多重PCR—一种高效快速的分子生物学技术

多重PCR是在一个反应体系中同时扩增多个目的片段的PCR技术,具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点,适合大量样本的分析与鉴定。简述了多重PCR的基本原理,综述了多重PCR在医学、遗传学、植物生物学、海洋生物学等生命科学领域的应用现状,对目的片段选择、引物设计、复性温度和时间等PCR技术要素进行了分析,并介绍了其最新进展。

多重PCR法区分枣园两种菱纹叶蝉及检测其体内枣疯病植原体

【目的】目前发现,北京枣园中的凹缘菱纹叶蝉Hishimonus sellatus(Uhler)和片突菱纹叶蝉Hishimonus lamellatus Cai混同发生。已知凹缘菱纹叶蝉可以传播枣疯病,而片突菱纹叶蝉是否携带枣疯病植原体尚待证明。正确鉴别区分枣园中菱纹叶蝉的种类并测定其体内感染枣疯病植原体情况有助于阐明田间枣疯病的流行规律,从而提出有效的预防枣疯病及其媒介昆虫措施显得十分重要。传统形态学鉴定两种菱纹叶蝉种类的方法局限于雄性成虫外生殖器,本研究目的在于建立一种快速的分子生物学方法,在区分枣园中两种枣菱纹叶蝉的同时,可检测虫体内的枣疯病植原体。【方法】以凹缘菱纹叶蝉和片突菱纹叶蝉的COI基因以及枣疯病植原体的16S r DNA为扩增目标,分别设计引物,建立一种包含3对引物的多重PCR体系。测试该多重PCR体系对叶蝉总DNA的灵敏度、准确性,以及当两种叶蝉DNA同时存在时的辨别能力和对枣疯病植原体16S r DNA的灵敏度。【结果】该多重PCR可以准确区分凹缘菱纹叶蝉和片突菱纹叶蝉,并对虫体内枣疯病植原体实现检测,其对昆虫总DNA的灵敏度达到0.012 ng,对枣疯病植原体16S r DNA模板的灵敏度达到900拷贝。【结论】该方法极大方便了对枣菱纹叶蝉的田间种群发生动态及虫体中枣疯病植原体感染的监测。

多重PCR检测冷却肉中的3种致病菌

分别针对沙门氏菌(Salmonella choleraesuissubs.choleraesuis,S)编码DNA结合蛋白的基因hns、大肠O157:H7(Escherichia coliO157:H7,E)编码外膜蛋白紧密素的基因eaeA和单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,L)溶血素O基因Hly设计3对引物,建立同步检测肉制品中3中致病菌的多重PCR方法。通过对多重PCR特异性和灵敏度进行分析,对多重PCR反应条件进行优化,结果表明,此方法简便、快速,可使混菌检测灵敏度达到103cfu/mL。

复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌方法的建立及初步应用

在已经建立的胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌的单项PCR诊断方法的基础上,通过对扩增条件和引物的筛选,成功地建立了APP、HPS复合PCR诊断方法,利用一次PCR反应,即可同时扩增APP的442 bp,和HPS的1 090 bp的特异性片段,并应用于临床检测。该方法的建立对临床上进行这2种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。

风力发电中全光纤风速传感器及制作工艺研究

为了实现风力发电场多点、远程风速检测,便于测量和风场风速物联网的构建,采用风杯来调制光纤布喇格光栅的方式,设计了一种全光纤风速传感器,通过光纤光栅波长的变化频率可以求出对应风速值,并对传感器设计结构进行了说明,介绍了传感器的制作封装工艺以及相关的设备和实验数据。结果表明,传感器运行稳定可靠,测量误差不超过0.16m/s,适合于风电场的多点大容量风速监测,对风力发电实际应用具有重大意义。

复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌方法的建立及初步应用

根据胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)apxIVA毒素基因序列和16SrRNA序列分别设计了一对特异性引物P1P4和一对通用引物S7S10,建立了检测App全部15个血清型的复合PCR方法。对App的15个血清型国际参考株和国内的11个App菌株进行检测,都能得到363bp和692bp的两个扩增片段。而放线杆菌等13株参考菌株只能得到692bp的扩增片段。该方法能将15个血清型的App菌株鉴定到种。检测的灵敏度达9pgDNA1300CFU。用建立的方法检测临床分离的302株可疑菌株,阳性4株,与其它鉴定方法相符。结果表明复合PCR可用于App菌株的鉴定。

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株VR2332保守序列与近年PRRSV自然变异株序列分析研究,设计合成了2对特异引物,分别扩增出225、427bp两条特异型基因片段,通过优化RT-PCR条件,建立了可同时检测PRRSV标准株和NSP2变异株的二重PCR诊断方法。应用该方法分别对广西不同地区的16份病、死猪的血液、肺等组织进行检测,结果15份PRRSV阳性,其中1份为标准株,14份为变异株。试验结果表明,PRRSV标准株与变异株二重PCR诊断方法具有高度特异性、敏感性和实用性,可用于临床诊断,为目前流行的猪高热病病原研究及广西PRRS的防制提供了一定科学依据。

基于多波束GEO卫星的宽带移动通信系统

提出基于多波束天线静止地球轨道卫星的宽带移动通信系统方案,与常规结构同类系统用户相比,其容量更大、业务质量更好。采用时隙同步码分多址辅助的多频时分多址接入、程控交换与因特网协议交换结合的交换、时分复用和准正交时分复用下行链路传输体制,可显著增加用户量,简化星上设备,改善互联网应用业务质量。用户接入信道数为173 880,最高用户下载速率达155 Mbps。仿真结果表明,140个波束、每波束26个16幅度相移键控信号的用户下行链路传输比频分复用传输的链路性能改善11.65dB,使得宽带用户"动中通"天线等效口径缩小至原来的1/4,成本大幅降低。

多重PCR方法检测大肠杆菌O157∶H7的初步研究

目的研究一种快速、特异的检测大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法以大肠杆菌O157∶H7的O157抗原基因(rfbE基因)、鞭毛H7抗原基因(fliC基因)、粘附素基因(eaeA基因)和志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ(SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因)为扩增对象,设计能导至目的片段大小不同的5对引物,通过优化条件,建立了可用于粪便检测的大肠杆菌5重PCR。结果在同一扩增体系中,检测了5株不同来源的大肠杆菌O157∶H7及27株非大肠杆菌O157∶H7细菌。结果表明,该方法能从2株大肠杆菌O157∶H7中扩增出rfbEf、liC、eaeA、SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因,它们的大小分别为582 bp、802 bp、487 bp3、68 bp和177 bp。而另外3株大肠杆菌O157∶H7也能扩增出除eaeA、SLT-Ⅱ基因外的其它3个基因片段。表明该方法可用于检测大肠杆菌O157∶H7,还可检测细菌是否含有毒素基因。在检测27株非大肠杆菌O157∶H7,除O149出现SLT-II扩增产物和O1∶H7出现fliC基因扩增产物外,其它非大肠杆菌O157∶H7的扩增结果均为阴性,表明该方法有较高的特异性。当粪便样品经增菌培养12 h,用该5重PCR体系能检测出最初接种量为5cfu/g粪便的样品。结论本5重PCR方法具有较高的特异性和敏感性,可迅速、有效地将大肠杆菌O157∶H7与其它非大肠杆菌O157∶H7相区别,同时还能检测O157∶H7中的毒力因子。因此,通过进一步研究,本方法有望应用于临床大肠杆菌O157∶H7感染的辅助诊断。

4种感染性腹泻病原菌免疫磁珠-多重PCR快速检测体系的建立

目的基于免疫磁珠分离及多重PCR技术建立出血性大肠埃希菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌的快速检测体系。方法根据出血性大肠埃希菌uidA、福氏志贺菌ipaH、空肠弯曲菌hipo及副溶血弧菌tlh的基因序列设计特异性引物,优化免疫磁珠分离过程及多重PCR扩增中的各个环节,建立上述4种病原菌同步快速扩增体系,并鉴定该体系特异性、敏感性。结果发现Mg2+浓度对该体系影响最大,在Mg2+浓度为4 mmol/L时扩增效率最高;该体系对4种病原菌的敏感性分别为:出血性大肠埃希菌2.7×10 cfu/ml、福氏志贺菌6.4×10 cfu/ml、空肠弯曲菌7.6×10 cfu/ml、副溶血弧菌3.6×10 cfu/ml。结论建立了出血性大肠埃希菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌的免疫磁珠-多重PCR快速检测体系,该体系特异性及敏感性高,检测过程简单,结果稳定,可应用于临床诊断及食品卫生监管中致病菌的快速检测。

复合PCR技术在ABO血型基因分型中的应用

目的探讨复合PCR技术在ABO血型基因分型方法中的应用。方法通过实验研究摸索复合PCR的条件和规律,采用单管同时扩增出ABO基因的第6、7外显子后,使用限制性内切酶对复合PCR产物进行酶切消化。结果通过最佳实验反应条件的获得,可建立ABO血型基因分型方法。结论复合PCR技术在建立ABO血型基因分型方法的应用中,具有其特殊性。

四种转基因玉米多重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测4种转化体的多重PCR方法,选择进口转基因玉米最为常见的4种转化体Bt11、Bt176、MON810和MON863,利用国家标准中现行有效的转化体检测引物作为多重PCR检测体系引物,对多重PCR退火温度和引物浓度等进行优化。结果表明,多重PCR方法的适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol/L)配比为0.4∶0.4∶0.4∶0.4,通过建立快速、准确、高效的多重PCR为进口转基因玉米检测提供有价值的参考。

应用复合RT-PCR同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒

将烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus)和番茄环斑病毒(Tom ato ringspot virus)的CP基因及RNA2基因序列引物,合成特异性RT-PCR检测引物,对烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应,结果显示,感染了烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的植物组织的PCR产物均出现600 bp和470 bp特异性扩增条带,而其他病毒均未出现扩增条带,证明这两对引物具有烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒和番茄环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果显示,此体系最低可检出烟草环斑病毒和番茄环斑病毒提取的RNA模板浓度为234 pg/μl和264 pg/μl。表明,复合RT-PCR是一种可同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的快速检测方法。

实现数字电视机顶盒选单广告功能的研究

提供了一种数字电视机顶盒选单广告功能的实现方式,给出了重要问题的解决办法。通过数字电视机顶盒选单广告功能的实现,可使广电网络公司以少量的投入获得更大的经济效益。

麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒多重RT-PCR法的建立

目的建立针对麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的多重RT-PCR检测方法。方法分别根据麻疹病毒M基因、风疹病毒E基因和腮腺炎病毒M基因设计3对引物,建立同时检测3种病毒的多重RT-PCR,并评估其灵敏度和特异性。结果建立的多重RT-PCR可同时或分别扩增的3种病毒的111 bp、352 bp和274 bp基因片段,其灵敏度分别达到2.1、2.1、2.2lgCCID 50/mL;而与脊髓灰质炎病毒和乙型脑炎病毒无交叉反应。结论建立的多重RT-PCR可用于麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的快速检测。

多重PCR技术在橡胶树转基因分子鉴定中的应用

为了同时检测橡胶树转基因胚状体和叶片中含有的多个目标基因序列,并排除扩增结果的假阴性,利用正交试验首次建立了橡胶树管家基因(HbActin)、目标基因新霉素磷酸转移酶II(NptII)基因和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的多重PCR检测体系。利用2种酶(PCR Mix酶和Taq酶)对18个转基因胚状体和叶片进行单一引物PCR扩增和多重PCR检测。结果表明:多重PCR检测结果与单一PCR结果完全一致,且多重PCR体系带型清晰,无非特异性扩增,更易读取。多重PCR检测系统具有简单、准确并且高效等特点,只需要进行一个反应就可以检测多个目标基因序列,因而在转基因分子鉴定上具有非常重要的应用价值与潜力。

基于FPGA的OFDM调制器的设计

提出了一种新的流水线FFT设计方法来实现OFDM调制解调:利用旋转因子对称性、简化的复数乘法和旋转因子CSD编码来简化蝶形单元设计,并按照读修改地址写的顺序,利用双口RAM从一级向下一级来传送数据.该方法实现蝶形运算不需要乘法器、不需要ROM来存储旋转因子,需要的RAM单元也比较少.最后用该方法在FPGA上实现8pt基2的DIFFFT处理器,实验证明该方法在硬件资源消耗上有很大的改善.

OFDM系统中利用CAZAC序列的时域时频同步方案

针对目前正交频分复用系统时频同步算法中整数频偏估计大多在频域进行从而导致同步模块实现复杂、同步时间较长的问题,提出了一种时域时频同步方案。该方案用CAZAC序列构造了一个具有前后重复结构的训练序列,并用伪随机序列对其中部分数据进行加权,利用数据的重复性和伪随机序列的相关性来完成定时同步;然后通过计算训练序列中未被加权的数据块之间的相位差来估计小数频偏,估计结果具有很高的精度;通过分析频偏对CAZAC序列时域相关特性的影响,设计了相应的整数频偏判决函数,在时域完成整数频偏估计,估计范围较大,且实现复杂度低。仿真结果表明,无论是在AWGN信道还是在多径衰落信道下,该方案中定时同步都具有极高的准确率,与已有算法相比,频偏估计性能也有明显的改善。

多发性脂囊瘤并发疹性毳毛囊肿1例

患者男,19岁。胸、腹部及前臂出现丘疹和结节5年。皮损组织病理示:表皮正常,真皮见两个囊肿,一个囊肿的囊壁不规则折叠,囊内为嗜伊红无定形物质,附有皮脂腺,另一囊肿内见毳毛横断面及环状排列的角质物,囊壁为复层鳞状上皮。诊断:多发性脂囊瘤并发疹性毳毛囊肿。

多重PCR对禽分枝杆菌亚种鉴定的初步应用

为建立禽分枝杆菌多重PCR鉴定方法,根据国外报道的诊断方法设计4对特异性引物,选用我国禽结核参考菌株(CVCC 68201)基因组DNA为模板,优化了退火温度,测定了DNA最小检测量,并进行了特异性检验。采用优化好的多重PCR体系,对国家兽医微生物菌种保藏中心保存的禽分枝杆菌标准菌株进行检测和分类。实验结果表明,禽结核参考菌株(CVCC 68201)能很好的扩增出577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dna J基因片段)三条目的条带,基因组DNA的最小检测量为0.38 ng/μL,目的条带在退火温度50℃~62℃之间均能得到有效扩增。对23株禽分枝杆菌菌株检测,并设立牛分枝杆菌作为阴性对照,最终将禽分枝杆菌菌株分为三大类:禽亚种/森林土壤亚种、副结核亚种、人猪亚种,与国家兽医微生物菌种保藏中心的分类结果相比不仅一致且更加详尽而有临床意义。因此,基于分子生物学方法建立的多重PCR方法可以对禽分枝杆菌亚型进行快速鉴定并对禽结核病的诊断提供参考。