）。不同浓度RAD001和LBH589联合处理HL-60／ADM细胞，没有明显的协同抑制增殖作用[协同指数（CI）≥1．0]。10μmol／LRAD001处理HL-60／ADM细胞可以明显下调细胞表面MRP1表达（93．90％±4．20％比79．10％±3．28％，P〈0．05），提高HL-60／ADM细胞阿霉素蓄积率（8．53％±0．68％比15．37％±1．46％，P〈0．01）。深入机制研究表明，RAD001可以阻断P13K／AKT／mTOR信号通路活性，通过上调1）53抑制MRPI蛋白的活性。结论RAD001与LBH589联合没有协同抑制HL-60／ADM细胞增殖作用。但RAD001单药能够有效抑制HL-60／ADM细胞增殖，诱导凋亡，通过阻断P13K／AKT／mTOR信号通路抑制细胞MRP1蛋白的表达，提高细胞阿霉素摄取率而逆转耐药。