Multidrug resistance protein 3 R652G may reduce susceptibility to idiopathic infant cholestasis

AIM:To evaluate the role of genetic factors in the pathogenesis of idiopathic infant cholestasis.METHODS:We performed a case-control study,in-cluding 78 infants with idiopathic infant cholestasis and 113 healthy infants as controls.Genomic DNA was extracted from peripheral venous blood leukocytes us-ing phenol chloroform methodology.Polymerase chain reaction was used to amplify the multidrug resistance protein 3(MDR3)R652G fragment,and products were sequenced using the ABI 3100 Sequencer.RESULTS:The R652G single nucleotide polymorphism(SNP)was significantly more frequent in healthy infants(allele frequency 8.0%)than in patients(allele frequency 2.60%)(P < 0.05),odds ratio,0.29;95% confidence interval,0.12-0.84.The conjugated bilirubin in patients with the AG genotype was significantly lower than in those with the AA genotype(44.70 ± 6.15 μmol/L vs 95.52 ± 5.93 μmol/L,P < 0.05).CONCLUSION:MDR3 R652G is negatively correlated with idiopathic infant cholestasis.Children with the R652G SNP in Guangxi of China may have reduced susceptibility to infant intrahepatic cholestasis.

芒果苷上调HepG2细胞膜蛋白MRP3和核受体PXR、CPF表达

目的体外HepG2细胞培养观察芒果苷(mangiferin)对多耐药相关蛋白3(multidrug resistance-associate protein 3,MRP3)和核受体孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)、CYP7A启动子结合因子(CYP7A promoter-binding factor,CPF)表达的影响。方法用芒果苷刺激HepG2细胞72 h后,分别抽提细胞RNA、膜蛋白及核蛋白,采用半定量RT-PCR和蛋白免疫印迹检测膜转运蛋白MRP3和核受体PXR、CPF在转录与蛋白水平的表达变化。熊脱氧胆酸(ursode-oxycholic acid,UDCA)处理的HepG2细胞作为阳性对照、DMSO处理细胞为阴性对照。结果芒果苷可显著刺激HepG2细胞膜转运蛋白MRP3的mRNA(比阴性对照组高3.0倍,P<0.05)和蛋白(比阴性对照组高3.3倍,P<0.05)表达,其作用强于UDCA。芒果苷也可明显上调核受体PXR[mRNA水平增高1.7倍(P<0.05),蛋白水平增高3.7倍(P<0.01)]、CPF[mRNA水平增高2.1倍(P<0.05),蛋白水平增高4.9倍(P<0.05)]的表达。结论芒果苷刺激肝癌细胞HepG2细胞膜转运蛋白MRP3的表达上调可能与核受体PXR、CPF途径相关。

茵陈水提物对多药耐药蛋白3基因突变致新生儿肠外营养相关性胆汁淤积的保护作用

目的探讨茵陈水提物对多药耐药蛋白3(MDR3)基因突变导致的新生儿肠外营养相关性胆汁淤积(PNAC)的保护作用及可能机制。方法①将人原代培养肝细胞应用体外细胞培养、CRISPR/Cas9慢病毒感染、MDR3突变基因导入等技术处理后,比较1%脂肪乳诱导处理前(0)和处理后16、32、48 h不同时间点肝细胞上清液中肝胆生化指标〔丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)、间接胆红素(IBil)、总胆汁酸(TBA)〕的水平,确定构建MDR3基因突变PNAC肝细胞模型脂肪酸诱导所需的时间。②将人原代培养肝细胞株按随机数字表法分为空白对照组、MDR3基因野生型组、MDR3基因突变组、茵陈水提物干预组。空白对照组只用培养液处理,MDR3基因野生型组应用慢病毒感染融入野生型MDR3基因和培养液培养,MDR3基因突变组应用慢病毒感染慢病毒导入MDR3(c.485T>A、c.2793insA、c.1031G>A、c.3347G>A)突变基因和培养液培养,茵陈水提物干预组应用慢病毒感染导入MDR3突变基因和培养液培养的基础上,加入100 g/L茵陈水提物预处理,然后将4组肝细胞分别加入1%脂肪乳诱导处理,处理时间为构建MDR3基因突变PNAC肝细胞模型脂肪酸诱导所需时间。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定4组肝细胞上清液中肝胆生化(ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TBA)水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测4组肝细胞编码MDR3、胆盐输出泵(BSEP)、多药耐药相关蛋白(MRP)2~4和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的三磷酸腺苷结合盒蛋白(ABCB4、ABCB11、ABCC2、ABCC3、ABCC4)和TNF基因mRNA的表达丰度。结果与空白对照组和MDR3基因野生型组比较,MDR3基因突变组在经1%脂肪乳诱导处理前和处理后16 h肝细胞上清液中肝胆生化指标(ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TBA)水平比较差异无统计学意义,经1%脂肪乳诱导处理32 h和48 h MDR3基因突变组肝细胞上清液肝胆生化指标(ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TBA)水平均明显升高(均P<0.05),确定构建MDR3基因突变PNAC肝细胞模型脂肪酸诱导所需的时间为32 h。与MDR3基因突变组比较,茵陈水提物干预组肝细胞在脂肪乳处理后32 h肝细胞上清液中肝胆生化指标(ALT、AST、TBil、DBil、TBA)水平均明显降低〔ALT(ng/L):148.3±2.3比164.9±7.0,AST(ng/L):2767.4±78.8比3239.4±107.1,TBi(lμmol/L):7.6±0.2比13.6±0.3,DBi(lμmol/L):1.8±0.1比5.7±0.2,TBA(μmol/L):3.4±0.2比6.7±0.1,均P<0.05〕;空白对照组、MDR3基因野生型组、MDR3基因突变组和茵陈水提物干预组肝细胞编码MDR3、MRP2、MRP3、MRP4的ABCB4、ABCC2、ABCC3、ABCC4基因mRNA表达丰度差异无统计学意义;TNF基因mRNA在MDR3基因突变组呈高表达(2-ΔΔCt:1.258±0.200比1.001±0.052),茵陈水提物干预组呈低表达(2-ΔΔCt:0.387±0.247比1.258±0.200),组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。与MDR3基因突变组比较,茵陈水提取物干预组肝细胞编码BSEP的ABCB11基因mRNA的表达丰度明显增高(2-ΔΔCt:2.955±0.479比1.333±0.529,P<0.05)。结论茵陈水提物对MDR3基因突变导致的PNAC有一定保护作用,可能与拮抗炎症反应,降低TNF基因的mRNA表达和改善编码BSEP的ABCB11基因的mRNA表达有关。

抗MRP3单链抗体-sTRAIL融合蛋白诱导U251多形性胶质母细胞瘤凋亡

采用重组PCR技术获得抗多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance protein 3,MRP3)的单链抗体(scFv)与人源可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(soluble TNF-related apoptosis inducingligand,sTRAIL)的融合蛋白质的基因编码序列,利用原核表达载体pMAL-c2,构建含麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)标签肽的antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白,经亲和层析柱纯化.获得纯化的antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白,用MRP3阳性U251多形性胶质母细胞瘤做增殖抑制实验、细胞凋亡诱导实验,结果均显示具有明显的活性,而MBP无明显作用.上述结果表明,成功表达了antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白,该融合蛋白具有诱导U251多形性胶质母细胞瘤细胞凋亡的活性,为开发靶向性抗肿瘤药物奠定了基础.

熊脱氧胆酸和利福平诱导HepG2细胞核受体FTF和膜转运蛋白MRP3的表达

目的体外细胞培养观察利胆药物熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)及其衍生物牛磺熊脱氧胆酸(tauroursdeoxycholic acid,TUDCA)或利福平(rifampicin,Rif)对多耐药相关蛋白3(multidrug resistance-associate protein 3,MRP3)及其核受体FTF(fetoprotein transcription factor)表达的影响。方法用UDCA及其衍生物TUDCA或Rif分别刺激培养的肝癌细胞HepG2后,抽提HepG2的总RNA与细胞总膜蛋白、核蛋白,分别用Quantitative real-time PCR和Westernblot检测MRP3和FTF mRNA与蛋白水平表达的变化。结果UDCA及其衍生物TUDCA与Rif均可诱导HepG2细胞内核受体FTF表达增高,同时MRP3 mRNA和蛋白水平表达也相应增高。结论UDCA及其衍生物TUDCA和Rif刺激肝癌细胞HepG2细胞膜转运蛋白MRP3表达上调可能与核受体FTF途径相关。

IL-18通过NF-κB通路调控MRP3对ANIT引起的胆汁淤积模型的影响及其机制

目的探讨IL-18通过NF-κB通路调控MRP3对ANIT引起的胆汁淤积模型的影响。方法选取10只大鼠用ANIT诱导建立胆汁淤积模型,另取10只作为对照组,HE染色观察肝组织病理变化,全自动生化仪检测大鼠血清ALP、ALT、ALP、TB、DB、TBA以及肝组织TBA含量。取肝组织培养肝细胞,将正常大鼠肝细胞培养出的细胞作为空白组(A组),胆汁淤积模型大鼠肝细胞培养出的细胞分为低(C组)、中(D组)、高浓度组(E组)和非干预模型组(B组),每组10个样本。C、D、E组肝细胞分别给予IL-18(10、30、100 ng/mL)不同浓度处理,A组和E组给予同体积的生理盐水处理。Western blot和RT-PCR分别检测大鼠肝组织IL-18、p-p65、MRP3、YY1、FXR蛋白及其mRNA。结果与对照组比较,胆汁淤积模型大鼠肝脏出现黄染,边缘变钝,空泡变性,汇管区较多纤维组织增生,可见肝细胞出现脂肪变性、轻度坏死。与对照组比较,胆汁淤积模型组血清ALP、ALT、AST、TB、DB、TBA以及肝组织TBA的含量均升高(均P<0.05)。与对照组比较,胆汁淤积模型组大鼠肝组织IL-18、p-p65、YY1、MRP3蛋白及其mRNA相对表达量均升高(均P<0.05),FXR蛋白及其mRNA相对表达量降低(P<0.05)。五组肝细胞p-p65、YY1、MRP3蛋白及其mRNA相对表达量差异均有统计学意义(均P<0.05),与A组比较,B、C、D、E组均升高(均P<0.05);与B组和C组比较,D和E组均升高(均P<0.05),且E组高于D组。五组肝细胞FXR蛋白及其mRNA相对表达量差异有统计学意义(P<0.05),与A组比较,B、C、D、E组均降低(均P<0.05);与B组和C组比较,D和E组均降低(均P<0.05),且E组低于D组。结论IL-18表达和NF-κB通路作用与胆汁淤积模型发生相关,其可能作用机制为IL-18通过诱导p65磷酸化,激活NF-κB通路调控YY1及FXR促进MRP3表达而影响胆汁淤积模型发病。

反义MRP3寡核苷酸对卵巢癌拓普替康耐药性的逆转作用

目的:探讨MRP3反义寡核苷酸对人卵巢癌拓普替康(TPT)耐药株SKOV3/TPT细胞的耐药逆转作用。方法:人工合成MRP3反义寡核苷酸(ASODN)及相应的正义寡核苷酸(SODN)片段,用脂质体(LF)构建成ASODN/LF、SODN/LF,分别转染SKOV3/TPT细胞,用MTT法、流式细胞仪(FCM)及半定量RT-PCR检测体外转染后细胞内TPT的荧光强度、耐药指数及MRP3mRNA表达的改变。结果:将MRP3反义及正义寡核苷酸片段分别转染进SKOV3/TPT细胞后,反义组细胞内TPT的荧光强度及耐药指数明显降低(P<0.05),细胞内MRP3mRNA的表达较未转染细胞下降了60.16%(P<0.05);正义组上述指标无明显变化。结论:转染MRP3ASODN/LF可部分逆转MRP3介导的人卵巢癌细胞对TPT耐药。

MRP3基因参与卵巢癌细胞拓扑替康耐药机制形成的研究

目的:分析人卵巢癌SKOV3/TPT多药耐药的分子机制,寻找可能参与拓扑替康(TPT)耐药机制的新基因。方法:采用大剂量间歇诱导法,对SKOV3细胞株用TPT反复冲击诱导培养,获得稳定的SKOV3/TPT;利用Affymetrix U133A基因表达谱芯片,比较SKOV3及SKOV3/TPT细胞的基因表达;从中选择高表达的MRP3基因进行RT-PCR验证。再将MRP3反义及正义寡核苷酸片段分别用脂质体转染进耐药细胞,用MTT法、流式细胞仪及半定量RT-PCR检测体外转染后细胞内TPT的荧光强度、耐药指数及MRP3 mRNA表达的改变。结果:基因芯片检测发现,有7个差异表达基因可能参与了SKOV3/TPT细胞的耐药,其中4个基因被上调,3个基因被下调,MRP3为上调最明显的基因。MRP3反义寡核苷酸转染SKOV3/TPT细胞后,可明显降低细胞内TPT的浓度及耐药指数(P<0.05),细胞内MRP3 mRNA的表达较未转染细胞下降了60.16%(P<0.05)。结论:SKOV3/TPT细胞耐药表型的形成涉及多个基因表达的改变。MRP3的高表达导致细胞内药物浓度降低,可能是卵巢癌细胞对TPT耐药的主要原因。

AntiMRP3(scFv)-sTRAIL靶向诱导多形性成胶质细胞瘤的凋亡

目的:观察抗人类多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance protein 3,MRP3)的单链抗体与可溶性坏死因子相关凋亡诱导配体(soluble TNF-related apoptosis inducing ligand,sTRAIL)的融合蛋白antiMRP3(scFv)-sTRAIL对多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)U251细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法:MTT法检测不同浓度antiMRP3(scFv)-sTRAIL(3.9063～250 nmol/L)作用后U251细胞的存活率。给予亲代antiMRP3(scFv)或TRAIL活性中和抗体mAb 2E5预孵育,应用IC50剂量的antiMRP3(scFv)-sTRAIL作用U251细胞,流式细胞仪检测U251细胞的凋亡率,Western blotting检测U251细胞中caspase-3的激活及其关键底物DNA裂解因子(DNA fragmentation factor,DFF)的降解。结果:随着antiMRP3(scFv)-sTRAIL浓度的增加,U251细胞的存活率逐渐降低[(84.84±0.2)%～(19.93±1.8)%];IC50剂量(62.5 nmol/L)的antiMRP3(scFv)-sTRAIL单独或给予antiMRP3(scFv)、mAb 2E5预孵育后处理,致U251细胞的凋亡率分别为(58.0±1.3)%、(14.9±1.7)%和(17.4±3.0)%;antiMRP3(scFv)或mAb 2E5预孵育均可阻断U251细胞中antiMRP3(scFv)-sTRAIL诱导的caspase-3的激活及DFF的裂解。结论:AntiMRP3(scFv)-sTRAIL促进sTRAIL靶向识别并诱导GBM细胞凋亡,为开发靶向性抗肿瘤药物奠定了基础。

川西獐牙菜单体齐墩果酸上调阻塞性胆汁淤积大鼠肝脏核受体Lrh-1和胆酸转运蛋白Mrp3的表达

目的建立胆道结扎的大鼠模型,观察川西獐牙菜活性单体齐墩果酸(oleanolic acid,OA)对胆道结扎所致的肝外胆汁淤积的保护作用,及其对多药耐药相关蛋白3(multidrug resistanceassociated protein 3,Mrp3)、核受体Lrh-1的调控作用。方法采用随机数字表法将15只SD大鼠分为3组:假结扎组(Sham组)、胆道结扎组(BDL组)、齐墩果酸组(BDL+OA组),每组5只。分别用生理盐水、齐墩果酸处理7 d后,收集组织标本,HE染色检测肝脏损伤程度,Western blot及RT-PCR检测Mrp3和Lrh-1在蛋白及mRNA水平的变化。结果 HE染色结果显示BDL+OA组肝脏损伤程度较胆道结扎组明显减轻;Western blot结果表明BDL+OA组Mrp3表达较Sham组增加2.4倍,Lrh-1表达增加1.8倍;RT-PCR结果显示BDL+OA组Mrp3表达较Sham组增加3.2倍,Lrh-1表达升高2.2倍。结论川西獐牙菜单体齐墩果酸对胆道结扎所致大鼠胆汁淤积性肝损伤具有保护作用,而这种保护作用可能与Lrh-1、Mrp3有关。

胆囊癌中MRP3的表达及其与预后的关系

目的:探讨multidrug resistance-related protein 3(MRP3)在胆囊癌中的表达及其与病理指标及预后的关系。方法:应用免疫组化SP法检测50例胆囊癌中MRP3的表达。结果:MRP3呈散在分布的淡黄色或棕褐色颗粒,主要定位于细胞浆中,散见于细胞核中,强阳性表达率为72%。随着转移程度、Nevin分级以及分化程度的增加,强阳性表达率增加,且具有统计学差异(P<0.05)。本组病人总生存期为16.42个月,强阳性表达组病人的总生存期为13.25个月,弱阳性表达组病人的总生存期为22.64个月,两者具有显著性差异(P<0.05)。单因素分析显示总生存期与MRP3的表达、Nevin分级、转移及分化程度有关(P<0.05),多因素分析显示MRP3的表达强弱以及转移是总生存期的独立预后因子(P<0.05)。结论:高表达的MRP3参与了胆囊癌的发生发展,MRP3与胆囊癌的分化、转移有关,可作为判断预后的指标。

藏茵陈上调大鼠肝细胞膜转运蛋白多耐药相关蛋白3和核受体孕烷X受体表达

目的:观察藏茵陈对正常大鼠多耐药相关蛋白3(MRP3)和核受体孕烷X受体(PXR)表达的影响。方法:将10只SD大鼠随机分为藏茵陈组5只,藏茵陈100 mg·kg-1·d-1灌胃7 d;对照组5只,同体积0.9%氯化钠注射液灌胃。7 d后麻醉处死2组大鼠,取肝脏组织行HE染色检测肝脏形态变化,分别提取肝脏组织RNA、膜蛋白及核蛋白,采用实时聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹检测膜转运蛋白MRP3和核受体PXR在转录与蛋白水平的表达变化。结果:给予藏茵陈后,与0.9%氯化钠注射液比较,未影响肝脏组织的形态结构;藏茵陈可显著刺激正常大鼠肝细胞膜转运蛋白MRP3表达(P<0.01);也可明显上调核受体PXR水平增高(P<0.01)。结论:藏茵陈刺激大鼠肝细胞膜蛋白MRP3的表达上调可能与核受体PXR途径相关。

复方茵丹汤对急性肝内胆汁淤积大鼠肝组织法尼醇受体及多耐药相关蛋白3表达的影响

目的研究复方茵丹汤对α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的大鼠急性肝内胆汁淤积的作用机制。方法将108只雄性SD大鼠随机分为正常对照组,模型组,中药复方茵丹汤高、中、低剂量组和阳性药对照组,每组18只,依据取材时间不同又将各组随机分为24、48、72 h 3个亚组,每组6只。模型组、中药组、阳性药对照组大鼠一次性给予2%ANIT按100 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃造模,正常对照组予等容积色拉油灌胃。造模2 h后,中药高、中、低剂量组分别给予生药含量为24.48 g·kg^(-1)·d^(-1)、12.24 g·kg^(-1)·d^(-1)和6.12 g·kg^(-1)·d^(-1)的复方茵丹汤中药煎剂l ml/100 g体质量灌胃,模型组和正常对照组给予等容积生理盐水灌胃,阳性药对照组给予67.5 mg·kg^(-1)·d^(-1)熊去氧胆酸(UDCA)水溶液l ml/100 g体质量灌胃,均1次/d。造模后分别于24、48、72 h处死相应时相大鼠,采用RT-q-PCR、Western Blot和免疫组化技术检测法尼醇受体(FXR)及多耐药相关蛋白3(MRP3)在大鼠肝组织的表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果 RT-q-PCR结果显示,与同时相正常组比较,模型组FXR mRNA表达均明显降低(P值均<0.05);与同时相模型组比较,中药各剂量组及UDCA组FXR mRNA表达明显升高(P值均<0.05);中药高剂量组各时相FXR mRNA表达明显高于中、低剂量组(P值均<0.05)。与同时相正常组比较,模型组MRP3 mRNA表达均显著升高(P值均<0.05);与同时相模型组比较,除低剂量组24 h外,中药各剂量组及UDCA组MRP3 mRNA表达均明显升高(P值均<0.05);中药高剂量组48 h、72 h的MRP3 mRNA表达均明显高于中、低剂量组(P值均<0.05)。免疫组化结果显示,与同时相正常组比较,模型组FXR蛋白表达均显著降低(P值均<0.05);与模型组比较,24 h中药各剂量组及各时相UDCA组FXR蛋白表达均显著升高(P值均<0.05);中药高剂量组FXR蛋白表达明显高于同时相中、低剂量组和模型组(P值均<0.05)。与同时相正常组比较,模型组MRP3蛋白表达显著升高(P值均<0.05);与同时相模型组比较,除低剂量24 h外,中药各剂量组及UDCA组MRP3蛋白表达明显升高(P值均<0.05);中药高剂量组MRP3蛋白表达显著高于同时相低剂量组及72 h中剂量组(P值均<0.05)。Western Blot结果显示,与同时相正常组比较,模型组FXR蛋白表达均显著降低(P值均<0.05);与同时相模型组比较,中药各剂量组及UDCA组FXR蛋白表达均显著升高(P值均<0.05);中药高剂量组FXR蛋白表达均显著高于同时相中、低剂量组(P值均<0.05)。与同时相正常组比较,模型组MRP3蛋白表达均显著升高(P值均<0.05);与模型组比较,48 h及72 h中药中、高剂量组及UDCA组MRP3蛋白表达均明显升高(P值均<0.05);中药高剂量组48 h和72 h的MRP3蛋白表达均高于相应的中、低剂量组(P值均<0.05)。结论复方茵丹汤对ANIT灌胃诱导AIC大鼠的治疗作用可能与其上调FXR和MRP3基因、蛋白表达有关。

重症肺炎多重耐药菌感染危险因素及NLRP3/IL-1β的预测价值

目的 探究重症肺炎多重耐药菌(MRB)感染危险因素及NLRP3/IL-1β的预测价值。方法 选取2020年4月—2023年3月华中科技大学协和东西湖医院收治的183例重症肺炎患者为研究对象,根据MRB感染情况分为MRB感染组55例和非MRB感染组128例。比较两组临床资料,采用Logistic分析法分析危险因素;酶联免疫吸附试验检测血清NLRP3、IL-1β水平;受试者工作特征(ROC)曲线分析NLRP3、IL-1β单独及联合检测对重症肺炎患者MRB感染诊断价值。结果 重症肺炎患者MRB感染率为30.05%;危险因素包括慢性阻塞性肺疾病、有机械通气、侵入性操作时间长、感染后联合应用抗菌药物(P<0.05);MRB感染组血清NLRP3、IL-1β水平较非MRB感染组高(P<0.05);NLRP3、IL-1β单独及联合检测重症肺炎患者MRB感染曲线下面积(AUC)分别为0.738、0.808、0.856。联合检测的AUC高于各项单独检测(P<0.05),敏感度和特异度为83.60%、69.50%。结论 重症肺炎患者MRB感染发生率高,且激活了NLRP3/IL-1β通路,联合检测NLRP3、IL-1β有助于诊断重症肺炎患者MRB感染,重症肺炎患者MRB感染与慢性阻塞性肺疾病、机械通气、侵入性操作时间、感染后联合应用抗菌药物相关。

血清CC16、Tim-3对老年多重耐药菌血流感染预后的预测价值分析

目的探究血清Clara细胞蛋白16(CC16)、T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)对老年多重耐药菌血流感染患者预后的预测价值。方法本研究通过选取2020年1月-2022年12月在本院治疗的老年多重耐药菌血流感染患者(80例)作为血流感染组,取同期在本院体检健康者(80例)作对照组,比较两组血清CC16、Tim-3水平;根据患者的预后情况将其分为生存组和死亡组,比较两组一般资料以及血清CC16、Tim-3水平。ROC分析血清CC16、Tim-3水平对血流感染患者预后的预测价值。Logistic分析影响血流感染患者预后的因素。结果血流感染组血清CC16水平比对照组低,Tim-3水平比对照组高(P<0.05)。死亡组血清CC16水平比生存组低,Tim-3、白细胞计数(WBC)、C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)水平比生存组高(P<0.05)。血清CC16、Tim-3联合预测血流感染患者死亡的AUC为0.920(95%CI:0.856~0.984),高于其单独检测(Z=2.571、2.915,P<0.05),灵敏度77.80%,特异度85.50%。Logistic回归模型分析显示,Tim-3是影响血流感染患者死亡的危险因素,CC16是保护因素(P<0.05)。结论血清CC16、Tim-3对老年多重耐药菌血流感染患者的预后有一定的预测价值,可能是评估患者预后情况的潜在指标。

胆汁淤积下FGF19-ERK通路可上调MRP3/4表达减轻肝细胞损伤

该文采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、蛋白印迹实验(Western blot)检测成纤维细胞因子19(fibroblast growth factor 19, FGF19)处理肝细胞癌细胞系HepG2后细胞自分泌的FGF19;具有胆汁酸排泌作用的多药耐药性蛋白3(multidrug resistance-associated protein 3, MRP3)和多药耐药性蛋白4(multidrug resistance-associated protein 4, MRP4)表达量的改变对胆汁淤积条件下肝细胞的保护作用。结果表明,使用FGF19处理HepG2细胞, MRP3、MRP4的mRNA和蛋白表达水平均显著上调并呈浓度和时间依赖性。Western blot进一步证实FGF19处理细胞可激活磷酸化细胞外信号调节激酶(extracellular signal related kinase, ERK)信号通路;使用ERK信号通路的特异性小分子抑制剂(PD98059)预处理HepG2再加入100 ng/mL的FGF19刺激细胞,与未加入PD98059的对照组相比, MRP3、MRP4的mRNA水平和蛋白水平均被抑制。综上所述, FGF19通过调控ERK信号通路特异性地上调MRP3和MRP4表达水平,在胆汁淤积条件下可增加胆汁酸排泌以保护肝细胞。

茵栀黄注射液基于FXR调控MDR3治疗肝内胆汁淤积的作用机制

目的:通过研究茵栀黄注射液(Yinzhihuang injection,YZH)对人正常肝细胞系HL-7702细胞的法尼酯X受体(farnesoid X receptor,FXR),多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance associated protein 3,MDR3)基因表达的影响,探讨茵栀黄注射液调控肝脏胆汁酸代谢的作用靶点及机制,为茵栀黄注射液治疗肝内胆汁淤积的临床应用提供实验依据。方法:不同浓度茵栀黄注射液干预HL-7702,采用细胞活性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)探索茵栀黄注射液对HL-7702的活性影响,结合实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)法确定茵栀黄注射液的理想干预浓度和时间;用GW4064(FXR激动剂)促进FXR基因的表达,分为茵栀黄注射液组,GW4064组,GW4064+茵栀黄注射液组,正常组,DMSO组;小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默FXR基因,分为siRNA组,siRNA+茵栀黄注射液组,正常组,阴性组。Real-time PCR法、蛋白质免疫印迹(Western blot)法分别检测FXR,MDR3 mRNA及蛋白质的相对表达量,免疫荧光(IF)检测FXR蛋白的表达。结果:研究结果表明茵栀黄注射液对HL-7702的理想干预浓度1.08%,理想干预时间为15.47 h;茵栀黄注射液对HL-7702活性影响呈剂量依赖性;与正常组比较,GW4064组促进FXR,MDR3 mRNA和蛋白的表达(P<0.01);与正常组比较,siRNA组抑制FXR,MDR3 mRNA和蛋白的表达(P<0.01);与GW4064组比较,GW4064组+茵栀黄注射液组促进FXR,MDR3 mRNA和蛋白的表达(P<0.01);与siRNA组比较,siRNA+茵栀黄注射液组促进FXR,MDR3 mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。结论:茵栀黄注射液促进FXR,MDR3 mRNA和蛋白的表达,茵栀黄注射液通过FXR促进MDR3 mRNA和蛋白的表达来调控肝脏胆汁酸的代谢,本实验为其临床应用于治疗肝内胆汁淤积提供实验依据。

差异凝胶电泳筛选人骨肉瘤细胞多药耐药相关蛋白

目的:应用差异凝胶电泳分析骨肉瘤多药耐药细胞株与亲本细胞株蛋白质表达的差别,筛查骨肉瘤细胞多药耐药相关蛋白。方法:以小剂量多柔比星(doxorubicin,DXR)诱导人骨肉瘤细胞株MG-63,建立骨肉瘤多药耐药细胞株MG-63/DXR100。以差异凝胶电泳分离两组细胞中的全部蛋白质,应用图像扫描和DeCyder软件分析差异(表达增加或减少>30%)表达的蛋白质点,对其进行质谱鉴定,并在Mascot数据库中检索。结果:共检测到明显差异表达的蛋白质点30个,选择其中18个点进行质谱鉴定,有5个蛋白质点鉴定成功,它们分别是与肿瘤细胞转移相关的基质金属蛋白酶1(matrix metalloprotein-ases1,MMP1)、具有解毒功能的乙醇脱氢酶6(alcohol dehydrogenase6,ADH6)、属于抑癌基因的FERM域结合蛋白3(FERM domain containing protein3,FRMD3),以及两个分别由128和300个氨基酸残基构成的未知蛋白。MMP1、ADH6和2种未知蛋白在耐药细胞表达显著高于非耐药细胞组,而FRMD3表达显著显著低于非耐药细胞。结论:通过差异凝胶电泳筛查到,MMP1、ADH6、FRMD3及2种未知蛋白质在骨肉瘤细胞的多药耐药细胞和非耐药细胞中差异表达,它们可能参与骨肉瘤细胞的多药耐药机制。

NNK对BEP2D细胞耐药基因表达的影响

目的探讨4-甲基亚硝胺-1-3-呲啶基-1-丁酮(NNK)对BEP2D细胞多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白(LRP)表达的影响。方法应用NNK 500μg/m l干预BEP2D细胞生长,收集连续干预后第10、20、30代NNK-500细胞,行接种裸鼠成瘤试验检验其成瘤性;采用RT-PCR检测BEP2D细胞,以及第10、20、30代NNK-500细胞的MRP、LRP表达量。结果经NNK干预后的第20、30代NNK-500细胞接种裸鼠成瘤,病理切片显示为高分化鳞癌;RT-PCR显示,在BEP2D细胞中MRP、LRP呈低度表达,第10、20代NNK-500细胞的表达量略有增加,第30代NNK-500细胞的表达量明显增加(P<0.01)。结论 NNK对BEP2D细胞有致癌性,可增加BEP2D细胞的MRP、LRP表达,降低化疗敏感性。

三种肝转运蛋白在原发性胆汁性胆管炎患者肝组织中的表达特点

目的探讨胆汁酸盐输出泵(bile salt export pump,BSEP)、多药耐药相关蛋白2(multidrug resistant protein 2,MRP2)和多药耐药糖蛋白3(multidrug resistance associated protein 3,MDR3)在原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)患者肝组织中的表达特点。方法收集2009年1月至2019年12月于南昌市第九医院住院且经肝组织病理诊断为PBC的46例患者临床资料,根据PBC严重程度分为PBC早期组(Ⅰ~Ⅱ期,31例)和PBC晚期组(Ⅲ~Ⅳ期,15例),比较两组患者血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST)、总胆汁酸(total bile acid,TBA)、总胆红素(total bilirubin,TBil)、直接胆红素(direct bilirubin,DBil)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、γ-谷氨酰转移酶(gamma-glutamyltransferase,GGT)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)等的差异。选取10例慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)携带者作为对照组。对所有入选病例肝组织进行BSEP、MDR3、MRP2免疫组织化学标记,观察各组肝组织病理形态及3种转运蛋白表达差异。结果PBC晚期组患者血清ALP(中位数:404 U/L vs 281 U/L)、GGT(中位数:437 U/L vs 245 U/L)、TC(中位数:6.58 mg/L vs 4.50 mg/L)、TG(中位数:1.72 mg/L vs 1.24 mg/L)、LDL(中位数:3.61 mg/L vs 2.27 mg/L)水平均显著低于PBC早期组,差异有统计学意义(P均<0.05)。两组患者年龄、性别、血清ALT、AST、TBA、TBil、DBil、HDL水平及AMA阳性率差异均无统计学意义(P均>0.05)。与PBC早期组相比,PBC晚期组患者炎症活动度和纤维化程度均较重,差异有统计学意义(χ^(2)=14.71,P=0.0006;χ^(2)=20.57,P<0.001)。PBC早期组与PBC晚期组患者肝细胞CK7和CK19染色阳性率无统计学差异[54.84%(17/31)vs 46.67%(7/15),χ^(2)=0.271、P=0.755;74.19%(23/31)vs 86.67%(13/15),连续校正χ^(2)=0.337、P=0.562]。PBC组患者肝组织中BSEP高表达率显著低于对照组[54.76%(23/42)vs 100.00%(10/10);χ^(2)=5.311,P=0.021],MDR3和MRP2高表达率差异无统计学意义[91.18%(31/34)vs 100.00%(10/10),P=1.000;69.7%(23/33)vs 100.00%(10/10);χ^(2)=2.433,P=0.119]。PBC晚期组患者BSEP高表达率显著低于PBC早期组[68.97%(20/29)vs 23.08%(3/13);χ^(2)=7.630,P=0.008],MDR3和MRP2阳性高表达率差异无统计学意义[91.30%(21/23)vs 90.91%(10/11),P=1.000;68.18%(15/22)vs 72.73%(8/11),P=1.000]。BSEP、MRP2、MDR3在胆汁淤积区阳性表达减少越显著,肝细胞胆汁淤积肿胀及羽毛样变性越明显。结论BSEP在PBC患者肝组织中表达降低,且在PBC晚期组患者肝组织表达率显著降低,提示PBC胆汁淤积与毛细胆管膜侧BSEP蛋白表达缺陷有关,并且PBC疾病进展可能与BSEP表达减少有关。