BSA-Seq结合RNA-Seq技术挖掘大豆叶片提前黄化衰老基因

大豆产量与其生殖生长的持续时间呈正相关,延缓其开花后叶片的衰老,提高其生理功能,有利于增加植物的粒重。叶片黄化是植物衰老的显著特征之一。关于在大豆鼓粒后期叶片黄化的研究鲜见报道。本研究对鼓粒后期叶片提前黄化突变体ly和野生型ofc杂交组合进行遗传分析,结果表明,大豆鼓粒后期叶片提前黄化性状受单隐性核基因控制。通过BSA-Seq在19号染色体得到一个2.23Mb的初定位区间,经开发标记图位克隆后将区间缩短至1.75 Mb,区间内有219个基因,再结合RNA-Seq分析,得到了区间内12个候选基因,其中有4个SNP变异基因和8个差异表达基因。本研究结果为大豆鼓粒后期叶片黄化衰老基因的克隆奠定了基础。

水稻白化转绿突变体wrg20的鉴定与基因克隆

为探讨水稻叶绿体发育的分子机制,通过对粳稻日本晴进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变,获得一个稳定遗传的叶色白化突变体wrg20(white turn green 20),并对其进行表型鉴定、基因定位和功能分析。与野生型(WT)相比,该突变体于30℃培养时在三叶期之前完全白化,26℃时突变体白化叶片部分返绿。遗传分析结果表明,该突变性状受单隐性核基因控制。将该突变体与籼稻93-11杂交,构建F2分离群体并进行基因定位,将该基因定位于2号染色体198 kb区间内,通过测序发现LOC_Os02g33610存在由G至A单碱基替换,导致编码的天冬氨酸转化为天冬酰胺,表明该基因可能为OsWRG20的候选基因,与先前所报道的调控叶绿体发育的基因GRY79为等位基因。对该基因进行结构和功能分析,表明OsWRG20可能是调控水稻苗期幼叶生长发育的重要基因。与野生型相比,突变体的叶绿体基因内含子剪接效率降低,由此推断OsWRG20可能通过调控叶绿体RNA的剪接,参与调控水稻苗期叶绿体的发育。本研究结果为苗期水稻叶绿体发育研究提供了新的理论基础。

一份新的玉米永久性失绿突变体chs10的鉴定及基因克隆

【目的】利用60Co-γ射线处理自交系齐319获得了一份新的玉米叶色突变体,对该突变体进行遗传分析、基因定位与克隆,并对候选基因的功能进行初步分析。【方法】以该突变体为亲本,构建遗传分析群体和基因定位群体;通过图位克隆技术获得关键候选基因;利用生物信息学方法分析关键候选基因的结构和进化关系;通过qRT-PCR技术检测候选基因在不同组织中的表达差异;同时运用烟草瞬时表达技术对候选基因进行亚细胞定位表达分析。【结果】鉴定了一份玉米永久性失绿突变体chs10(Permanent chlorosis 10),chs10自V2时期开始,叶片从幼苗基部到顶部逐渐由绿转黄,后期的生长发育过程中不再复绿,并且,整个植株包括叶鞘、叶环、茎秆、苞叶和雄穗也均为黄色。该突变体受一对隐性核基因控制,可稳定遗传,植株生长发育正常,可正常授粉结实。突变基因被定位于玉米第10染色体长臂标记SNP-2和SNP-3之间约0.17 Mb范围内,确定了关键候选基因Zm00001d025860,qRT-PCR结果显示Zm00001d025860在玉米根、茎、叶和叶鞘中均有表达,但在叶片中高表达,亚细胞定位结果显示目标蛋白被定位在细胞膜和叶绿体中。利用STRING预测发现Zm00001d025860与卟啉结合蛋白GUN4基因互作,GUN4与叶绿素合成中的镁离子螯合酶(MgCh)具有反馈调节作用。【结论】Zm00001d025860基因的突变导致突变体chs10叶色的改变,并且Zm00001d025860可能通过参与叶绿素合成途径来调控叶色变化。突变体chs10的发现一方面丰富了玉米叶色突变体研究的基因资源,同时为解析镁离子螯合酶在叶绿素合成途径中的作用机理奠定了材料基础。

玉米籽粒突变体crk4的基因克隆与等位性分析

籽粒突变体是克隆籽粒发育关键基因并解析其遗传调控机制的重要材料。crk4(crumpled kernel 4)是育种选系过程中发现的籽粒突变体,与野生型相比,其籽粒灌浆差、粒重和发芽率显著降低。遗传分析表明该突变由单个隐性核基因控制,图位克隆将该基因定位于玉米5号染色体614 kb的物理区间内,该区间包含11个在籽粒中表达的蛋白编码基因。序列分析表明,Zm00001d017427基因的第2个外显子上存在一个由C碱基缺失造成的crk4特异的终止突变。Zm00001d017427编码金属-烟酰胺转运蛋白(Metal-nicotianamine transporter,Sh4-shrunken4/YSL2),是已报道的籽粒突变体ysl2的等位基因。等位性测验结果表明,crk4是sh4/ysl2的一个新的等位突变体。crk4的鉴定为阐明Sh4基因调控玉米籽粒发育的分子机制提供了新的种质资源。

基于荧光标记双向筛选的拟南芥CRISPR基因编辑突变体库构建

突变体库是研究基因功能的重要工具。拟南芥种质资源库(ABRC)储藏了几乎涵盖所有基因的突变体材料,其中T-DNA插入突变体占绝大多数。然而,当在T-DNA插入突变体中进行遗传转化或与其他转基因报告系统进行杂交时容易引起转基因沉默,阻碍了相关研究的开展,甚至产生错误结论。甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate,EMS)诱变和快中子诱变技术可获得非转基因突变体,但这两种方法均为随机诱变技术,需要通过基因定位来确认突变位点,无法实现基因靶向敲除。CRISPR/Cas9可以对目的基因进行靶向编辑,获得不携带转基因的突变体。拟南芥中尚无利用CRISPR/Cas9进行高通量突变体库构建的报道。本研究共设计900条sgRNAs靶向300个RNA通路相关基因,通过合成sgRNA混池文库、引入DsRed2荧光筛选标记、将DNA条形码和二代测序技术相结合,实现了对转基因阳性苗的高通量鉴定和分型,并对T2代具有发育缺陷的无荧光植株进行负向筛选,成功鉴定到了不含转基因的smd3-b和rlua4突变体。

拟南芥室内简易栽培和田间大规模种植的方法

采用菜园土、草木灰、锯木屑体积比为4∶2∶1的培养基质,用1g·L-1琼脂水悬浮种子直播培养拟南芥,根据其生物学特性在温度、空气相对湿度、土壤水分、光照以及病虫害防治等方面进行管理,培养出生长健壮、充分满足实验要求的拟南芥植株.用同样基质,适当遮荫,可以在田间大规模种植拟南芥.在月均温为11-14℃,日最低气温为2.1-4.7℃的自然条件下,夜间覆盖塑料薄膜,拟南芥仍能正常生长.

几种定向进化技术的比较及文库构建策略

蛋白质定向进化在蛋白质工程中取得了令人瞩目的成就 ,其核心技术———随机突变库构建技术已成为近年来体外定向进化研究的热点。在概述定向进化基本原理基础上 ,对几种随机突变技术进行了介绍、分类和比较 。

拟南芥雄性不育突变体ms1502的遗传及定位分析

通过EMS诱变、背景纯化与遗传分析,从拟南芥(Arabidopsisthaliana)中筛选到了一棵隐性单基因控制的雄性不育突变体ms1502。细胞学观察发现,突变体在小孢子从四分体释放出后花药绒毡层过早衰亡,小孢子的内容物不正常地凝聚,最终无法形成正常的花粉粒。利用图位克隆的方法对该基因MS1502进行了定位,结果表明MS1502位于第4条染色体上分子标记F25I24和T12H20之间105kb区间内。目前该区间内尚未见到花药发育必需基因(不育基因)的报道,因此MS1502是一个控制花粉发育的新基因。

水稻黄绿叶突变体djyg的遗传分析与基因定位

在粳稻品种Dongjin大田种植过程中,发现一个黄绿叶自然突变体,命名为djyg。该突变体在苗期表现明显的黄绿叶表型,抽穗以后,叶色逐渐恢复正常。叶绿素含量测定结果表明,在苗期、分蘖盛期及抽穗期叶绿素b的含量分别下降53%、62%、36%。电镜结果表明,分蘖期突变体中基粒、类囊体垛堆凌乱、排列疏松,类囊体基质较为稀薄。qRT-PCR结果证实,PORA、Cab1R、PsbA的表达量在突变体中均较野生型明显下调。遗传分析结果表明,黄绿叶突变体djyg由一对隐性主效核基因控制,图位克隆确定该候选基因为编码叶绿素合成酶基因YGL1的一个新等位基因。该突变体未影响植株的主要农艺性状,可作为一个理想的表型标记应用于杂交稻育种工作中。

功能化纳米金增强的DNA电化学检测和序列分析

用冠以大量二茂铁的纳米金微粒 /抗生蛋白链菌素结合物为标记物 ,将其标记于生物素修饰的寡聚核苷酸片段上 ,制成了具有电化学活性和纳米金放大作用的DNA电化学生物传感器 .首先采用巯基DNA和巯基烷烃混合自组装膜制备了金修饰电极 ,将探针DNA分子固定在了电极表面 ,运用杂交原则结合靶点分子在电极表面形成了双螺旋的DNA链 ,然后借助抗生蛋白链菌素和生物素之间的强亲和作用 ,引入了功能化的纳米金 .通过伏安法测定了修饰在纳米金上的二茂铁的氧化还原电流 ,可以识别和测定溶液中互补的靶点DNA ,17 mer靶点DNA的浓度在 0 .0 0 1～ 10nmol/L范围内有线性关系 ,检测限可达 0 .75× 10 -12 mol/L .

一个水稻“斑马叶”叶色突变体基因zebra leaf2(zl2)的图位克隆

从粳稻品种Asominori组培后代中获得一个稳定遗传的黄绿相间叶色突变体(zebra leaf 2,zl2)。该突变体在苗期表现为黄绿相间的斑马状,分蘖后期斑马叶性状逐渐减弱,到抽穗期叶片逐渐变为淡黄色。与野生型相比,zl2在3叶期、分蘖盛期、抽穗期及成熟期叶片的叶绿素、类胡萝卜素含量显著降低,成熟后其结实率、千粒重、株高也显著下降。电镜观察结果显示,苗期zl2叶片黄色部分叶肉细胞中叶绿体显微结构发生了明显的异常,而绿色部分与野生型基本一致。遗传分析结果表明,zl2突变性状受一对隐性核基因控制。从zl2与籼稻品种南京11衍生的F2群体中挑选1607株表现为突变性状的分离单株,最终将该突变基因定位于第11染色体约164.3kb的区域内。基因预测表明该区域内存在13个ORFs,其中ORF12编码一个类胡萝卜素异构酶,序列分析表明突变体中的该基因第10个内含子与第11外显子的交界处碱基A突变为T,导致cDNA发生错误剪切,缺失4个碱基,产生移码突变,并于第395个氨基酸处提前终止。RT-PCR分析表明,相对野生型在突变体中ZL2的表达量显著下降,同时叶色相关基因PORA、RbcL、RbcS、Cab1、Cab2、psaA、psbA、OsDVR表达量也显著下降,而HEMA1、YGL1、V1、V2、SPP、OsPPR的表达量显著上升。结果表明ZL2在水稻叶绿素合成及叶绿体发育中起着重要作用。

拟南芥MeIAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析

生长素是最重要的植物激素之一,参与了植物生长发育的各个方面。植物体内游离的IAA是生长素的主要活性形式,在IAA甲基转移酶1(IAMT1)的作用下,IAA可以转变为IAA甲酯(MeIAA)。MeIAA本身没有活性,在植物体内的MeIAA酯解酶作用下可以重新转变为IAA。MeIAA是非极性分子,能够在植物体内自由扩散。利用MeIAA的这种特殊性质筛选突变体,可以分离到MeIAA代谢途径或者IAA途径中新的成分。我们对拟南芥种子进行EMS诱变,通过观察黑暗下下胚轴的生长情况,筛选MeIAA的抗性突变体。我们成功分离到了8株可能的抗性突变体,并对其中的一个Methyl-IAA resistant1(mir1)突变体进行了深入分析。MeIAA抗性突变体的筛选将为进一步了解MeIAA的代谢、IAA稳态调控和响应机理提供新的材料。

水稻着丝粒附近一个淡绿叶突变相关基因的定位分析

在T-DNA插入水稻突变体库中,发现了一个以日本晴为遗传背景的温度钝感型淡绿叶突变体pgl2(palegreen leaf 2)。遗传学分析表明该突变性状由1对单隐性核基因控制。利用突变体与籼稻品种龙特甫杂交,构建F2群体对突变基因进行精细定位。初步定位结果显示目的基因与第8染色体上SSR标记RM331连锁,在该标记附近发展了14对INDEL标记,将突变基因进一步定位于着丝粒上2.37 Mb的区间,并对该区间候选基因进行了分析。突变体叶绿素的总量与对照相仿,但是叶绿素a/b比值趋于1,明显低于对照。推测突变基因可能与叶绿素a、b间的转化有关。还就着丝粒中基因定位的引物设计方法进行了讨论。

基于变异分析和集合进化的测试用例生成方法

变异分析能够辅助生成有效的测试用例集,然而,高昂的测试代价,严重影响了这一技术在实际软件测试中的广泛应用.文中基于弱变异分析,研究求解测试用例生成问题的新方法,以高效地生成具有很高缺陷检测能力的测试用例集.该方法首先利用变异前后的语句,构造变异分支,并将所有变异分支集成到原程序,形成新的被测程序;然后,以测试用例集作为决策变量,根据该测试用例集对变异分支的覆盖信息,构造目标函数,建立新的测试用例生成问题的数学模型;最后,采用集合进化优化方法求解上述模型时,设计具有针对性的适应度函数和进化策略,使得一次求解该模型,生成杀死所有变异体的测试用例.将所提方法应用于13个基准和工业程序的测试,并与传统的遗传算法进行了比较.实验结果表明,所提方法能够高效地生成测试用例,且生成的测试用例具有更高的缺陷检测能力.

一个矮秆多分蘖突变体的遗传分析和定位

从粳稻品种‘中花11’转基因后代中发现了一个矮秆多分蘖突变体,突变体表现出植株矮化、分蘖力强、穗长变短、叶片变窄及结实率降低等一系列突变表型。遗传分析表明该矮秆多分蘖突变体表型受一对隐性核基因控制,因其与突变体htd1具有相类似的表型,故将该基因命名为htd2。利用籼粳杂交F2群体将突变基因定位在第3染色体短臂上SSR标记RM6038和RM5444之间,与两个标记的遗传距离分别为1.4和2.1cM,两个标记之间的物理距离大约为400kb。

一个水稻黄绿叶突变性状的遗传分析及基因定位

通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变晚粳稻品种秀水09,获得了1个稳定遗传的全生育期黄绿叶突变体Ygl,遗传分析表明该突变性状由1对隐性核基因控制。利用突变体与籼稻品种珍汕97杂交,构建F2群体对突变基因进行定位,发现目的基因与第11号染色体上的SSR标记RM2459连锁,在该标记附近发展了14对InDel标记,将突变基因定位在约82kb区间内。通过在线最新水稻注释系统的基因功能预测分析,寻找候选基因,经测序发现突变体发生单碱基突变。

调控拟南芥花粉发育突变体zy1511的基因定位及特征分析(英文)

为了进一步研究花药花粉发育过程,我们通过EMS诱变,筛选到拟南芥雄性不育突变体zy1511。遗传分析表明,zy1511为隐性单位点突变。细胞学观察表明．突变体花药中小孢子从四分体释放出后绒毡层并没有开始退化,花药发育后期绒毡层依然部分存在。说明突变体花药绒毡层退化比野生型的要迟,因此,小孢子不能发育成正常花粉粒。利用图位克隆的方法将zv1511定位于第一条染色体上分子标记F25P12和T8L23之间134．kb的区间内。本项工作为zy1511基因的克隆及对花粉发育功能分析奠定了基础。目前尚未见到该区间内雄性不育基因的报道。因此,zy1511是控制花粉发育的尚未发现的关键基因。

颅底脊索瘤中突变型p53相关的临床和细胞水平研究

目的探讨突变型p53在颅底脊索瘤中的表达与患者预后及临床特点的关联,并在细胞层面验证突变型p53在颅底脊索瘤中的功能。方法纳入2005年1月—2014年12月在首都医科大学附属北京天坛医院接受手术治疗的颅底脊索瘤患者49例,应用石蜡切片进行免疫组织化学染色,分析突变型p53表达与颅底脊索瘤患者预后及临床特点的关系。应用siRNA敲降脊索瘤细胞系UCH-1中的p53基因,分析敲降前后细胞功能的变化。结果在蛋白水平,突变型p53表达水平是肿瘤术后进展的风险因素,随突变型p53表达水平升高,肿瘤进展风险增加(OR:1.040,95%CI:1.007~1.073,P=0.016);另外,骨质浸润型肿瘤较非浸润型中突变型p53表达升高(t=3.319,P=0.002),质地硬的较质地软的肿瘤突变型p53表达升高(t=-3.503,P=0.001),血供丰富型较不丰富型肿瘤突变型p53表达升高(t=2.081,P=0.043)。细胞水平,与对照组相比,p53敲降组的细胞活力在不同时间点间有差异(F=305.715,P=0.000);p53敲降组细胞凋亡率低于对照组(t=-3.961,P=0.017);与对照组相比,p53敲降组在第6(t=-5.232,P=0.014)、12(t=4.778,P=0.017)及24(t=-9.303,P=0.003)小时穿透至下室的肿瘤细胞均增多。结论颅底脊索瘤中突变型p53表达升高可导致术后肿瘤进展风险增加,其表达与肿瘤质地、侵袭性和血供情况相关;突变型p53表达受抑制后脊索瘤细胞增殖和侵袭能力提高,凋亡减少。

水稻穗形态建成基因PMM1的遗传分析与初步定位

在水稻粳稻品种中花11T-DNA插入突变体库中鉴定了3个穗形态突变体,它们均表现为植株半矮、叶夹角变小、一次枝梗轮生、复粒、粒长变短、粒宽变宽等突变表型。基因双突变杂交F1表型考查证明这3个突变体为等位突变体,T-DNA标签共分离检测表明这3个突变体的表型与T-DNA插入无关。通过与籼稻品种珍汕97配置3个杂交组合,由经典的孟德尔遗传分离比显示,突变性状受1对隐性基因(panicle morphological mutant 1,PMM1)控制。采用基因图位克隆的方法,已将基因PMM1定位在第4染色体长臂上的RM3866-1和X4(InDel)标记之间,其两侧物理图距为147kb左右。

水稻株型突变体rad-1和rad-2的鉴定与功能基因克隆

株型是决定水稻等作物产量的核心因素之一,是品种选育的重要指标。本研究从粳稻品种Asominori的辐射诱变中分离出2个稳定的株型突变体,rad-1和rad-2,它们均表现出苗期弯曲生长、成熟期株高矮化、粒长变短、千粒重降低和产量下降等特征。等位性测验结合连锁分析证实rad-1和rad-2等位,且位于水稻第7染色体上约230kb的范围内。对定位区段的序列分析后确定OsFH5为候选基因,该基因呈现组成型表达,编码水稻Ⅱ型成蛋白。突变体rad-1在OsFH5基因第2个外显子上缺失8个碱基,导致移码;而rad-2则在第14内含子上发生单碱基的变异,发生异常剪切。两类突变最终均导致OsFH5基因翻译提前终止,产生截短的蛋白。相比野生型,rad-1和rad-2在幼苗中OsFH5基因的表达下调。细胞学研究表明,OsFH5基因的功能缺失会导致幼苗叶鞘细胞大小不均,呈现不规则生长,在成熟的颖壳中细胞显著变短。对生长素响应的ARF因子进行表达量检测发现,rad-2中一系列ARF成员表达均显著下调,推测OsFH5极有可能影响了植株对生长素的响应。