猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得到3条与试验设计相符的1 060bp(TGEV)、462bp(PEDV)及258bp(PBoV)特异性条带,建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法。结果表明,在同一PCR反应体系中,可以同时检测这3种病毒核酸片段,而对其他病毒的检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法的最低检测限分别为35、20、10pg的核酸。采用该方法对60份临床样品进行检测,TEGV阳性率为1.6%,PEDV阳性率为6.7%,PBoV阳性率为21.7%,表明建立的方法可以应用于临床检测。

肝螺杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

目的建立肝螺杆菌的多重PCR检测方法,对中国动物肝螺杆菌进行检测。方法以毒力基因flaB基因、ureA基因和cdtB基因和cdtC基因作为靶基因,建立检测肝螺杆菌的多重PCR方法。对肝螺杆菌、空肠弯曲菌、幽门螺杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞杆菌抽提的DNA进行多重PCR扩增。应用本研究建立的多重PCR检测方法对482只动物(其中:海南30只猴、江苏34只小鼠和北京32只猴、30头猪、66只犬、13只兔、29只豚鼠、69只大鼠、213只小鼠)进行检测,对扩增出的阳性结果进行测序。同时,对所有样本采用选择性培养基进行肝螺杆菌培养以作对照。结果肝螺杆菌能扩增出各自的特异性条带,而其他参考菌株均未扩增出条带,这表明该方法具有较强的特异性。482份样本中检出43份肝螺杆菌阳性样本,阳性率8.92%(43/482),其中:2只犬(3.03%,2/66)、1只兔(7.69%,1/13)、5只大鼠(7.25%,5/69)和35只小鼠(16.43%,35/247)均扩增出肝螺杆菌毒力基因片段。结果显示,肝螺杆菌flaB基因、ureA基因和cdtB基因和cdtC基因序列与GenBank中的肝螺杆菌ATCC51449的相应基因序列核苷酸同源性高达99%。用选择性培养基能培养出肝螺杆菌。结论中国动物中的犬、兔、大鼠和小鼠均能检出肝螺杆菌flaB基因、ureA基因、cdtB基因和cdtC基因。建立的多重PCR检测方法可作为肝螺杆菌大规模检测的新技术,这为在中国开展肝螺杆菌流行病学调查提供了有效科学工具。

多重PCR在食品安全风险监测中致泻大肠埃希氏菌毒力基因的检测应用

目的探讨多重PCR在食品安全风险监测中致泻大肠埃希氏菌毒力基因检测的应用价值。方法从食品安全风险监测中分离大肠埃希氏菌,采用多重PCR法检测其毒力基因,并进行血清分型。结果多重PCR对80株大肠埃希氏菌有效分型,其中,EAEC型20株,EPEC型21株,ETEC型7株,EHEC型0株,EIEC型1株,31株分不了型,血清型主要以086K61、0157+∶H7-、044K74等为主。结论食品安全风险监测中采用多重PCR检测致泻大肠埃希氏菌毒力基因能够辅助辨别其致病型,具有良好的应用价值。