Development of Multi-PCR for Differentiation of Vaccine Strain and Field Isolate of Porcine Pseudorabies Virus

Three pairs of primer were designed for amplification of porcine pseudorabies virus （PRV） gB, gE, and TK gene by multiplex PCR （multi-PCR） in order to differentiate vaccine strains from field isolates. Three specific bands were obtained respectively at the expected size, 427 bp （gB gene）, 298 bp （gEgene）, and 208 bp （TKgene）, Then four different gene-deleted vaccines of PRV were detected by multi-PCR. One ex- pected specific band was observed in one of samples, while two bands in the others. As shown by the detection results, the multi-PCR has high sensitivity and specificity and should be applied in pathogen diagnosis and epidemiological investigation in the future.

多重核酸检测系统同时检测22种呼吸道病原体的应用效果研究

目的采用多重核酸检测系统同时检测22种呼吸道病原体,了解韶关市儿童急性呼吸道感染(ARI)常见病毒病原体的构成情况及流行特征。方法选择粤北人民医院作为监测点,按要求及时采集呼吸道患者标本886份送至韶关市疾病预防控制中心微生物检验室,采用多重核酸检测系统定性检测22种呼吸道病原体,包括新型冠状病毒、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、人类偏肺病毒、人鼻病毒/肠道病毒、甲型流感病毒、甲型流感病毒H1、甲型流感病毒H1-2009、甲型流感病毒H3、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、呼吸道合胞病毒、副百日咳杆菌、百日咳杆菌、肺炎衣原体、肺炎支原体。同时采用传统的荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对上述样品进行同样项目的检测,对比检测结果准确性。结果886份标本中检出阳性425份,核酸检出率为47.97%(425/886),FluA检出率最高,为15.46%,其他病毒的检出率从高到低依次为鼻病毒(HRV)9.48%、人副流感病毒(HPIV)6.55%、乙型流感病毒(FluB)5.87%、RSV 4.29%、腺病毒(ADV)2.82%、MPV 2.03%、HCoV 1.02%、HBoV 0.45%。FluA、HRV、HPIV、FluB、RSV和MPV的分布有一定季节特征,而ADV、HCoV和HBoV季节特征均不明显。FluA、HPIV、RSV在1~<3岁组检出率均较高;HRV、MPV、HCoV在1~<3岁组检出率均较高;FluB在≥6岁组检出率较高。荧光定量PCR检测结果与上述检测结果一致。结论韶关市儿童急性呼吸道感染(ARI)的病毒病原种类较多,位于前3位依次是FluA、HRV和HPIV。部分病原感染有季节流行特征,与年龄也存在一定相关性。

荷斯坦育成母牛结核性脑膜脑炎的病理学观察和病原鉴定

为了探究1例荷斯坦育成母牛结核性脑膜脑炎病例的病理变化并鉴定病原,本试验对1头24月龄病死荷斯坦育成母牛进行临床症状观察、尸体剖检和组织病理学观察,随后进行细菌分离培养,并通过抗酸染色和多位点PCR方法进行菌种鉴定。结果显示:发病牛临床表现共济失调、转圈、四肢及全身肌肉抽搐、眼球球结膜外突和角弓反张,病程数月;尸检可见脑底部表面、脑室内表面、肺脏、肾脏及后纵膈淋巴结表面和切面散在或密布大小不等的粟粒状黄白色结节;组织病理学观察结果显示,大脑、小脑、脑干、侧脑室和第四脑室的蛛网膜下腔内和局部脑实质内,以及肺脏、肾脏和后纵膈淋巴结内均有大小不等的典型结核性肉芽肿;将分离和纯培养的结核杆菌菌落制备涂片进行抗酸染色,可观察到散在或成簇红染的细长的分枝状小杆菌;分离菌株经结核分枝杆菌复合群(MtbC)的特异性多位点PCR鉴定为牛分枝杆菌。本试验在国内首次描述了由牛分枝杆菌引起荷斯坦育成母牛结核性脑膜脑炎病例的病理变化,为牛结核病的诊断和研究提供参考。

轻量化的印刷电路板缺陷检测网络Multi-CR YOLO

针对印刷电路板表面缺陷目标小,检测精度低问题,设计了印刷电路板表面缺陷检测网络Multi-CR YOLO,满足实时检测速度的前提下,有效提高了检测精度。首先,由3个Multi-CR块组成的主干特征提取网络Multi-CR backbone对印刷电路板小目标缺陷进行特征提取。其次,SDDT-FPN特征融合模块使层级高的特征层向层级低的特征层进行特征融合,同时为小目标预测头YOLO Head-P3所在特征融合层加强特征融合,进一步增强低层特征层的表达能力。PCR模块加强主干特征提取网络与SDDT-FPN特征融合模块不同尺度的特征层的特征融合机制,且防止模块之间进行特征融合时信息丢失。C_(5)ECA模块负责自适应调节特征权重和自适应注意小目标缺陷信息的要求,进一步提高了特征融合模块的自适应特征提取能力。最后,3个YOLO-Head负责针对不同尺度的小目标缺陷进行预测。实验表明,Multi-CR YOLO网络模型检测mAP达到98.55%,模型大小为8.90 MB,达到轻量化要求,检测速度达到了95.85 fps,满足小目标缺陷实时检测的应用需求。

一株发酵乳糖不产气大肠埃希氏菌的分离与鉴定

为了准确鉴定1株分离自餐饮具的大肠埃希氏菌非典型菌株(发酵乳糖不产气),通过传统分离培养、常规生化试验、微生物鉴定、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、多重聚合酶链式反应(multi-PCR)的方法对该菌株进行联合鉴定。结果表明:该菌株乳糖发酵试验及伊红美蓝琼脂(EMB)平板上的菌落形态均有别于典型大肠埃希氏菌,但微生物鉴定、MALDI-TOF MS、多重PCR鉴定结果与标准菌株一致,均显示为大肠埃希氏菌。这说明常规方法检验非典型大肠埃希氏菌有误判风险,建议检验者遇初发酵培养物变浑浊时转接EMB琼脂平板,并辅以微生物自动鉴定仪器或分子生物学方法对可疑菌落进行鉴定,以确保检验结果的准确性。

散养土鸡J亚群禽白血病病毒和网状内皮组织增生症病毒混合感染的诊断

湖北某农户散养的土鸡,鸡群精神委靡、整体消瘦,对病鸡进行剖检,发现部分鸡体表和脏器可见大小不等的肿瘤结节。取病变典型的组织制作病理切片,镜检可看到髓样细胞瘤和网状细胞。提取病鸡组织DNA,用两组Multi-PCR分别检测A、B、J亚群禽白血病病毒(ALV-A、ALV-B、ALV-J)和马立克病病毒(MDV)、禽网状内皮增生症病毒(REV)。结果仅扩增出与ALV-J和REV相应的条带,表明该鸡群为ALV-J和REV混合感染。

3-PCR并联减振装置的动力学分析

为实现多维减振,本文采用3-PCR并联机构作为多维减振平台。并联机构动力学模型是多自由度、多参数耦合且高度非线性的复杂系统,首先,利用Lagrange法建立3-PCR并联减振装置的动力学方程;然后,利用Solidworks构建减振装置三维模型,并将模型导入ADAMS中建立虚拟样机模型;最后,利用ADAMS仿真软件对三维减振装置基体进行运动学和动力学仿真分析,得到驱动杆位移、速度、加速度曲线图和各连杆驱动平衡力图。仿真结果表明:3-PCR并联减振装置具有较好的运动稳定性,加速度在变化时也没有存在较大的冲击,便于控制。

多重PCR筛选临床细菌耐药整合子基因

目的:建立多重PCR方法并对临床菌株进行扩增及整合子分类。方法:采用多重PCR对21株来自临床的耐药菌株进行了第一、二和三类整合酶基因(intI)筛选。结果:16株携带第一类整合酶基因;1株携带第一和第二类整合酶基因;2株含第二类整合酶基因;1株含第三类整合酶基因;1株不含第一、二和三类整合酶基因。结论:筛选细菌耐药整合子基因分类的多重PCR方法简便可靠;整合子广泛存在于临床耐药细菌中。

犬瘟热、犬冠状病毒联合RT-PCR检测方法的建立及应用

用CDV、CCV特异性引物对同一样品中CDV和CCVRNA模板进行联合RT PCR扩增 ,并对扩增条件进行了优化。结果同时得到了两条大小与试验设计完全相符的特异性扩增带 ,且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒、轮状病毒的核酸。敏感性试验表明 ,该联合PCR能检测出 10 - 4倍稀释的CDV模板 (10 6 6 TCID50 / 0 1mL)和 10 - 3倍稀释的CCV模板 (10 5 9TCID50 /0 1mL)。通过对 7份临床发病犬病料的检测 ,其阳性检出率高于电镜负染检查。初步应用表明 ,此法具有高度敏感、特异、准确、快速等特点 ,适用于兽医临床对CDV。

分子标记辅助培育水稻抗白叶枯病和稻瘟病三基因聚合系

水稻的白叶枯病和稻瘟病是水稻的两大主要病害，通过分子标记辅助选择与传统的杂交、自交相结合的方法，将抗稻瘟病的Pi9（t）基因和抗白叶枯病的Xa21及Xa23基因聚合到同一株系中，经多代大田或／和温室接菌鉴定、室内标记选择和田间农艺性状的筛选，获得了4个三基因聚合且农艺性状优良的株系L17-L20。用不同国家和地区的20个稻瘟病小种、中国流行的7个白叶枯病菌系c1-c7以及安徽省流行的白叶枯病菌系进行大田或，和温室抗病性鉴定，结果显示，株系L17-L20对20个稻瘟病小种均表现出抗性，抗性水平与Pi9（t）基因的供体亲本75-1-127相当，抗谱相同；对白叶枯病的抗性和抗谱与Xa23基因相似，不论在苗期还是在成株期均抗白叶枯病。与Xa21、Xa23基因的供体亲本M12和CBB23相比，成株期的抗性水平有所增强。利用多重PCR技术，在同一PCR反应中可同时选择Pig（t）和Xa21基因，提高了PCR选择效率。

嗜麦芽寡养单胞菌中Ⅱ类整合酶基因的发现及意义

目的检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子在嗜麦芽寡养单胞菌临床分离株中存在情况,分析整合子对细菌耐药性的影响。方法应用多重PCR方法筛选嗜麦芽寡养单胞菌整合酶基因。结果Ⅰ类整合子的检出率为13.4%,其中3株菌同时带有Ⅰ类和Ⅱ类整合子,Ⅱ类整合子的阳性率为3.6%,未检测到Ⅲ类整合子。结论嗜麦芽寡养单胞菌中主要分布Ⅰ类整合子,首次发现嗜麦芽寡养单胞菌中含有Ⅱ类整合子,Ⅱ类整合酶基因可能增加细菌多药耐药的发生。

多重PCR技术鉴定番茄Ty-1和Mi基因

利用同一PCR反应体系,对分别与番茄(Lycopersion esculentum)抗黄化曲叶病毒(Tomato YellowLeaf Curl virus)病的Ty-1基因和番茄抗根结线虫(root-knot nematode)的Mi基因紧密连锁的SCAR标记进行同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合。与Ty-1基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感材料均产生398bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了303bp和95bp以及398bp、303bp和95bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点。与Mi基因紧密连锁的SCAR2标记也为共显性标记,抗感材料均产生750bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了570bp和180bp以及750bp、570bp和180bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点。酶切结果仍为750bp的产物。经反复验证,结果准确可靠,可以用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。

用多重PCR快速检测登革病毒并分型

目的 建立一种多重聚合酶链反应 (PCR)方法 ,对不同型别登革病毒进行快速检测及分型。方法 采用 4种型别登革病毒通用的外侧引物进行逆转录PCR(RT PCR)反应 ,继用 4对 (5种 )型特异引物在单管内进行巢式PCR ,依据扩增产物的片段大小进行分型。结果 采用多重PCR ,扩增出 4 82、119、2 90及 392bp的特异片段 ,分别代表登革病毒 1～ 4型。结论 该方法快速、敏感、特异 ,有一定的推广应用价值。

细菌耐药整合子intI分类的多重PCR方法的建立及应用

目的建立快速筛选细菌耐药整合子的分类方法,并对21株来自临床的菌株进行整合子筛选和分类。方法根据G enB ank/EM BL内的第一、第二和第三类的整合酶序列,通过软件C lustalW的多重比对分析设计出各类整合子的特异性引物,用对照菌株建立多重PCR方法并对21株临床菌株进行PCR扩增,通过其PCR扩增产物片段大小的不同进行整合子分类。结果对照菌株实验结果显示,21株临床分离菌株中,15株在565bp处有扩增片段,即为含有第一类整合酶基因;4株在403bp处有扩增片段,即含有第二类整合酶基因;1株在565bp和403bp处均有扩增片段,提示其同时含有第一、二类整合酶基因;1株没有得到任何扩增片段,即不含有这三类整合酶基因;在被测菌株中未发现第三类整合酶基因的阳性菌株。结论本文报道的筛选细菌耐药整合酶基因分类的多重PCR方法效果良好,具有可行性,为更加全面细致研究整合子类型以及整合子介导的细菌耐药机制提供了一种简单易行、快捷有效的方法。

布鲁菌种属鉴定多重PCR方法的建立及初步应用

用BCSP31作为布鲁菌属特异性基因,以IS711基因拷贝数差异作为布鲁菌种间特异性标志,建立了布鲁菌种属特异性的多重PCR鉴定方法。用建立的多重PCR方法对11株(牛种A19,A544,A387;羊种M111,M28,M16;犬种RM6/66;绵羊种63/290;猪种S2,rS2,S1330)不同种来源的布鲁菌菌体和基因组进行鉴定,结果牛种菌能扩增大小分别为494,223,178bp3条带,羊种菌能扩增出大小分别为733,223,178bp3条带,犬种菌能扩增出大小分别为223,178bp2条带,绵羊种菌能扩增出大小分别为976,223,178bp3条带,猪种菌能扩增出大小分别为285,223,178bp3条带,均与预期一致;而作为对照的大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、流产沙门菌和都柏林沙门菌,均未扩增出任何条带。结果表明,本研究所建立的方法具有良好的特异性,能够区分不同种源的布鲁菌,可用于布鲁菌种属的快速鉴定和流行病学调查。

多重PCR方法快速鉴别猪伪狂犬疫苗毒和野毒

根据Genbank中PRV的gB、gE、TK基因序列设计并合成引物,对样品中PRVDNA进行多重PCR扩增及反应条件优化,得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为427 bp(gB)、298 bp(gE)和208 bp(TK)。用这3对引物对四种伪狂犬疫苗样品DNA进行多次多重PCR扩增,其中1种疫苗得到与设计相符的1条特异性条带,其余为2条。该结果表明,此检测方法敏感度较高,适用于科学研究、临床诊断以及流行病学调查,对根除伪狂犬病具有重要意义。

假单胞菌属细菌中整合子的分布及其可转移耐药性研究

目的研究临床分离假单胞菌属细菌中Ⅰ、Ⅱ类整合子分布及其可转移耐药情况。方法将Ⅰ、Ⅱ类整合酶基因通用引物置于同一反应体系,对假单胞菌属细菌以多重PCR法检测其整合子的分布,并对整合酶基因阳性菌进行接合转移,最后对接合转移成功菌以平板稀释法测其临床株和接合子MIC值。结果Ⅰ类和Ⅱ类整合酶基因在临床分离假单胞菌属细菌中检出率分别为38.1%和2.2%,含整合酶基因的接合子在转移成功接合子中所占比率为13.6%。结论Ⅰ类整合子在假单胞菌感染的临床分离株中所占比例已相当高,但水平传播率还较低。

犬腺病毒、犬细小病毒联合PCR方法的建立与应用

根据GenBank报道的犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)序列,设计两对联合PCR引物,其中一对为CAV-1和CAV-2通用引物,另一对为CPV引物。在建立单项PCR基础上,通过优化Mg2+离子浓度和循环参数等反应条件建立联合PCR,确定联合PCR条件为:96℃180s,96℃30s,56℃30s,72℃80s,30个循环。联合PCR结果显示:CAV-1扩增片段大小为497bp,CAV-2为1019bp,CPV为719bp;细胞和其它相关病毒对照均无扩增带。上述PCR产物经用限制性内切酶酶切和克隆测序,结果均与相应病毒的应有条带和序列相同。敏感性比较试验结果表明,联合PCR比用细胞培养分离病毒敏感。将联合PCR应用于15份CAV和CPV细胞培养物,5份CAV-1、1份CAV-2和3份CPV人工感染犬病料以及30份临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法的结果进行比较,结果显示,联合PCR的检出率和病毒分离结果一致,高于电镜负染和HA/HI试验。以上结果说明:CAV-1/CAV-2和CPV联合PCR不仅具有很好的特异性和敏感性,而且可以在短时间内(2 5h～3h)同时鉴定出上述三种病毒,因此具有良好的实验室诊断和临床应用价值。

应用多重PCR法分析西藏察隅疟疾流行区按蚊吸血习性

目的用多重PCR法分析西藏疟疾流行区察隅县常见按蚊的吸血习性,为下一步研究传疟媒介提供参考。方法2011年7~8月选择察隅县不同生态环境的3个自然村（日玛村、塔玛村和京都村）,每个村在人房和畜舍选择8个点,采用诱蚊灯全通宵（20∶00至次日08∶00）诱捕法捕捉按蚊,次日清晨收集诱捕的蚊虫,经形态学鉴定蚊种,分析按蚊组成。收集饱血按蚊,分别提取单只蚊胃血的DNA,采用基于不同动物mtDNA-cytb序列差异的多重PCR法鉴定各蚊胃血源,计算人血指数,分析按蚊的吸血习性。结果共捕获按蚊1 442只,经形态学鉴定,多斑按蚊种团占99.6%（1 436/1 442）,带足按蚊和腹簇按蚊占0.4%（6/1442）。多斑按蚊种团中,伪威氏按蚊占85.5%（1228/1436）,威氏按蚊占14.5%（208/1 436）。用多重PCR检测202只多斑按蚊种团（伪威氏按蚊188只和威氏按蚊14只）的饱血蚊胃血,结果显示,伪威氏按蚊兼吸牛/猪血和人血,人血指数为0.35,威氏按蚊吸食猪血和人血,人血指数为0.29。结论西藏察隅县2种常见按蚊（伪威氏按蚊和威氏按蚊）均兼吸人畜血,伪威氏按蚊的人血指数较高。

荧光定量PCR仪多通道光学参数校准与结果分析

近年来,多重荧光PCR法广泛应用于肿瘤检测、动植物检疫、基因分型和物种鉴定等领域,但荧光定量PCR仪多荧光通道及免干扰设计会直接影响多重PCR检测结果。本文结合多重荧光PCR法的应用和荧光定量PCR仪多通道荧光检测能力设计,提出一种荧光定量PCR仪多通道光学参数校准方法,并通过实验,对荧光定量PCR仪的5个通道同时进行光学校准。实验证明:该方法具有可行性。