迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统基因的克隆及多重PCR检测方法的建立

采用PCR法扩增大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tardaL-49231菌株Ⅲ型分泌系统(TTSS)的装置蛋白(esaC)、效应蛋白(eseB、eseC、eseD)和调节蛋白(esrA、esrB)6种基因,并将其克隆到载体PMD19-T中分别进行测序;通过优化反应条件,建立一次检出效应蛋白eseB、eseC和eseD 3种基因片段的多重PCR方法;采用所建立的多重PCR方法检测迟钝爱德华氏菌不同菌株(L-49231、GhAn080310、GhAn080313和GhAn080314)、沙门氏菌Salmonella enterica、大肠杆菌Escherichia coli和肠杆菌Enterobacter中效应蛋白基因的存在情况。结果表明:L-49231菌株中存在esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和esrB 6种基因片段,大小分别为837、184、934、445、464、458 bp,与GenBank中迟钝爱德华氏菌PPD130/91菌株的这6种基因的同源性分别为99%、97%、99%、99%、99%、98%;通过优化反应条件,在退火温度为54℃,基因eseB、eseC和eseD引物浓度(μmol/L)组合比为5∶10∶2,Mg2+浓度为1.5 mmol/L时,能够得到清晰、稳定且均一的多重PCR产物,并与目的条带分子量一致;采用所建立的多重PCR方法进行检测,迟钝爱德华氏菌L-49231菌株中存在eseB、eseC和eseD 3种基因片段,迟钝爱德华氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314菌株中存在eseB和eseC基因片段,但未检出eseD基因片段;沙门氏菌、大肠杆菌和肠杆菌中均未检出eseB、eseC和eseD基因。表明所建立的多重PCR方法对迟钝爱德华氏菌具有较好的特异性,可检出具有Ⅲ型分泌系统效应蛋白的菌株。