猪链球菌2型MRP与EPF基因串联表达蛋白及其免疫保护作用

根据猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)和胞外蛋白因子(extracellular protein factor,EPF)的基因序列,各设计合成一对引物,以猪链球菌2型江苏分离株SS2-1的基因组为模板,扩增mrp基因1 801~2 513位序列和epf 基因1 783~2 563位序列,分别构建原核表达载体pET32a-mrp 、pET32a-epf,确定诱导表达的两种蛋白都具有免疫原性后,提取阳性克隆质粒各自进行双酶切并纯化,通过PCR串联两片段,将目的片段定向克隆到表达载体pET-32a中,重组质粒转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达分子量约为74kD的融合蛋白.用制备的两种抗血清与纯化融合蛋白进行免疫转印,结果显示融合蛋白分别具有MRP与EPF的中和表位.用融合蛋白MRP-EPF免疫新西兰兔,以最小致死量猪链球菌强毒株SS2-1攻击,兔的存活率达50%(2/4),存活率明显高于单个表达产物.证实串联表达的融合蛋白为重要的保护性抗原.

猪链球菌2型人源分离株MRP单克隆抗体的制备与鉴定

为建立一种针对猪链球菌2型（SS2）毒力因子的特异性检测方法，研制了抗SS2溶菌酶释放蛋白（MRP）单克隆抗体（McAb），并对其生物学活性进行了分析。将表达、纯化的SS2菌株MRP免疫BALB／c小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，以纯化的MRP蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA方法筛选获得了6株能稳定分泌抗MRPMcAb的杂交瘤细胞系288、3G5、1G1、3G9、186和2C3。经用间接ELISA方法测定，单抗腹水的抗体效价均超过1：10^5，杂交瘤细胞培养上清液的效价为1：128～1：1024。Western-blotting鉴定结果表明，6株单抗均具有特异的生物学活性；以288单抗腹水和SS2多克隆抗血清建立的夹心ELISA方法可特异地检测MRP。

猪链球菌2型人源株MRP的表达及其单克隆抗体的制备与应用

将猪链球菌2型(SS2)人源株Habbmrp基因进行截短修饰后,克隆于pGEX4T-2载体中,转化大肠杆菌诱导表达约61000的融合蛋白MRP-GST,该蛋白经凝血酶作用去除重组蛋白中的GST标签,得到约35000纯化的MRP。Western blotting证实MRP可被SS2阳性血清特异性识别。以纯化的MRP抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,间接ELISA进行筛选获得了6株能稳定分泌抗MRP特异性单抗的细胞株。特异性试验表明该6株单抗与SS2的另外2种蛋白、大肠杆菌均不发生交叉反应。以2B8单抗腹水和SS2多克隆抗血清建立夹心ELISA对71株标准菌株和122株猪链球菌野毒株进行MRP的表征鉴定,标准株检测结果与背景符合率为为97.2%(69/71),其中34株标准血清型菌株检测的符合率为100%。表明该方法可用于猪链球菌的快速诊断和流行病学调查。

猪链球菌2型溶菌酶释放因子MRP在重组沙门菌中的表达

从猪链球菌2型(SS2)四川分离株分离溶菌酶释放因子基因mrp,将其克隆至T载体上,再将asd基因插入到重组质粒的抗生素抗性基因中,电击转入asd缺陷型沙门菌X4072中表达,形成依赖asd基因的质粒-宿主平衡致死系统。经酶切、PCR及蛋白电泳鉴定,证实重组菌株能够稳定表达MRP,从而为SS2的防制提供了可能候选疫苗株。

猪链球菌2型mrp基因ORF1序列的克隆及原核表达

根据猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因(mrp)的序列,设计并合成了1对特异性引物,以青海株的基因组DNA为模板扩增了mrp基因ORF1序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达质粒pET-28a-mrp,并将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带(27.0 ku)。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有MRP的抗原表位。研究结果为今后开展该病的免疫学研究奠定了一定基础。

猪链球菌2型MRP和EF双基因共表达重组腺病毒载体的构建

旨在构建猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)双基因共表达重组腺病毒载体。根据猪链球菌2型MRP和EF的基因序列设计合成2对引物,以猪链球菌2型基因组为模板,扩增MRP基因(第1 801-2 513位)和EF基因(第1 783-2 563位)序列,并克隆到pMD18-T载体。然后将MRP基因、IRES元件和EF基因依次定向克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-MRP-IRES-EF,再经PmeⅠ酶切,然后转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞中,经同源重组获得重组腺病毒载体质粒rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF。PacⅠ酶切线性化该重组腺病毒载体质粒,再转染AD-293细胞进行病毒包装,最后对细胞包装的病毒液进行PCR鉴定。结果表明,克隆的MRP和EF基因测序正确,酶切重组穿梭质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物;线性化的重组腺病毒载体质粒rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF转染AD-293细胞6 d后也出现明显的细胞病变(CPE),在培养细胞的上清病毒液中也检测到了MRP和EF基因片段。

猪链球菌2型MRP-FBP串联表达蛋白对小鼠的免疫保护力

针对猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)和纤维蛋白原结合蛋白(FBP)抗原性较强的基因片段,分别设计了1对引物,用PCR扩增出了mrp基因和fbp基因的片段。利用这些片段分别构建了原核表达载体pET32a-mrp、pET32a-fbp和pET32a-mrp-fbp。将这些表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行了表达。SDS-PAGE分析表明,表达的MRP、FBP、MRP-FBP的分子质量分别为47、52、80 ku。Western-blot分析表明,重组蛋白MRP-FBP可被SS2阳性血清所识别。免疫保护试验表明,串联表达的融合蛋白MRP-FBP对BALB/c小鼠的保护率达80%,是目前筛选到的制备SS2亚单位疫苗保护力最高的短片段串联免疫原。

猪链球菌2型MRP与FBPS部分片段串联基因的原核表达

根据猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)和纤维蛋白原结合蛋白(FBPS)的基因序列,选取可能含有抗原决定簇的两片段,各设计合成一对引物,使之含有共同的酶切位点。通过T4DNA连接酶串联两片段,构建原核表达载体pET32a-mrp-fbps,重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),经不同时间、不同温度,不同浓度IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳,表达约为80kD的融合蛋白。Westernblot结果表明重组蛋白可被SS2阳性血清所识别。证实串联表达的融合蛋白具有良好的免疫原性,是重要的保护性抗原,本试验为进一步研究猪链球菌亚单位疫苗奠定了基础。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白部分片段的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)抗体间接ELISA检测方法,该研究首先克隆了MRP编码基因的部分片段,构建了重组表达质粒pET28a-mrp,并将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,获得了58 000的重组蛋白,经Ni柱纯化后,免疫印迹显示MRP重组蛋白能够被猪链球菌2型抗体特异性识别。以纯化的MRP重组蛋白作为包被抗原,建立了猪链球菌2型MRP抗体检测间接ELISA方法。该ELISA方法的包被抗原浓度为10μg/ml,待检血清1∶50稀释,检测临床48份未免疫猪链球菌2型疫苗健康猪的血清。当效价(S/P)≥0.22时,判定待检血清样品为阳性;当S/P<0.22时,判定待检血清样品为阴性。运用建立的方法能特异性识别猪链球菌2型抗体,人工感染猪的MRP抗体于攻毒后14～28 d出现峰值,同时提示临床健康猪群的免疫功能存在个体差异。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导上皮细胞融合和凋亡

猪链球菌 2型 (SS2 )溶菌酶释放蛋白 (MRP)的致病作用迄今不明 ,为此 ,以HEp 2细胞为上皮细胞体外模型 ,将纯化的MRP溶液和细胞共孵育 ,光镜观察 ,发现MRP可诱导细胞发生两种典型形态学变化 :一是诱导细胞融合形成多核巨细胞 ,随后巨细胞发生凋亡 ;二是诱导单个细胞凋亡。透射电镜观察和流式细胞分析确证MRP具有诱导上皮细胞凋亡的功能 ,凋亡率达 1 8%。证明MRP可单独作为SS2的毒力因子。

猪链球菌2型国内分离株毒力相关蛋白的分析

提纯猪链球菌 2型江苏分离株HA980 1的毒力相关蛋白溶菌酶释放蛋白 (muramini dase releasedprotein ,MRP)和胞外因子 (extracellularfacter,EF) ,制备其抗体供免疫转印之用。另提取猪源链球菌 1 7株国内分离株、1株德国分离株及 1株猪链球菌 2型人分离株的胞壁和胞外蛋白 ,经SDS PAGE ,与HA980 1株的MRP和EF的抗体作免疫转印。 1 1株MRP阳性 ,1 0株EF及EF 阳性 ,MRP及EF的分布存在 4种表型 :MPR+ EF+ (8 1 9) ,MRP+ EF (1 1 9) ,MRP+ EF- (1 1 9) ,MRP- EF- (1 0 1 9)。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白的黏附作用

为研究猪链球菌 2型 (SS2 )的毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)的黏附作用 ,进行了如下试验 :1 用黏附计数法比较菌株HA980 1(MRP+ )和SH0 0 6 4 4 4 (MRP-)的黏附动力学 ,两菌株均能黏附于HEp 2细胞 ,MRP+ 株的最大黏附菌数显著高于MRP+ 株 (P <0 0 5 ) 。 2 菌体置 5 6℃ 1h ,或用胰酶或半乳糖预处理 ,细菌黏附力完全丧失 ;分别用高碘酸、溶菌酶、秋水仙素和DNaseⅠ处理HEp 2细胞 ,前者可完全阻断HA980 1对它的黏附 ,后三者使黏附菌数显著下降。3 用纯化的MRP处理HEp 2细胞 ,或用抗MRP兔血清或MRP的单克隆抗体处理菌体 ,MRP+ 株的黏附菌数显著降低(P <0 0 5 ) ,但不能被完全抑制 ;用抗MRP-株全菌兔血清处理菌体 ,也能降低MRP+ 株的黏附菌数。 4 半乳糖或 5 6℃预处理MRP ,使其完全丧失对HA980 1的黏附抑制功能 ,但胰酶、过氧化氢和巯基乙醇的预处理没有明显的影响。结论 :MRP是SS2的一种黏附素 。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白功能性片段的原核表达及其免疫保护性

目的表达猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)的功能性片段(tmrp),并检测其对小鼠的免疫保护性。方法将构建的重组克隆载体pMD-tmrp经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,将切下的目的基因tmrp亚克隆至原核表达载体pGEX-3X中,转化E.coliBL21(DE3),鉴定正确后,用IPTG诱导,谷胱甘肽亲和层析纯化GST-tmrp,免疫BALB/c小鼠,测定其免疫保护率。结果阳性工程菌经IPTG诱导,表达了可溶性目的蛋白,相对分子质量约为73000。0.8mmol/LIPTG,37℃,pH7.2诱导4h,表达量最高,为25.36%。经亲和层析纯化,融合蛋白纯度达93.7%。免疫BALB/c小鼠后,免疫保护率可达60%。结论已成功获得了具有免疫活性的GST-tmrp。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导血管内皮细胞融合

猪链球菌2型(SS2)主要引起人和猪的脑膜炎,但其毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)对构成血脑屏障的微血管内皮细胞有何致病作用迄今不明。为此分离仔兔脾微血管内皮细胞(SMEC),纯化后用SV40-T 抗原转化后用作试验的细胞模型。将单层SMEC 和电泳纯MRP 溶液共孵育,染色后,光镜观察,发现MRP 可诱导SMEC发生两种典型形态学变化:致密细胞单层中出现巨大空洞而呈网状;空洞内有细胞融合,形成多核巨细胞,随后巨细胞核极度浓缩释出,巨细胞消失。研究结果表明, MRP 单独足以破坏大脑的血管内皮细胞屏障。

用单克隆抗体展示猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白在菌体表面的形态和分布

用猪链球菌 2型江苏分离株HA980 1全菌免疫Balb/c小鼠 ,取其脾细胞和Sp2 / 0细胞融合 ,以电泳纯溶菌酶释放蛋白 (MRP)为抗原 ,间接ELISA筛选MRP抗体阳性孔并用有限稀释法单克隆化 ,剔除与胞壁杂蛋白交叉反应阳性的克隆 ,获得 3株特异针对MRP的单克隆抗体细胞株 3A3、4D5和 6B4。将HA980 1和HEp 2细胞共孵育 ,使细菌粘附于细胞表面 ,用 3株MRP单克隆抗体联合介导FITC标记HA980 1菌体表面的MRP ,激光共聚焦显微观察 ,代表MRP的荧光图像显示 ,MRP是一线形表面大分子 ,一端锚定在细胞壁 ,另一端向空中伸展 ,其分布状态有单在和丛集

一种适合检测养殖场环境中链球菌的PCR检测方法

根据溶菌酶释放蛋白的编码序列特点设计引物,以建立养殖场环境中链球菌的PCR快速检测方法。结果在链球菌参考株都扩增到885 bp特异性目的片段,而肠毒素性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等均不能检出;10倍系列稀释结果显示,本方法敏感性可达到检测单个菌株;对处理环境样品时,能检测到4×103CFU/g的环境链球菌。该方法具有简单、快速、准确的特点,大大缩短了检测环境中致病性猪链球菌的时间。

含猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因片段的重组腺病毒构建与鉴定

目的构建猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)基因片段的重组腺病毒并对其进行鉴定。方法根据MRP的基因序列,设计合成1对引物,以SS2型基因组为模板,扩增MRP基因片段(467-1351)序列。将PCR产物通过pMD18-T载体克隆后,再连接至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-MRP,再经PmeⅠ酶切,然后转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞中,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-MRP。PacⅠ酶切线性化该重组腺病毒质粒,再转染AD-293细胞进行病毒包装,最后对细胞包装的病毒液进行PCR和Western blot法鉴定。结果重组腺病毒质粒pAdeno-CMV-MRP转染AD-293细胞8 d后出现明显的细胞病变,在培养细胞的上清病毒液中也检测到了MRP基因片段及其表达的蛋白。结论成功构建了SS2型MRP基因片段的重组腺病毒(rAdeno-MRP)。

CdSe/ZnS量子点探针用于检测猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)抗原的新方法研究

合成了高发光效率的CdSe/ZnS量子点并制备了CdSe/ZnS量子点-溶菌酶释放蛋白(MRP)抗体探针,利用凝胶电泳和分子光谱法研究了MRP抗体与CdSe/ZnS量子点的结合机理.荧光光谱法优化了CdSe/ZnS量子点-MRP抗体探针制备的影响因素,建立了一种测定MRP抗原的新方法,其线性范围为5.0×10-8～1.5×10-6mol/L,线性相关系数为0.9976,检测限为1.9×10-8mol/L.

四川资阳猪源猪链球菌病病原的分离与鉴定

目的四川省部分地区发生的不明原因的猪源人畜共患病病原菌的分离与鉴定。方法采用普通RT-PCR和实时荧光PCR相结合的方法对流感和尼帕病毒的RNA进行检测,在Vero细胞和SPF鸡胚同时进行病毒分离,用血清平板对病料进行细菌分离,同时用革兰染色、生化试验、血清凝集试验和PCR进行鉴定,并对分离到的细菌进行药敏试验。结果排除了流感病毒和尼帕病毒感染的可能性。从病料组织中成功分离到3株链球菌,证实为猪链球菌Ⅱ型。通过对其毒力因子进行鉴定,结果发现溶菌酶释放蛋白(MRP)和细胞外蛋白因子(EF)均为阳性。进一步的药敏试验证实:分离菌株对氨苄青霉素、先锋霉素Ⅵ、羧苄青霉素、复方新诺明、头孢呋肟等抗菌药高度敏感。结论病原为猪链球菌Ⅱ型。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白引起血小板聚集的机制研究

目的研究猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白（MRP）引起血小板聚集的作用机制，为猪链球菌临床救治提供科学依据与理论基础。方法镍柱亲和层析法纯化MRP-N、MRP-C蛋白，通过血小板聚集仪、血栓弹力图仪以及扫描电子显微镜观察MRP蛋白引起血小板聚集的情况。结果猪链球菌2型野生株可以引起血小板的聚集，而突变株ΔMRP则不能；MRP-N蛋白可以引起血小板的聚集，而MRP-C蛋白则不能；β2整合素受体抑制剂（GPRP）能显著抑制MRP引起的血小板聚集。结论MRP是猪链球菌2型引起血小板聚集的关键因子，MRP通过β2整合素受体途径引起血小板的聚集。