泡沫型干扰幕及其多波段干扰特性研究

现有多波段干扰技术普遍存在作用时间太短、干扰波段不够宽等问题,为此研究了新型的泡沫型干扰幕技术。介绍了它的多波段干扰原理、原料配方和特定的反应过程,研制了专用的施放装置并给出了它的设计要领。对红外成像系统、毫米波雷达、厘米波雷达和可见光的干扰实验结果表明:当它的气泡平均直径约为0.5 mm时,其高效干扰层厚度只是厘米量级,高效干扰时间则在0.5 h以上,并且它使用后留下的残留物对环境无污染。

注水井层间无干扰测试技术探讨

地层压力是油田开发过程中的重要开发指标之一,它反映了油田不同开发阶段的生产能力,是确定油田开发调整措施的重要依据。随着油田开发的不断深入,开发调整对象逐渐转为差油层和表外储层,层间差异逐渐增大,给注水井分层压力、分层注水量的测量带来了很大难度。注水井层间无干扰测试技术是集双压力探头压力计、自缩式测试密封段、径向磁感应流量计为一体的桥式偏心分层压力测试新技术。该技术可以使注入井在层间无干扰的情况下实现准确监测分层压力和分层注水量,确定油管内压力与温度的变化,判断油层吸水能力,对搞好油田开发调整具有重要意义。

超声靶向微泡破裂法介导RNA干扰沉默survivin基因对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

目的:通过超声靶向微泡破裂(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)法介导基因转染,观察RNA干扰对宫颈癌HeLa细胞survivin基因的沉默效应和诱导细胞凋亡的作用。方法:构建靶向survivin基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,将其和微泡共同处理后加入HeLa细胞并予以超声辐照,以空白细胞、单纯质粒、单纯超声辐照、质粒+超声辐照和质粒+Lipofectamine转染作为对照;采用荧光显微镜和FCM法评估基因转染效率,同时对超声辐照参数进行优化;应用FCM法和Hoechst染色及DNA ladder分析法检测细胞凋亡,应用RT-PCR检测survivin mRNA水平的变化。结果:经酶切鉴定及测序分析证实重组质粒构建成功。HeLa细胞采用UTMD处理后,基因转染率显著增加(P<0.01),并在超声强度为1.0W/cm2、辐照3min的条件下最为显著(P<0.01)。PT-PCR检测结果显示,质粒与微泡共同作用加超声辐照组的survivin mRNA抑制率为(83.33±2.73)%,均显著高于各对照组(P<0.01);FCM法检测结果显示,该组细胞的凋亡率同样显著高于各对照组(P<0.01);Hoechst染色及DNA ladder检测结果显示,只有经脂质体或UTMD转染处理后的细胞中可检测到明显的细胞凋亡形态及凋亡梯带,其余各组均未检测到明显凋亡。结论:UTMD可有效增强表达质粒的转染效率,是一种新的、有应用前景的非病毒基因转移体系。UTMD介导RNA干扰沉默survivin基因可诱导明显的细胞凋亡,为肿瘤基因治疗及研究提供了新的方法。

RNA干扰技术抑制人肝癌细胞POLD1基因表达的研究

目的应用RNA干扰技术抑制人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因的表达,探索该技术干预肝癌的可行性。方法制备4个针对人POLD1基因的shRNA表达质粒,转染SMMC-7721细胞48 h后,荧光定量PCR法检测POLD1基因的表达,CCK-8检测细胞生长情况。结果测序鉴定证实4个shRNA表达质粒构建成功,将其转染SMMC-7721细胞后,NEO-POLD1-1和NEO-POLD1-4表达质粒抑制效果明显,使SMMC-7721细胞的增殖受到抑制,并且使POLD1基因表达在mRNA水平抑制,NEO-POLD1-1相对表达量为(0.1425±0.0205),NEO-POLD1-4相对表达量为(0.209±0.009)。结论针对POLD1基因设计的shRNA在体外有效地抑制了POLD1基因mRNA的表达和肝癌细胞的增殖,且实现RNA干扰具有序列选择性。

SmacsiRNA慢病毒载体的构建及其对Smac基因沉默效果的鉴定

背景研究证实半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂（Smac）蛋白是肿瘤细胞的促凋亡蛋白，我们先前的研究表明，Smac蛋白在白内障患者LECs中表达量明显高于正常人，因此推测沉默LECs中Smac的表达可抑制LECs的过度凋亡，但如何成功将SmacsiRNA转染进入LECs是研究的关键。目的构建人SmacsiRNA慢病毒载体并对人LECs进行感染，研究慢病毒载体构建方法及其在人晶状体上皮细胞HLE—B3中的干扰效率，利用RNA干扰（RNAi）技术建立Smac低表达的HLE—B3株。方法根据我们前期的工作设计并合成针对Smac基因序列的siRNA序列，将合成的双链DNA以T4噬菌体DNA连接酶与GV118慢病毒载体相连接，转化DH5α感受态细胞，采用PCR筛选阳性克隆，经测序鉴定正确后，感染293T细胞，收集上清液并标定病毒滴度。用重组慢病毒感染HLE—B3细胞，荧光显微镜下观察转染后的阳性HLE—B3细胞数并计算病毒感染复数（MOI）。将常规培养的HLE—B3细胞分为阴性对照组、空质粒组和GV118-Smac—siRNA1组，阴性对照组为常规培养的细胞，空质粒组细胞仅转染不含慢病毒载体的siRNA质粒，GV118-Smac·siRNA1组细胞转染GV118-Smac—siRNA1质粒，采用实时荧光定量PCR检测各组细胞中SmacmRNA的相对表达量。结果构建的重组载体GV118-Smac—siRNAl转化DH5c感受态细胞后阳性克隆产物大小为340bp，空载的克隆产物为299bp，与预期结果相符，测序结果显示合成的Smac—siRNA1与预期目的序列一致。构建的GV118-Smac—siRNA1病毒滴度为3．0x10。TU／m1。感染HLE．B3细胞后荧光显微镜下可见MOI为100时，细胞毒性低且感染效率高，约为82％。阴性对照组、空载质粒组和GV118-Smac—siRNA1质粒组细胞中SmacmRNA相对表达量分别为（101．290±8．349）％、（92．330±6．320）％和（32．540±4．221）％，3个组间总体比较差异有统计学意义（F=32．871，P〈0．01），其中GV118-Smac—siRNA1质粒组细胞中SmacmRNA相对表达量较阴性对照组明显下降，差异有统计学意义（P=0．000），而空载质粒组细胞中SmacmRNA相对表达量略低于阴性对照组，但组间差异无统计学意义（P=0．535）。结论本研究中成功构建了siRNA慢病毒载体GV118-Smac—siRNA1，其转染HLE—B3效率高，该siRNA载体能够有效地抑制人LECs中Smac基因的表达。

EntransterTM纳米载体介导大鼠角膜CD25siRNA转染的效果及安全性评估

背景 基因转染是多种眼病基因治疗的有效方法,理想的非病毒载体是研究角膜基因治疗的关键因素,选择高转染率、基因高表达、低毒性的非病毒载体是成功实施基因治疗的前提. 目的 探讨EntransterTM、脂质体非病毒载体对正常SD大鼠角膜转染CD25 siRNA的转染率和安全性,筛选角膜基因转染的最佳载体.方法 应用随机数字表法将80只雄性SPF级成年SD大鼠随机分为EntransterTM-CD25 siRNA 组、脂质体-CD25 siRNA组、单纯CD25 siRNA组和生理盐水组,每组20只,均以右眼作为实验眼.实验眼眼表麻醉后刮除角膜上皮,按照分组不同分别用EntransterTM-CD25 siRNA、脂质体-CD25 siRNA、单纯CD25siRNA和生理盐水各50μl点眼.于点眼后12h、24 h、3d和7d在裂隙灯显微镜下观察大鼠眼表组织反应,检查各组大鼠角膜表面绿色荧光个数.分别于上述时间点处死各组大鼠各4只并获取角膜组织,采用苏木精-伊红染色法行角膜组织病理学检查;采用罗丹明染色行荧光检测,评估各组大鼠角膜基因转染的转染率;采用TUNEL染色法检测实验眼角膜细胞的凋亡情况以评估各种转染载体的安全性;采用免疫荧光技术检测角膜组织中CD11b的表达. 结果 EntransterTM-CD25 siRNA组大鼠角膜表面的荧光染色数量及强度明显高于脂质体-CD25 siRNA组,单纯CD25 siRNA组大鼠角膜荧光染色出现早,但转染后24 h角膜荧光染色消失.角膜组织病理学检查显示,各组大鼠行基因转染后脂质体-CD25 siRNA组大鼠角膜上皮水肿和角膜炎性细胞浸润程度较EntransterTM-CD25 siRNA组、单纯CD25 siRNA组和生理盐水组严重,角膜基质层和内皮层未发现异常,脂质体-CD25 siRNA组大鼠角膜炎性细胞数明显多于EntransterTM-CD25 siRNA组、单纯CD25 siRNA组和生理盐水组,差异均有统计学意义（均P=0.00）.TUNEL检测发现,基因转染后12h和3d,脂质体-CD25siRNA组大鼠角膜细胞凋亡数明显多于EntransterTM-CD25 siRNA组、单纯CD25 siRNA组和生理盐水组,差异均有统计学意义（均P=0.00）.免疫荧光检测显示,CD11b荧光主要分布于角膜上皮层和角膜基质层,随着基因转染后时间的延长,脂质体-CD25 siRNA组大鼠角膜组织中CD11b的表达量逐渐增加,基因转染后24 h时荧光强度达峰,随后逐渐减弱,至转染后第7天仍可见弱荧光.EntransterTM-CD25 siRNA组、单纯CD25siRNA组和生理盐水组大鼠角膜组织中均未发现CD11b的荧光表达. 结论 EntransterTM纳米材料作为载体转染CD25 siRNA于正常SD大鼠角膜具有转染效率高、毒性低、不引起角膜免疫反应的特点,可作为角膜疾病基因治疗的合适载体.

动态浊度法检测C群脑膜炎球菌多糖原液细菌内毒素含量

采用动态浊度法对多批C群脑膜炎球菌多糖原液进行细菌内毒素含量检测,同时设供试品干扰试验,并与凝胶限量法进行对比分析。从而建立了C群脑膜炎球菌多糖原液细菌内毒素定量检测方法和质量控制指标。

基于Erdas的去干扰异常主分量门限化技术在内蒙古查巴奇矿产调查中的应用

"去干扰异常主分量门限化技术",是在矿化蚀变异常提取和应用研究中形成的一套独具特色的方法技术,它使得大面积工程性的提取岩矿蚀变异常信息成为可能.该方法包括3个主要部分:预处理、信息提取和后处理技术,目前已经在PCI系统和ENVI系统上运行成功.经过笔者的反复试验,在Erdas系统中也成功地实现了该技术.将该技术运用到内蒙古查巴奇1:5万矿产调查中,取得了一定的成果,再次证明该方法的可行性。

时序DInSAR技术提取下沉盆地的角量值

文章以大柳塔52304工作面为实验区,利用X波段、高分辨率、短重访周期的TerraSAR-X影像数据,进行时间序列的合成孔径雷达差分干涉测量(DInSAR)处理,获取了工作面采动过程中下沉盆地的形变信息。利用ENVI提取下沉值大于等于10mm的下沉盆地,并用伪彩色显示,叠加工作面图,结合工作面回采的进度表,提取了不同阶段下沉盆地的超前影响角、边界角等参数,对比实地观测参数。实验结果表明,可以利用高分辨率影像的DInSAR技术监测下沉盆地边缘及提取边界角。

慢病毒介导的短发夹RNA敲低PIWIL2基因对肝母细胞瘤细胞生物学行为的影响

目的探讨PIWIL样蛋白2(PIWIL2)基因在肝母细胞瘤(hepatoblastoma,HB)中的表达及慢病毒介导的短发夹RNA敲低PIWIL2基因对HB细胞生物学行为的影响。方法收集2015年7月—2020年12月青岛大学附属医院小儿外科收治的33例HB患儿肿瘤组织及瘤旁正常组织标本,采用免疫组织化学方法检测两种组织中PIWIL2蛋白的表达。采用实时荧光定量PCR方法检测HB细胞HUH6与正常肝细胞LO2中PIWIL2 mRNA的表达。分别以shRNA-PIWIL2慢病毒和阴性对照慢病毒感染HUH6细胞,分为实验组和对照组,采用克隆形成实验、CCK-8实验、Transwell迁移实验检测两组细胞的增殖、迁移能力。结果HB肿瘤组织中PIWIL2蛋白表达水平显著高于瘤旁正常组织(t=7.16,P<0.05)。HB细胞HUH6中PIWIL2 mRNA表达水平显著高于正常肝细胞LO2(t=20.77,P<0.05)。与对照组相比,实验组细胞增殖能力减弱(t=7.62,F=17.68、165.40,P<0.05),细胞迁移能力降低(t=20.05,P<0.05)。结论PIWIL2在HB肿瘤组织及HB细胞HUH6中高表达,敲低PIWIL2能明显抑制HUH6细胞增殖,细胞迁移能力降低。

井中油气化探干扰因素的分析与抑制方法

从现场井中油气化探的细微处入手 ,循序渐进地分析该工作中存在的干扰因素 ,并提出相应的抑制方法。

^(40)Ar/^(39)Ar定年中干扰同位素的质谱校正与低温分离技术

将光谱纯的CaF_2和优级纯的K_2SO_4同样品一起在反应堆中照射,用MM-1200质谱计分别对其熔融释放的气体进行测定,得到干扰同位素校正因子: C_2=(^(36)Ar/^(37)Ar)_(Ca)=(2.40±0.24)×10^(-4) C_4=(^(39)Ar/^(37)Ar)_(Ca)=(8.06±0.10)×10^(-4) C_3=(^(40)Ar/^(39)Ar)_K=(3.18～6.86)×10^(-3) 将被照射过的含Cl样品释放的Ar和Cl混合气体,通入被冷却到-90℃的弯管,Cl被冷冻在弯管内,Ar气体通过弯管再经净化送入质谱计分析。实验证明,该法可有效的将^(36)Cl从样品气体中分离出去,消除了^(36)Cl的干扰。

大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体的构建及其对大鼠RPE细胞中Slit2基因的下调作用

背景年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人致盲的首要原因。目前，AMD的治疗方式在取得显著疗效的同时亦有一定的不足，寻找新的有效治疗靶点是当前的研究热点。目的构建大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体，筛选有效干扰序列以用于大鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞中Slit2基因沉默，为大鼠相关体内实验奠定基础。方法设计2条大鼠Slit2基因siRNA序列，退火形成DNA，连接形成慢病毒干扰载体并进行测序鉴定。采用三质粒共转染293T细胞法收获慢病毒（Lv-rSlit2-siRNA），用药物筛选法测定病毒悬液滴度。将大鼠RPE细胞分为空白对照组、空病毒组、Lv—rSlit2-siRNAl组和Lv—rSlit2-siRNA2组，根据分组分别用仅有病毒的载体和不同序列的Lv—rSlit2-siRNA载体转染细胞，分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法测定各组细胞中Slit2mRNA及蛋白的表达以确定Slit2基因的敲减率，筛选有效干扰序列。采用0、100、200和400μmol／LCoCl，孵育大鼠RPE细胞以制备缺氧细胞模型并转染筛选Lv—rSlit2-siRNA2干扰序列，采用实时荧光定量PCR法和ELISA法测定大鼠RPE细胞中血管内皮生长因子A（VEGFA）表达变化及细胞上清液中VEGFA质量浓度。结果成功构建2条大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体，病毒滴度分别为5×10^8TU／ml和3×10^8TU／ml，转染病毒后72h于荧光显微镜下观察RPE细胞慢病毒转染率均在70％以上。Lv—rSlit2-siRNAl组和Lv—rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中Slit2mRNA相对表达量分别为0．67±0．09和0．23±0．11，明显低于空白对照组的1．03±0．31和空病毒组的0．92±0．07；Lv—rSlit2-siRNAl组和Lv—rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中Slit2蛋白相对表达量分别为0．62±0．07和0．49±0．02，明显低于空白对照组的1．00±0．10和空病毒组的0．95±0．11，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。0、100、200和400μmol／LCoCl，作用后，空白对照组和Lv—rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中VEGFAmRNA的相对表达量明显不同，差异均有统计学意义（F浓度=127．998，P〈0．01；Fn自=69．663，P〈0．01），不同浓度CoCl2作用后各组大鼠RPE细胞中VEGFA蛋白相对表达量均明显不同，差异均有统计学意义（F浓度=17．059，P〈0．01；F分组=91．791，P〈0．01）。100、200和400μmol／LCoCl2作用后Lv—rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中VEGFAmRNA表达量及蛋白质量浓度均明显低于空白对照组，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体构建成功并筛选出有效干扰重组序列，其能有效下调大鼠RPE细胞中Slit2基因的表达，并抑制缺氧环境下VEGFA在大鼠RPE细胞中的表达。

N-乙酰半乳糖胺偶联小干扰RNA类药物的非临床毒性研究进展

小干扰核糖核酸(siRNA)作为核苷酸类药物,通过RNA干扰(RNAi)特异性诱导基因沉默而发挥作用,在代谢性疾病、抗感染及肿瘤等领域被广泛应用。目前已获批上市4款基于N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)偶联技术siRNA药物,汇总分析已上市GalNAc偶联药物的非临床毒性特征及临床不良反应,初步明确非临床研究中毒性常见类型,包括脱靶与非脱靶毒性等。结合GalNAc-siRNA类药物非临床研究实践,了解可预测的脱靶毒性及对于非临床安全性评价中的毒性关注点,以期为GalNAc-siRNA药物临床研究提供参考。

生长激素受体靶向siRNA联合5-FU对人结肠癌肝转移的影响

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)靶向抑制人生长激素受体(hGHR)联合5-FU对人结肠癌细胞肝转移的影响。方法建立人结肠癌细胞SW480 BALB/c小鼠肝转移模型,并针对hGHR基因靶点构建siRNA干扰质粒,将荷瘤小鼠随机分成6个不同处理组,分别为生理盐水组、质粒组、生长激素(GH)组、5-氟尿嘧啶(5-FU)组、5-FU+质粒组、5-FU+质粒+GH组,观察各组肿瘤的肝转移情况。结果各组小鼠均有肝转移瘤形成,质粒组肝转移瘤数较生理盐水及GH组明显减少(2.67±1.37 vs.10.17±1.94,10.50±1.38)(P<0.05);干扰质粒与5-FU联用后肝转移瘤数略低于两者单独使用(2.33±1.03 vs.3.17±0.98,2.67±1.37),但差异无统计学意义(P>0.05);在5-FU+质粒的基础上加用GH并不增加肝转移瘤的发生(P>0.05),但能改善小鼠由GHR抑制和化疗药物的毒性引起的体质量降低(P<0.05)。结论 siRNA靶向抑制hGHR可降低小鼠中人结肠癌细胞SW480肝转移的发生,GHR在肿瘤转移中可能起了重要作用。

男性不育患者精液干扰素水平的观察

本实验采用微量细胞病变抑制法,共检测44例正常生育男子精液标本和83例不育男性患者精液标本的干扰素水平.发现正常生育男子精液中的干扰素阳性率为18.18%,而不育男性患者精液中干扰素水平的阳性率为55.42%,两者有显著性差异(P<0.01).提示精液中干扰素的水平与男性不育有明显的关系.本文介绍一种新的精液干扰素检测技术,并为男性不育症的鉴别诊断提供新手段.

大鼠opticin表达基因小发夹RNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建针对大鼠opticin表达基因（OPTC）的特异性小发夹RNA（shRNA）真核表达质粒.方法 用DNA重组技术将针对大鼠OPTC基因不同位点所设计的4个shRNA序列克隆到真核表达 质粒中.根据构建的4对质粒设置shRNA-1组、shRNA-2组、shRNA-3组、shRNA-4组,同时只加转染试剂不加质粒的细胞设为正常对照组,转染阴性质粒的细胞为阴性对照组.用脂质体lipofectimine 2000将4个shRNA质粒分别转染至体外培养的原代大鼠睫状体非色素上皮（NPE）细胞,转染后采用半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测OPTC基因的mRNA及opticin蛋白的相对表达量和抑制率.结果 各组质粒转染大鼠NPE细胞后,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4组细胞OPTC mRNA相对表达较正常对照组均明显下调（F=10.239,P=0.000）,各组OPTCmRNA抑制率为85.7%、62.87%、54.87%、48.77%.各质粒干扰组细胞opticin蛋白表达较正常组均有不同程度下降（F=17.870,P=0.000）,各组opticin蛋白抑制率为78.7%、34.6%、31.1%、16.8%.结论 OPTC基因干扰质粒shRNA-1可以有效抑制大鼠睫状体NPE细胞opticin的表达.