胚胎血管发育早期PDGF-BB对血管平滑肌细胞趋化的影响

目的:建立胚胎血管发育早期血管平滑肌细胞(VSMCs)趋化模型,并观察胚胎血管发育早期血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)对VSMCs趋化的影响。方法:采用转染平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下表达增强型绿色荧光蛋白(GFP)报告基因载体的胚胎干细胞制备拟胚体,然后接种于under-agarose凝胶作为平滑肌细胞趋化模型。用慢速视频显微摄像技术观察拟胚体分化后表达GFP的VSMCs,分析比较不同浓度PDGF-BB对VSMCs分化和移行的影响。结果:在under-agarose凝胶中,拟胚体在无外源性生长因子存在的条件下可自发向心肌细胞、内皮细胞和VSMCs分化。拟胚体贴壁分化20 d时,对照组及4种浓度PDGF-BB(5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L)组VSMCs的平均迁移速率分别为(94.07±23.80)μm/h、(118.08±31.63)μm/h、(173.53±24.58)μm/h、(380.74±39.56)μm/h和(335.62±32.16)μm/h,峰值浓度为20μg/L。经浓度大于10μg/LPDGF-BB处理后,VSMCs向PDGF-BB孔方向移行,对照组、低浓度PDGF-BB组VSMCs呈不规则性迁移。结论:该模型能够模拟胚胎血管发育早期全过程,可用于研究不同生长因子对VSMCs趋化的影响。外源性PDGF-BB能定向诱导胚胎血管发育早期VSMCs迁移,其定向趋化作用在一定浓度范围内呈量效关系。

当归补血汤协同肌源性干细胞移植对小鼠胸腺Notch4、Delta4和Hes5的影响

目的：研究当归补血汤（Danggui Buxue Decoction,DBD）协同肌源性干细胞（Muscle-derived stem cells,MDSCs）移植对小鼠胸腺Notch4、Delta4和Hes5基因mRNA的影响。方法：将150只雌性昆明小鼠按照随机数字表随机分成照射模型组、骨髓移植组、MDSCs移植组、不同剂量（1、3和5倍）DBD预处理＋MDSCs移植组。各组分别于照射前给予生理盐水或不同剂量DBD灌胃1周。经射线8Gy（137）Cs-γ照射后,在小鼠尾静脉移植骨髓细胞或MDSCs。运用real-time PCR检测3周和8周末时小鼠胸腺中Notch4、Delta4和Hes5mRNA表达。结果：移植3周末,与模型组相比,各给药组Notch4、Delta4mRNA及给药2组Hes5mRNA表达上调,给药1组和给药3组的Hes5mRNA表达下调,骨髓移植组和MDSCs移植组Delta4mRNA表达下调,Hes5mRNA表达上调,骨髓移植组Notch4mRNA表达下调,MDSCs移植组Notch4mRNA表达上调,且组间具有统计学差异（Notch4,F=18.556,P=0.000;Delta4,F=5.635,P=0.007;Hes5,F=4.771,P=0.012）。移植八周末,与模型组相比,各给药组Delta4、Hes5mRNA及给药3组Notch4mRNA表达上调,给药1组和给药2组的Notch4mRNA表达下调,骨髓移植组和MDSCs移植组Notch4mRNA表达下调,Hes5mRNA表达上调,骨髓移植组Delta4mRNA表达下调,MDSCs移植组Delta4mRNA表达上调,且组间具有统计学差异（Notch4,F=19.057,P=0.000;Delta4,F=8.116,P=0.010;Hes5,F=4.545,P=0.015）。结论：Notch4、Delta4和Hes5在骨髓移植、MDSCs移植和DBD协同MDSCs移植中对T淋巴细胞分化和发育的作用相同,3倍剂量当归补血汤可通过Notch4和Delta4,并作用于下游靶基因Hes5来促进MDSCs向T细胞分化发育。

共培养条件下大脑皮层神经元诱导肌源性干细胞成神经元样细胞

目的：研究使用共培养系统将肌源性干细胞（MDSCs）诱导为神经元样细胞的可行性及机制.方法：分离新生SD大鼠的MDSCs及皮层神经元,以叔丁基过氧化氢（终浓度为200μmol/L）损伤神经元,构建氧化应激损伤的神经元模型.当MDSCs差速贴壁至第5代时,将其随机分为MDSCs和损伤的神经元置于共培养系统中培养（损伤组）、MDSCs和正常神经元共培养（未损伤组）以及MDSCs置于共培养系统中单独培养（MDSCs组）,培养7d后用神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学法鉴定诱导的结果,并用大鼠脑源性神经营养因子（BDNF） ELISA试剂盒检测不同时间点各组培养液中该因子的分泌情况.结果：共培养7d后检测到损伤组与未损伤组均有部分MDSCs分化为表达NSE的神经元样细胞,前者分化率高于后者,MDSCs组未见有细胞分化为神经元样细胞.第2天损伤组BDNF的分泌量高于未损伤组,同时,损伤组第2天BDNF的分泌量高于第4天和第6天的分泌量.在不同时间点损伤组与未损伤组培养液中BDNF的分泌量均高于MDSCs组.结论：在共培养条件下,大鼠皮层神经元可诱导MDSCs为神经元样细胞,这与神经元分泌的BDNF有着重要联系,MDSCs也可分泌BDNF.

三维环境下肌源性干细胞分化为胰岛样细胞团

目的：运用三维细胞培养模型研究细胞外微环境对肌源性干细胞分化为胰岛样细胞的作用。方法：用差速贴壁的方法对SD大鼠肌源性干细胞进行分离和培养,将细胞分为胶原支架化学诱导剂组,化学诱导剂组,空白组。分别观察诱导后细胞的生长形态,采用双巯腙DTZ染色鉴定胰岛素分泌细胞,细胞免疫化学检测胰岛相关蛋白,RTPCR方法检测诱导后细胞的相关基因表达情况,葡萄糖刺激实验检测胰岛样细胞成熟度。结果：在普通光镜下,胶原支架化学诱导剂组中诱导的胰岛样细胞团体积比化学诱导剂组大得多;双巯腙DTZ染色结果显示胶原支架化学诱导剂组比化学诱导剂组能诱导更多的胰岛样细胞;细胞免疫化学检测胶原支架化学诱导剂组诱导的胰岛样细胞更类似于成年大鼠胰岛组织;RTPCR方法检测胶原支架化学诱导剂组表达胰岛相关基因比化学诱导剂组高。结论：三维环境下肌源性干细胞可诱导分化为胰岛样细胞,并且大鼠肌源性细胞可大量快速分化为更成熟的胰岛样细胞。

绵羊胚胎肌源性干细胞的生物学特性

为研究绵羊胚胎肌源性干细胞的生物学特性,取30日龄的绵羊胚胎,采用联合酶消化法及差速贴壁法分离培养获得均质的肌源性干细胞,并对其进行一系列生物学特性检测。结果显示,绵羊肌源性干细胞能传代培养至35代以上;免疫荧光染色和RT-PCR鉴定肌源性干细胞表面标记物Sca-1、CD34、CD144和Desmin呈阳性表达;生长曲线和细胞周期结果显示绵羊肌源性干细胞具有较强自我更新能力;通过不同的诱导方法可以将肌源性干细胞成功地诱导为肝样细胞和胰岛样细胞,Schiff染色和双硫腙染色均呈阳性,RT-PCR检测肝样细胞特异性标记物AFP和ALB以及胰岛样细胞特异性标记物Insulin均呈阳性表达,进一步证明了其诱导分化潜能。结果表明,本试验成功地分离培养获得了均质并具有较强自我更新潜能的绵羊肌源性干细胞,这种干细胞具有向肝样细胞和胰岛样细胞分化的潜能,这为临床治疗提供了潜在的理论基础和大量的种子细胞。